Protocolo Aislamiento eficiente para B y linfocitos T a partir Humanos Palatine amígdalas

Resumen

Las amígdalas palatinas son una rica fuente de linfocitos B y T. Aquí proporcionamos un protocolo fácil, eficaz y rápido para aislar linfocitos B y T de amígdalas palatinas humanas. El método descrito ha sido adaptado específicamente para los estudios de la etiología viral de la inflamación de las amígdalas conocida como amigdalitis.

Resumen

Las amígdalas forman parte del sistema inmunológico proporcionando la primera línea de defensa contra los patógenos inhalados. Por lo general, el término "amígdalas" se refiere a las amígdalas palatinas situadas en las paredes laterales de la parte oral de la faringe. Las amígdalas palatinas extirpadas quirúrgicamente proporcionan una fuente conveniente y accesible de linfocitos B y T para estudiar la interacción entre patógenos extraños y el sistema inmunitario del huésped. Este protocolo de video describe la disección y el procesamiento de las amígdalas palatinas humanas extirpadas quirúrgicamente, seguidas del aislamiento de las poblaciones individuales de células B y T de la misma muestra de tejido. Presentamos un método que separa eficientemente los linfocitos amigdalinos B y T utilizando un protocolo de afinidad dependiente de anticuerpos. Además, utilizamos el método para demostrar que el adenovirus humano infecta específicamente la fracción de células T amigdalinas. El protocolo establecido es generalmente aplicable para aislar de manera eficiente y rápida las poblaciones de células B y T de las amígdalas para estudiar el papel de diferentes tipos de patógenos en las respuestas inmunitarias amigdalinas.

Introducción

Las amígdalas son colecciones de tejidos linfoides incompletamente encapsulados que se encuentran debajo y en contacto con el epitelio en el tracto aerodigestivo superior. Por lo general, el término "amígdalas" se refiere a las amígdalas palatinas situadas en las paredes laterales de la parte oral de la faringe. Las amígdalas palatinas pareadas junto con la amígdala nasofaríngea (adenoides), las amígdalas tubáricas pareadas y las amígdalas linguales constituyen el llamado "anillo de Waldeyer". Este último es responsable del contacto inicial entre los patógenos inhalados o ingeridos y los tejidos linfoides del tracto aerodigestivo^1,2. De hecho, numerosos informes han demostrado que tanto los antígenos bacterianos como los virales pueden detectarse en muestras de tejido de amígdalas palatinas^2-6.

Las amígdalas palatinas están compuestas por un denso tejido linfoide cubierto por un epitelio escamoso estratificado que no queratiniza. Las amígdalas tienen numerosas criptas, invaginaciones epiteliales, que penetran en el parénquima aumentando la superficie. Desde el punto de vista histológico, las amígdalas palatinas contienen numerosos folículos linfoides con centros germinales, que son los sitios de maduración y diferenciación de las células B (áreas de células B). Asimismo, las amígdalas palatinas engloban a las células T, que se localizan principalmente en las regiones extrafoliculares (áreas de células T). Además de las células B y T, también se pueden detectar varias células dendríticas foliculares en las amígdalas palatinas^1,2.

Debido a su ubicación anatómica, las amígdalas palatinas son fácilmente accesibles mediante intervenciones quirúrgicas. Por ejemplo, la extirpación quirúrgica de las amígdalas, conocida como amigdalectomía, se lleva a cabo de forma rutinaria en todo el mundo⁷. En los niños con hiperplasia amigdalar, a veces se utiliza una extirpación quirúrgica parcial de las amígdalas (amigdalomamía), lo que causa menos dolor postoperatorio a los pacientes. Teniendo en cuenta la acumulación de diversos patógenos en las amígdalas, las amígdalas extirpadas quirúrgicamente brindan una oportunidad única para estudiar la influencia de los agentes virales y bacterianos en las funciones de los linfocitos amigdalinos^2,8. Además, es posible estudiar si algunos patógenos prefieren residir en subpoblaciones celulares específicas⁹. Además, dado que las amígdalas son una fuente rica en linfocitos B, los linfocitos B amigdalinos aislados pueden utilizarse eficazmente para estudiar la actividad de diferentes subpoblaciones de células B¹⁰. Sin embargo, como las amígdalas palatinas contienen una mezcla de tipos de células, se necesita un método eficiente para separar las diferentes subpoblaciones celulares.

Aquí, describimos un método simple para el aislamiento eficiente y rápido de poblaciones de células amigdalares B y T de amígdalas palatinas humanas mediante el uso de una técnica de separación de células activadas magnéticamente (Figura 1). El método descrito aquí es útil para los científicos que desean evaluar el papel de diferentes agentes infecciosos en los órganos linfoides humanos, como las amígdalas palatinas.

Protocolo

El protocolo describe el aislamiento de células linfoides de material de paciente humano y por lo tanto requiere una aprobación ética. El trabajo realizado en el presente estudio fue concedida por el Comité de Revisión Ética de Uppsala (. Dnr 2013/387).

1. Aislamiento de células mononucleares (CMN) desde Humanos Palatine amígdalas

PRECAUCIÓN: Todo el material no apantallado de origen humano como la sangre, tejidos o fluidos corporales debe considerarse como material potencialmente infectado. Por lo tanto, se deben seguir las prácticas de bioseguridad recomendadas para el manejo de los tejidos humanos.

Nota: Para evitar la contaminación, todas las soluciones y equipos de cultivo de células deben ser estériles. Todos los tampones y soluciones deben ser pre-enfriados y se mantuvieron en hielo. Tejidos de amígdalas y células aisladas se deben mantener y manipulados en hielo.

1. Obtener amígdalas frescos de los pacientes sometidos a amigdalectomía o amigdalotomía (Figura 2). Sumérgete la Clum tejidops en un tubo de centrífuga de 50 ml lleno de solución salina enfriada con hielo estéril Hanks equilibrada (HBSS) suplementado con suero bovino fetal 5% (FBS), mM glutamina 10, 0,05 mg / ml de gentamicina y 1% mezcla de antibiótico-antimicótico (penicilina, La estreptomicina y anfotericina B).
2. Mantenga los tubos con las muestras de tejido de las amígdalas sumergidas en todo momento en el hielo. Trate de procesar las amígdalas tan pronto como sea posible, y no más tarde de 3 horas después de la extirpación quirúrgica.
3. Coloque la amígdala en una placa de cultivo celular de plástico de 60 mm en el hielo y mantener el tejido humedecido con HBSS. Retire los coágulos sanguíneos visibles, grasa y tejido conectivo con un limpio fórceps de la superficie de las amígdalas.
4. Utilice una nueva placa de cultivo celular de 60 mm que contiene 5 ml de HBSS. Cortar el grupo tejido de las amígdalas en fragmentos 3-10 mm utilizando un par de tijeras estériles y / o un escalpelo.
5. Prepare una nueva placa de cultivo celular de 60 mm que contiene 10 ml de HBSS y colocar un filtro de células de plástico de 100 micras en la solución de HBSS.
6. Transfiera los dissfragmentos de amígdalas ejadas en el filtro de células con unas pinzas esterilizadas. Usando el extremo del émbolo de una jeringa de plástico, sin problemas exprimir los fragmentos de tejido a través del filtro de células. Asegúrese de que los fragmentos de amígdalas están totalmente inmersos en la HBSS.
7. Desechar el filtro de células con los restos de tejido y transferir la suspensión de células resultante de la placa de cultivo celular 60 mm en un tubo de centrífuga de plástico de 50 ml. Deje el tubo en hielo mientras se procede con los pasos 1,8 y 1,9.
8. En el caso de grandes amígdalas, de más de 2 cm de tamaño (Figura 2), apretar los fragmentos de la amígdala en dos coladores celulares para evitar la obstrucción de la malla en el colador.
9. Obtener el volumen final de 35 ml de la suspensión celular.
   Nota: En este paso es posible preparar la suspensión de células para la crioconservación (ver sección 2).
10. Añadir 10 ml de solución de gradiente de densidad de Ficoll como en un nuevo tubo de centrífuga de 50 ml. Superponer suavemente los suspens celularesion (paso 1.9) en la parte superior de la solución de gradiente de densidad. Evitar la mezcla de la suspensión de células y la solución por gradiente de densidad.
    Nota: La solución de gradiente de densidad tiene que ser calentado a la temperatura ambiente.
11. Centrifugar la suspensión de células en un rotor oscilante a cabo a 700 xg durante 20 min a TA. No active la función de freno de la centrífuga como el frenado rápido puede perturbar el gradiente. Asimismo, el uso de la función de aceleración más bajo disponible en la centrífuga.
    Nota: Después de este paso de centrifugación, observe MNCs como una capa esponjoso blanco en la interfase, y los glóbulos rojos (GR), los fibroblastos y los restos celulares como el sedimento en el fondo del tubo.
12. Recoger cuidadosamente la capa multinacionales utilizando una pipeta de 10 ml. Coloque la suspensión de células en un nuevo tubo de centrífuga de 50 ml.
13. Añadir 25 ml de helado de PBS a la suspensión celular y hacer girar el tubo a 300 xg durante 5 min en un rotor basculante a 4 ° C.
14. Eliminar el sobrenadante usando una pipeta de 25 mly repetir sedimento celular lavado paso dos veces más. Finalmente resuspender el botón celular en 15 ml de PBS.
    Nota: Después de la etapa de lavado final, es posible criopreservar la suspensión de células (véase la sección 2).
15. Aplicar 10 l de suspensión celular en la celda hemocitómetro cámara de recuento y contar el número de células bajo un microscopio. Dispensar la cantidad apropiada de células (por ejemplo, 2-3 de ⁷ x 10) en un tubo de centrífuga de 15 ml para la posterior separación de perlas magnéticas. Mantenga esta alícuota en hielo hasta el paso 3.2.

2. La criopreservación de células amigdalares

1. Preparar medio de congelación (90% de SFB y 10% DMSO) y mantenerlo en hielo. Para el almacenamiento a largo plazo mantener a los medios de congelación a -20 ° C.
2. Determinar el número total de células utilizando una cámara de recuento celular hemocitómetro (paso 1,15). Calcular la cantidad necesaria de medio de congelación de acuerdo con la densidad celular congelado deseado (por ejemplo, 10 ⁷ célulass / ml de medio de congelación).
3. Centrifugar la suspensión de células a 300 xg durante 5 min. Decantar el sobrenadante sin alterar el sedimento celular y resuspender el sedimento celular en medio de congelación enfriado con hielo (del paso 2.1).
4. Dispensar alícuotas de 1 ml de la suspensión celular en viales estériles diseñados para almacenamiento a largo plazo en nitrógeno líquido. Congele los viales en una cámara de isopropanol y almacenar a -80 ° CO / N. Para la conservación a largo plazo la transferencia de los viales en un nitrógeno líquido que contiene el tanque de almacenamiento o una C congelador celular -140 °.
5. Para descongelar viales con células congeladas, calentarlas rápidamente en un 37 ° C baño de agua. Inmediatamente cuando se descongela, dispersar la suspensión celular en 10 ml de HBSS precalentado (con suplementos, paso 1,1) en un tubo de centrífuga de 15 ml. Girar el tubo a 300 xg durante 5 min, eliminar HBSS y resuspender el sedimento celular en la densidad celular deseada en HBSS (con suplementos, paso 1.1).
   Nota: La viabilidad del af multinacionalesdescongelación ter es de importancia, ya que la presencia de células muertas disminuirá el rendimiento final de B y los linfocitos T purificados.
   Nota: De acuerdo a nuestra experiencia, la viabilidad celular a menos de 80% reducirá la eficiencia de aislamiento de células.

3. Selección positiva de linfocitos T Población de amigdalares multinacionales

Nota 1: Este protocolo se basa en la selección positiva de linfocitos humanos T CD3 ⁺ de MNCs amígdalas usando perlas magnéticas acopladas al anticuerpo CD3. Es posible iniciar esta sección de frescos (Sección 1) o los (Sección 2) las multinacionales congelados.

Nota 2: Comience con 3 x 10 ⁷ multinacionales. No exceda este número de células, ya que las columnas de separación pueden obstruir y esto reducirá la eficiencia de aislamiento. Utilice columnas más grandes si se manejarán más células. Los volúmenes utilizados en este protocolo han sido experimentalmente optimizado para el número de células con nosotrosed en nuestra configuración experimental.

1. Preparar el tampón de separación [PBS (pH 7,2), 0,5% de albúmina de suero bovino (BSA) y EDTA 2 mM]. Filtrar el tampón de separación a través de un filtro de 0,45 micras y almacenar a 4 ° C.
2. Haga girar la suspensión multinacionales (paso 1,14) a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Resuspender el sedimento resultante de células en 240 l (80 l por cada 10 ⁷ células) de tampón de separación enfriado con hielo. Transferir la suspensión celular en un tubo de 2 ml estéril.
3. Añadir 20 l de anticuerpo CD3 magnético a la solución de células. Incubar los tubos durante 1 hora a 4 ° C con mezclado suave continua para mantener las células en suspensión.
4. Transferir todo de la suspensión celular en un tubo de 15 ml que contiene 5 ml de tampón de separación enfriado con hielo para lavar las células.
5. Centrifugar el tubo a 300 xg durante 10 min a 4 ° C en un rotor basculante.
6. Mientras tanto configurar el separador y la columna magnética. Coloque el separador magnético para el soporte y colocar la columna en la SEPARator. Lavar la columna mediante la aplicación de 500 l de tampón de separación enfriado con hielo. Deseche el flujo a través.
7. Coloque un nuevo tubo de extracción de 15 ml por debajo de la columna. Mantenga el tubo de recogida en el hielo.
8. Descartar el sobrenadante (paso 3.5) mediante la pipeta y resuspender suavemente el sedimento celular en tampón de separación l 500. Aplicar la suspensión de células en la parte superior de la columna de pre-lavado y se deja correr a través.
   Nota: grupos de células pueden obstruir la columna y por lo tanto reducir la tasa de flujo. Para evitar este problema, coloque un filtro de células de plástico 40 micras en la parte superior de la columna. Pasando a través de las células esta malla será altamente mejorar la eficiencia de este método.
9. Lavar la columna 4 veces con 1,5 ml de tampón de separación (500 l para 10 ⁷ células). Esperar a que el depósito de la columna a estar vacía (sin líquido debe ser observado en la columna) antes de aplicar la siguiente etapa de lavado.
   Nota: Obtener las células no marcadas CD3, considerados como fracción de linfocitos B, ya que soneluyó en el tubo de recogida.
10. Retire la columna del separador y el lugar en un nuevo tubo de extracción de 15 ml. Pipetear 2 ml de tampón de separación en la columna. Utilizando el émbolo suministrado con la columna eluir los linfocitos T seleccionados positivamente, que se consideran como la fracción de linfocitos T.
11. Determinar el número de células purificadas (paso 1,15) si es necesario. Las suspensiones celulares están ahora listos para experimentos posteriores.

4. Análisis de citometría de flujo aislada amigdalar linfocitos B y T

PRECAUCIÓN: solución de paraformaldehído es irritante y carcinógeno. Use ropa protectora adecuada, guantes y protección para los ojos / la cara.

Nota 1: Este protocolo describe el método para la tinción directa de las células T y B aislado por fluorescencia análisis de clasificación de células activadas (FACS). El propósito principal de este paso es evaluar la pureza de la célula aislada poblaciones after CD3 anticuerpo separación magnética. Para este propósito B establecido y marcadores de células T, los anticuerpos monoclonales CD20 conjugado con fluoróforo-FITC y CD2-APC, se utilizan. También la inclusión de anticuerpos de control de isotipo es muy recomendable para distinguir el "fondo" la unión no específica de los anticuerpos CD2 y CD20 (véase el paso 4.8).

Nota 2: Es posible para mantener las fracciones de células purificadas en una solución de paraformaldehído al 1% (PFA) en la oscuridad a 4 ° C hasta el momento de tinción (por ejemplo, día siguiente,.). También el mismo procedimiento es aplicable si hay un intervalo de tiempo entre la tinción y análisis FACS. Recuerde que en ambos casos las células deben lavarse adecuadamente con PBSA (PBS que contenía 0,2% de BSA) tampón, antes de la tinción o análisis FACS.

1. Saque 6 x 10 ⁶ células de las multinacionales del paso 1,15 (antes de aplicar a la columna), fracción de linfocitos B desde el paso 3.9 y fracción de linfocitos T a partir del paso 3.10.
2. Haga girar la célulasuspensiones a 300 xg durante 5 min a 4 ° C utilizando un rotor basculante.
3. Eliminar el sobrenadante con pipeta y se lava el sedimento celular una vez con 1 ml de helado PBSA. Haga girar las suspensiones de células a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante con pipeta y resuspender el células en 600 l de tampón PBSA helada.
4. Añadir 100 l de la suspensión celular a la parte inferior de un tubo de FACS.
5. Añadir 100 l de PBS que contiene 10% inactivado por calor suero humano a cada tubo, mezclar bien e incubar durante ~ 1 min a RT o 20 min en hielo.
   Nota: los linfocitos B llevan receptores Fc. Con el fin de bloquear la Fc de receptores de células purificadas las fracciones se incuban con 10% inactivado por calor suero humano. El suero humano es inactivado por calor mediante incubación a 56 ° C durante 1 hr. Divida el suero inactivado por calor en pequeñas alícuotas y almacenar congelados a -20 ° C.
6. Centrifugar la suspensión de células a 300 xg durante 5 min a 4 ° C en un swing de salida del rotor.
7. Eliminar el sobrenadante con pipeta y se lava el sedimento celular con 1 ml PBSA. Repetir la centrifugación (300 xg durante 5 min a 4 ° C).
8. Añadir 100 l PBSA en cada tubo en hielo. Añadir la cantidad apropiada de anticuerpo monoclonal conjugado con fluoróforo, de acuerdo con la recomendación del fabricante (por ejemplo, 20 l de anti-CD20 y / o 5 l de anticuerpos anti-CD2 en 100 l de PBSA). Nota: No se olvide de asignar tubos de control suficientes para el análisis FACS. En este protocolo los siguientes controles deben incluir: 1) células teñidas con los anticuerpos anti-CD2 y anti-CD20 de forma individual, 2) células teñidas con los anticuerpos anti-CD2 y anti-CD20 de control de isotipo de forma individual y, 3) células sin adición de anticuerpos.
9. Brevemente vórtice del tubo y se incuba durante 30 min a 4 ° C en la oscuridad.
10. Lavar 2 veces con PBSA. Añadir 2 ml de solución de PFA al 1% a las muestras. Deje que las células permanecen en la solución de PFA al 476; C en la oscuridad hasta el momento del análisis FACS.
11. Inmediatamente antes de ejecutar las muestras en la máquina de FACS, se lavan las células 2 veces con PBSA (300 xg durante 5 min a 4 ° C). Resuspender las muestras en 1 ml de PBS y mantienen a 4 ° C (o en hielo), protegido de la luz, antes de la separación en el citómetro de flujo.
12. Hacer la clasificación FACS siguiendo el protocolo del citómetro de flujo fabricante.

5. La detección por PCR de ADN Adenovirus en aislada amigdalar linfocitos B y T

Nota 1: Los hexón de adenovirus cebadores de genes son AdRJC1 (5'-GACATGACTTTCGAGGTCGATCCCATGGA-3 ') y AdRJC2 (5'-CCGGCTGAGAAGGGTGTGCGCAGGTA-3') ^11. Estos cebadores generan un amplicón de 139 pb. El gen 18S rRNA anfitrión puede ser detectada con los cebadores tp206 (5'-CCCCTCGATGCTCTTAGCTG-3 ') y tp207 (5'-TCGTCTTCGAACCTCCGACT-3'). El tamaño de amplificación esperado es 300 pb.

Nota 2: Cada PCRplazo incluye un control negativo (destilada H _{2 O)} y un control positivo de ADN obtenido a partir de la línea de células B humanas (BJAB) infectados con adenovirus humano tipo 5 ^12.

1. Extraer ADN (de al menos 1 x 10 ⁶ células, paso 3.11), utilizando el método de purificación de columna basada membrana de sílice. Extracto de ARN usando fenol y solución de isotiocianato de guanidina ^13.
2. Añadir 100 ng de ADN de linfocitos B y T a una mezcla de reacción que contenía tampón 1x HF, 0,2 mM de mezcla de desoxinucleótido trifosfato (dNTP), 0,25 M de cada cebador y 1 U de alta fidelidad de ADN polimerasa en un volumen total de 20 l.
3. Realizar la amplificación por PCR bajo las siguientes condiciones de ciclo: 30 seg de desnaturalización a 98 ° C, seguido por 30 ciclos de 98 ° C durante 10 seg, 67 ° C (hexon) o 58 ° C (18S rRNA) durante 30 seg y 72 ° C durante 30 s. La reacción de PCR se terminó con una etapa de extensión final de 7 min a 72 ° C.
4. Separar el amplif PCR resultanteicación productos en un gel de agarosa al 1,5% en 1x tampón TBE y visualizar las bandas esperadas por tinción con colorante de ácidos nucleicos.

Resultados

Una separación eficiente de las multinacionales tonsilares resultados en subpoblaciones altamente purificadas de los linfocitos B y T. Esto fue confirmado por análisis de FACS usando anticuerpos anti-CD2 anti-CD20 y para detectar linfocitos B y T poblaciones, respectivamente (Figura 3A). Por el contrario, una separación ineficiente de MNCs resultados en las fracciones celulares que son una mezcla de células de ambas subpoblaciones de linfocitos B y T (Figura 3B).

Discusión

Uno de los factores más importantes que afectan a los resultados de este protocolo es el uso de material amigdalar fresco como el material de partida. Por lo tanto, las muestras de amígdalas deben procesarse dentro de 3 horas después de la cirugía. Las amígdalas pueden ser obtenidas de adultos y niños. El material amigdalar de los hijos es generalmente más pequeño debido a la extirpación quirúrgica parcial de las amígdalas (amigdalotomía). Por lo tanto, el número de MNCs obtiene a partir de muestras de amigdalotomía (1 ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS)	Gibco	14175-053	Contiene 5% de suero fetal bovino (FBS), 10 mM de glutamina,    0,05 mg/ml Gentamicina y 1% Mezcla de antibióticos y antimicóticos
Medio de congelación			90% FBS y 10% DMSO
Tampón			PBS (pH 7,2), 0,5% BSA y 2mM EDTA
PBSA			PBS que contiene 0,2% BSA
PFA			PBS que contiene 1% de paraformaldehído (PFA). Hacer fresco. Se sospecha que el PFA es cancerígeno. Use guantes y gafas.
Mezcla antibiótica-antimicótica	Gibco	15240-062
60 mm Petridish	Nunc	150326
Disección de preceps	Fisher Scientific	1381241
Tijeras de iris rectas		Fisher Scientific
	Swann-Morton	REF 0501
100 μ m filtro de celdas de plástico	Corning Life Sciences	352360
40 μ m coladores de celdas de plástico	Corning Life Sciences	352340
jeringa de plástico de 2 ml	BD Biosciences
Tubos de centrífuga cónicos de 15 ml	SARSTEDT 62554502
Tubos de centrífuga cónicos de 50 ml	SARSTEDT	62547254
Centrífuga de baja velocidad con rotor de ángulo fijo o de cubeta oscilante	Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R
Ficoll– Hypaque	Sigma-Aldrich	F5415-50ML	Ficoll solución
Suero fetal para terneros	Industrias biológicas	040071A
Sulfóxido de dimetilo (DMSO)	SIGMA	D2650-5X5ML
Columnas MACS MS	Miltenyi Biotec	130-042-201
MACS humano CD3 MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-092-881
Separador MACS (Octo MACS)	Miltenyi Biotec	130-042-109
Albúmina sérica bovina (BSA)	Merck Millipore	1120180100
EDTA	AnalaR NORMAPUR	20302.293
CD2 conjugado con aloficocianina ( CD2-APC)	BD Biociencias
CD20 conjugado con isotiocianato de fluoresceína (CD20-FITC)	BD Biociencias
Suero humano	Rockland Immunochemicals	D119-0100
Phusion ADN polimerasa de alta fidelidad	Thermo Scientific	F-530L
Tubos FACS	BD Falcon	352003
Cryotube	SARSTEDT	72379
BD LSRII caudalímetro	BD Biosciences
BD FACSDiva 4.1 software	BD Biosciences
Sangre de nucleospina	Macherey-Nagel	740951.50	kit de aislamiento de ADN
Reactivo TRIzol	Life technologies	15596	Reactivo de aislamiento de ARN
Hemocitómetro	The Paul Marienfeld GmbH & Co. KG 0610030		dispositivo de contador de células
GelRed	Biotium	41003	Tinción de gel de ácido nucleico