Síntesis de nanofibras a base de Queratina de Ingeniería Biomédica

Resumen

nanofibras electrospun tienen un área superficial alta en relación al peso, excelente integridad mecánica, y apoyar el crecimiento y la proliferación celular. Estas nanofibras tienen una amplia gama de aplicaciones biomédicas. Aquí fabricamos queratina / nanofibras de PCL, utilizando la técnica de electrospinning, y caracterizar las fibras para posibles aplicaciones en ingeniería de tejidos.

Resumen

Electrospinning, debido a su versatilidad y potencial para aplicaciones en diversos campos, con frecuencia está siendo usado para fabricar nanofibras. La producción de estas nanofibras porosos es de gran interés debido a sus propiedades físico-químicas únicas. Aquí se elabora en la fabricación de queratina que contiene poli (ε-caprolactona) (PCL) nanofibras (es decir, compuesto de fibras PCL / queratina). queratina soluble de agua se extrajo primero de cabello humano y se mezcla con PCL en diferentes proporciones. La solución combinada de PCL / queratina se transformó en membranas nanofibras utilizando un electrospinning de laboratorio diseñado configurar. Se observaron morfología de la fibra y las propiedades mecánicas de la nanofibra obtenida y se miden usando microscopía electrónica de barrido y de ensayo de tracción. Por otra parte, degradabilidad y propiedades químicas de la nanofibra se estudiaron mediante FTIR. imágenes de SEM mostraron morfología de la superficie uniforme para las fibras de PCL / queratina de diferentes composiciones. Estos PCL / queratinocitosn fibras también mostraron excelentes propiedades mecánicas tales como el módulo de punto y el fracaso del joven. células de fibroblastos eran capaces de unirse y proliferar tanto, demostrando una buena viabilidad celular. Sobre la base de las características discutidas anteriormente, podemos argumentar fuertemente que las nanofibras de mezcla de polímeros naturales y sintéticos pueden representar un excelente desarrollo de materiales compuestos que se pueden utilizar para diferentes aplicaciones biomédicas.

Introducción

Electrospinning es reconocido como un método frecuente de conseguir nanofibras de polímeros. Las fibras pueden ser producidas en una escala nanométrica y de las propiedades de la fibra son adaptables ^1. Estos desarrollos y las características de nanofibras electrohiladas han sido especialmente interesante por sus aplicaciones en la ingeniería biomédica especialmente en ingeniería de tejidos. Las nanofibras electrohiladas poseen similitudes con la matriz extracelular y por lo tanto promover la adhesión celular, la migración y la proliferación ^2. Debido a esta similitud a la matriz extracelular (ECM), fibras electrohiladas se pueden utilizar como materiales para ayudar en vendaje para heridas, administración de fármacos, y para los tejidos de ingeniería, tales como el hígado, hueso, corazón, músculo y ^3.

Una variedad de diferentes polímeros de origen sintético y natural se han utilizado para crear fibras electrohiladas para diferentes aplicaciones de ingeniería biomédica ^4. Recientemente ha habido una creciente eninterés en el desarrollo de nanofibras de material compuesto mediante la mezcla de polímeros sintéticos y naturales ^4. En estas composiciones los productos finales típicamente heredan la resistencia mecánica asociada con el polímero sintético a la vez que la adopción de las señales y las propiedades biológicas del polímero natural.

En este experimento, PCL y la queratina se presentan como los polímeros sintéticos y naturales a ser utilizados para la síntesis de una nanofibra compuesto. La queratina es un polímero natural que se encuentra en el pelo, la lana y las uñas. Contiene muchos residuos de aminoácidos; de notable interés es cisteína ^4,5. Lo ideal es un polímero de origen natural sería biorenewable, biocompatible y biodegradable. Queratina posee los tres de estas características al tiempo que aumenta la proliferación celular y la adhesión a los biomateriales que se ha incorporado en ^6.

La policaprolactona (PCL) es un polímero reabsorbible, sintético que es significativo enla ingeniería de tejidos ^4. Este polímero previamente ha sido alabado por su estabilidad estructural y mecánica, sin embargo, carece de afinidad de células y exhibe una velocidad de degradación largo. La naturaleza hidrofóbica de PCL es probable responsable de la falta de afinidad celular ^7. Sin embargo, PCL compensa sus limitaciones por ser altamente miscible con otros polímeros. Un PCL / compuesto de queratina debe demostrar las propiedades mecánicas de PCL e incorporar las propiedades biológicas de queratina, por lo que es una opción ideal para diversas aplicaciones biomédicas.

Protocolo

Todo protocolo sigue las directrices de la Oficina de Cumplimiento y Ética de Investigación de la Universidad Estatal de Carolina del Norte A & T.

1. Preparación para la química de la queratina ^de extracción 4

1. Para preparar 1.000 ml de 2% solución de ácido peracético en peso / vol (PAS), bajo una campana de humos añadir 20 ml de ácido peracético a 980 ml de agua desionizada (DI).
2. Para preparar 1.000 ml de solución de base 100 mM Tris (TBS), añadir 12,2 g de Tris Base a 1.000 ml de agua DI y remover hasta que se disuelva por completo.
3. Preparar una solución diluida de ácido clorhídrico (DHAS) en una campana de humos mediante el vertido de 4 ml de ácido clorhídrico concentrado en 30 ml de agua DI.
4. Adquirir unos 20 g de recortes de pelo humanos que no han sido tratados o alterados químicamente. El pelo puede ser de cualquier longitud.
5. Lavar el cabello a fondo, a mano, con agua caliente y jabón. Use agua desionizada (DI) para el enjuague final.
6. Ponga el pelo en dos vasos de precipitados de 600 ml y colocar en un 80 ºC oncluso para 1 hr.
7. Drenar el líquido de la parte inferior del vaso y volver a meterla en el horno hasta que el cabello esté completamente seco.
8. Divide el cabello se seca de manera uniforme entre los vasos de precipitados 600 ml, colocar 10 g de cabello en cada vaso. No permita que el cabello para llenar más de 500 ml.
9. Verter 500 ml de PAS en cada vaso de precipitados asegurándose de cubrir todo el pelo. Cubra los vasos con Parafilm y almacenar durante 12 horas.

2. Preparación de la queratina Extracto de Solución

1. Separar el pelo de la PAS usando un tamiz de 500 micras. Recoger los residuos PAS en un recipiente aparte. Enjuague el cabello completamente con agua desionizada para eliminar cualquier PAS sobrante.
2. Coloque el cabello se enjuaga en un matraz de 500 ml. Verter 400 ml de TBS en el matraz, asegurándose de que el cabello está cubierto. Lugar matraz en un baño de agitación fijado a 38 ° C, 65 rpm durante 1 hora.
3. Después de 1 hora, retirar del baño de agitación y verter el líquido, aproximadamente 400 ml de solución de extracción queratina (KES), into un vaso de precipitados de 1000 ml.
4. Verter 400 ml de agua DI en el matraz que contiene el pelo asegurar que el cabello se cubre y se coloque de nuevo en el baño de agitación durante 1 hr. Retirar el matraz del baño de agitación y verter los restantes 400 ml de la KES en el vaso de precipitados de 1.000 ml con el KES recogida con anterioridad. El cabello ya no es necesario y puede ser objeto de dumping del matraz y se desecha en el recipiente de basura más cercano.

3. Concentración de Queratina Extracto de Solución

1. Llenar el baño rotodistiller a la línea superior con agua destilada y se puso a 90 ºC. Ajuste la velocidad de rotación de 200 rpm. Encienda el refrigerante del enfriador-bomba y ajustado a -10 ºC.
2. El uso de un medidor de pH para vigilar el pH de la KES, utilizar una pipeta para añadir lentamente DHAS 1 mM a la KES hasta alcanzar un pH 7,0. Se agita lentamente a medida que se añade la solución.
3. Verter la KES neutralizado en los 500 ml en matraz de fondo redondo de hasta alrededor trimestre completo. Ejecutar el destilador de acuerdo con el fabricante deprotocolo de 1,25 hr.
   1. Repita el paso 3.3 hasta que todo el KES se ha destilado. Asegúrese de que el frasco esté conectado firmemente.

4. La diálisis de Queratina Extracto de Solución

1. Verter solución KES igualmente en 12 tubos cónicos de 14 ml separados. Centrifugar los tubos a 1.050 xg durante 10 min.
2. Verter la KES se centrifuga en un vaso limpio, asegurándose de verter lejos de los desechos recogidos. Repetir hasta que todo el KES ha sido centrifugado.
3. Llene una probeta graduada de 2.000 ml con agua DI.
4. Cortar la membrana de diálisis de celulosa tubo de 24 pulgadas, y el clip de un extremo del tubo para mantenerla cerrada.
5. Sumergir la longitud del tubo en el cilindro de agua DI para que sea más flexible y más fácil de abrir.
6. Abrir el extremo no recortado de la membrana de celulosa tubo de diálisis y verter lentamente 60 ml de solución KES centrifugada en el tubo. Utilice otro clip para cerrar este extremo de la tubería.
7. Poner el diANÁLISIS tubo en el cilindro de 2.000 ml de agua DI y deje reposar durante 24 h. Cambiar el agua DI en el cilindro de cada 3 a 4 horas.
8. Después del período de 24 horas, vaciar la solución dializada KES en frascos tapados, asegurándose de dejar espacio en la parte superior y colocar en el congelador a -20 ° C durante 24 horas.

5. La liofilización de la queratina Extracto de Solución

1. Ajuste el liofilizador a -86 ºC.
2. Retirar los frascos que contienen KES congelado del congelador, quite los tapones de los frascos de, y colocarlos en ampollas de liofilización. Colocar los sellos de las ampollas y gire el mando para crear una presión de vacío de 0,133 mbar. Liofilizar las muestras durante aproximadamente 48 horas, hasta que toda la humedad se ha ido.

6. Preparación de Soluciones de electrospinning (10% en peso de la queratina de la solución)

1. Quitar el polvo de la queratina del liofilizador y pesarlo.
2. Añadir agua DI al polvo de la queratina para crear un 10% en peso / pesosolución de queratina.

7. Preparación de la Solución al 10% en peso de PCL

1. Obtener PCL (polímero ε-caprolactona, Mn 70 a 90 kDa), y trifluoroetanol (TFE). Preparar un 10% en peso PCL en TFE por agitación O / N y obtener una mezcla homogénea.

8. Preparación de la solución de la queratina / PCL

1. Obtener la solución PCL 10% en peso preparado previamente y la solución de queratina 10% en peso. Añadir la queratina en la gota solución PCL prudente con el fin de crear 10 ml PCL / soluciones de queratina de 90:10, 80:20, 70:30, 60:40 y ratios.
2. Use un vórtex para obtener una mezcla homogénea de solución PCL / queratina antes de electrospinning.

9. Producción de Electrospun PCL / fibra de queratina

1. Coloque aproximadamente 8 ml de la solución de PCL / queratina en un 10 ml jeringa desechable provisto de un tubo de plástico de diámetro 0,5 mm. Coloque la jeringa en una bomba de jeringa en el que el caudal se fija en 2,5 ml / hr.
2. Aplicar tensión a la punta de la aguja conectado al tubo (posicionado ~ 23 cm de la fibra de recogida de tambor, y ~ 30 grados desde la horizontal). Aplicar un 19 - 22 kV de tensión al tubo y girar el tambor colector en alrededor de 200 rpm.
   1. Envolver el tambor colector con papel de aluminio antes de ejecutar la muestra. Asegúrese de que el papel de aluminio es estable mediante la aplicación de la cinta de etiquetar en cada extremo.
      Nota: Las fibras se forman en la lámina de aluminio (Ver Figura 2), almacenar la lámina de cubierta de fibra a TA.

10. Análisis Mecánico de PCL / nanofibras de queratina

1. Cortar la muestra en 60 mm por 8 mm. Asegúrese de registrar el espesor mediante micrómetro digital. Para cada composición preparada, utilice cinco muestras.
2. Coloque la muestra de 60 x 8 mm en el medidor de tensión. Utilice un soporte de muestras diseñado a medida para fijar la muestra. Bocadillo la muestra entre soportes para muestras que se hace de una tarjeta de índice utilizando doblecinta de doble cara. Aplicar la célula 10 N de carga con una velocidad de desplazamiento de 10 mm / min.
   Nota: El soporte de la muestra fue diseñado para ser 62 mm por 40 mm con una ventana interior de 50 mm por 38 mm.
3. una extensión del registro y los valores de carga a través de software de acuerdo con el protocolo de software.
4. Calcular el estrés dividiendo la fuerza por área de la muestra ensayada. A continuación, calcular la tensión dividiendo el cambio de longitud por la longitud inicial.
5. Generar la curva de tensión-deformación por el trazado de la tensión en el eje y para valor de la deformación correspondiente en el eje x.
6. Calcular el módulo de Young de la región lineal donde la pendiente es igual a módulo de elasticidad. Determinar resistencia a la tracción de la trama de tensión-deformación mediante la adopción de desplazamiento en la cepa 0,2% y trazando una línea paralela a la curva de la región lineal.
7. Efectuar el análisis estadístico de los datos mecánicas obtenidas por triplicado previamente usando análisis unidireccional de varianza utilizando el software de análisis ^8. Valores de p <0,05 nosre considerado estadísticamente significativo.

11. Superficie Morfología y estructural Caracterización

1. Utilice microscopio electrónico de barrido (SEM) con los parámetros de voltaje de aceleración de 15 kV y corriente de 5 mu para observar la morfología de las fibras electrohiladas.
   1. Antes de las imágenes con SEM, cortar una sección de 2 cm ² de la fibra y adjuntarlo a una etapa SEM utilizando cinta de cobre. Coloque la etapa dentro del dispositivo de recubrimiento por pulverización catódica y la capa de oro en 15 mA durante 1 min y 30 seg para crear una capa de oro de aproximadamente 11 nm de espesor. Cargar la muestra en la cámara de la SEM. Tenga en cuenta las muestras de fibras.
2. Use la transformada de Fourier espectroscopia infrarroja (FTIR) para caracterizar la unión química entre la PCL y queratina. Coloque la sección 2 cm ² de la membrana electrospun de nanofibras en un soporte magnético y purgar el sistema con aire seco antes de la prueba. Obtener espectros de 200 lecturas y analizar los espectros usando staándar software de acuerdo con el protocolo de software.
3. Realizar análisis de espectro utilizando software estándar y utilizar triplicados de cada relación de nanofibra de acuerdo con el protocolo del fabricante.

12. Estudio de la interacción de las células de fibra

1. Cortar fibras en 16 mm ² muestras. Use un pegamento biocompatible a base de silicona para fijar cada muestra a cubreobjetos con un diámetro 12 mm.
2. Pegue un extremo de la muestra de fibra a la parte posterior de la hoja de la cubierta, envuelva la muestra alrededor del cubreobjetos, luego pegar el extremo libre de la muestra a la parte posterior de la hoja de la cubierta, así, dejando la parte superior de la hoja de cubierta con sólo el muestra de fibra.
3. Colocar las muestras de fibra en una placa de 24 pocillos. Esterilizar las muestras por inmersión en 80% de etanol durante 1 hr.
4. Enjuague el etanol a partir de las muestras usando agua DI. Luego, la pipeta 2 ml de medio basal en la muestras, asegurándose de cubrir toda la muestra. Retire el medio después de 5 minutos.
5. Uso de fibroblastos 3T3 células para sembrar las muestras de fibras. Suspender las células en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con antibióticos y suero bovino fetal al 10% (FBS), de manera que hay aproximadamente 62.000 células / cm ² por 1 ml de DMEM.
6. Gota 1 ml de la solución de DMEM que contiene células 3T3 en cada placa, así asegurando que cada muestra de fibras se cubre con aproximadamente 62.000 ^células / cm2. Se incuban las placas de pocillos durante 24 horas a 37 ° C y _5% de CO2. Nota: El uso 5% de CO ₂ debido a que el nivel general se puede mantener el pH de los medios de comunicación celular en el rango fisiológico para días.

13. La degradación de nanofibras Matrix

1. Corte seca membranas de nanofibras de queratina en PCL / cuadrado de aproximadamente 30 mm x 30 mm.
2. Esterilizar los 900 mm ² muestras con alcohol al 80% durante un período de incubación de 10 minutos y lavar con agua DI. Se incuban las muestras en 15 ml de PBS, pH 7,5, a 37 ºC. Vuelva a colocar la buffer cada 3 días.
3. Tome las membranas fuera de la solución a intervalos especificados, de 1 semana y 7 semanas, y enjuagar con agua DI.
4. Colocar las muestras de membrana en ampollas de liofilización. Colocar los sellos de las ampollas y gire el botón para crear un vacío. Liofilizar durante 24 horas, hasta que esté completamente seco.
5. Coloque la muestra seca a una etapa SEM utilizando cinta de cobre. Coloque la etapa dentro del dispositivo de recubrimiento por pulverización catódica y la capa de oro en 15 mA durante 1 min y 30 seg.
6. Cargar la muestra en la cámara de la SEM. Tenga en cuenta las muestras de fibra a un voltaje de aceleración de 1,5 kV y 5 actual mu.

Resultados

Morfología de fibra
imágenes de SEM de las fibras se obtuvieron para todas las composiciones de fibra. Véase la Figura 3. Imagen de fibra confirma que las fibras están orientadas aleatoriamente.

Pruebas Mecánicas
Mecánicamente fibras fuertes son generalmente necesarios para diversas aplicaciones de ingeniería de tejidos. Estas fibras deb...

Discusión

Se logró la extracción de la queratina del cabello humano. El ácido peracético actuó como un agente oxidante en el cabello humano, lo que permite la queratina que se extrae por la Base Tris. La producción de polvo de queratina era pequeña escala debido al hecho de que sólo se hace con fines de investigación. Este procedimiento ya se ha establecido en la industria para la producción a gran escala. El propósito de extraer la queratina de pequeña escala era el control de la contaminación, la variabilidad del lote, y el cos...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cabello humano			Obtenido de la barbería local en Greensboro
Ácido peracético	Sigma Aldrich
PCL (polímero de e-caprolactona)	Sigma Aldrich	502-44-3	Mn 70-90 kDa
Trifluoroetanol (TFE)	Sigma Aldrich	75-89-8
Tris Base (TrizmaTM Base Powder)	Sigma Aldrich		>99.9% cristalino
Ácido clorhídrico	Fischer Scientific	A144C-212 Lote 093601	Waltham, MA
Kwik-Sil	World Precision Instruments		Sarasota, FL
Membrana de celulosa	Sigma Aldrich		12 - 14 kDa
microscopio óptico	Olympus BX51M	BX51M	Japón
microscopio electrónico de barrido	Hitachi SU8000	SU8000
Japón Máquina Shimadzu de mesa	América del Norte Instrumentos analíticos y de medición Serie AGS-X Serie	AGS-X	Columbia, MD
Espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier	Bruker Tensor 2 Instrument		Billerica, MA
Microcal Origin software			Northampton, MA
Difracción de rayos X (XRD)	Bruker AXS D8 Advance Difractómetro		X Madison, WI
Fibroblasto 3T3  célula	Colección Americana de Cultivo de Tipo de Tejido Manassas		, VA
Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM	Invitrogen		Grand Island,
Lector de microplacas NY Spectra max Gemini XPS	Molecular Devices		Sunnyvale, CA
Estudiante- Prueba post hoc de Newman-Keuls	Software

de corte molecular de rayos SigmaPlot 12