Se requieren células de Sertoli primaria para el estudio de testículo-inmune privilegio, la transducción de señales durante la inflamación o infección, y la utilización de sus propiedades inmunoprotectivos. Aquí se describe un protocolo basado en enzima para el aislamiento de células de Sertoli primaria altamente purificadas y células peritubulares de testículos de ratas.
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Artículo de método
Aislamiento de células de Sertoli y peritubulares Las células de testículos de ratas
En este artículo
Resumen
Resumen
El testículo, y en particular el gameto masculino, desafía al sistema inmunológico de una manera única porque los espermatozoides diferenciados aparecen por primera vez en el momento de la pubertad - más de diez años después del establecimiento de la tolerancia inmune sistémica. espermatogénica células expresan una serie de proteínas que pueden ser vistos como no propio por el sistema inmune. El testículo debe entonces ser capaz de establecer tolerancia a estos neo-antígenos, por un lado, pero aún ser capaz de protegerse de infecciones y el desarrollo de tumores en el otro lado. Por lo tanto el testículo es uno de los pocos sitios privilegiados inmune en el cuerpo que toleran los antígenos extraños sin evocar una respuesta inmune inflamatoria perjudicial. células de Sertoli desempeñan un papel clave para el mantenimiento de este entorno privilegiado inmunitario de los testículos y también prolongan la supervivencia de las células cotransplanted en un entorno exterior. Por lo tanto, las células de Sertoli primarias son una herramienta importante para el estudio del privilegio inmune de los testículos que no puede ser correoasily reemplazado por líneas celulares establecidas o otros modelos celulares. Aquí se presenta un protocolo detallado y completo para el aislamiento de las células de Sertoli y las células peritubulares - si se desea - a partir de testículos de ratas dentro de un solo día.
Introducción
Testículos producen gametos masculinos y hormonas sexuales, es decir, los andrógenos. El órgano se compone de dos compartimientos. En el compartimiento intersticial, que representa alrededor del 10-12% del volumen total de testículo 1, la esteroidogénesis se lleva a cabo dentro de las células de Leydig. El compartimento tubular representa aproximadamente el 60-80% del volumen testicular 1 y contiene células germinales y dos tipos de células somáticas - células peritubulares y células de Sertoli. El testículo está dividido por tabiques de tejido conectivo en 250-300 lóbulos, cada uno con 1-3 túbulos seminíferos intrincadas. Esto....
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Protocolo
1. Declaración de Ética Animal
Los experimentos descritos aquí se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Regierungspräsidium Giessen, Alemania, como la autoridad local y confirman a la Ley alemana de Prácticas para el Cuidado y Uso de animales con fines experimentales (Permiso. No: 20/23 GI Nr A 31 / 2012).
2. Preparación de los medios de comunicación, soluciones de enzimas y Animales
- Preparar 1% de alcohol de yodo mediante la disolución de 1 g de yodo en 100 ml de etanol.
- Preparar 2x 500 ml de fosfato de Dulbecco solución salina tamponada (PBS) sin Ca2 + y Mg2 + suplementado ca....
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Resultados
El procedimiento descrito permite el aislamiento de aproximadamente 12 x 10 7 células de Sertoli de 10 testículos de ratas. 3 x 10 6 células se colocan por pocillo en una placa de 6 pocillos de manera que entre seis y siete placas de 6 pocillos están disponibles para los experimentos en el día 7. La digestión con tripsina-DNasa I es el paso más crítico durante el aislamiento de células de Sertoli. Si la digestión en este punto está avanzando demasiado lejos, la prop.......
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Discusión
Los túbulos seminíferos están delimitados por una capa circular de células peritubulares y una lámina basal en el lado luminal. Las células de Sertoli descansan sobre la lámina basal, establecen la barrera de los testículos sanguíneos mediante la formación de uniones oclusivas entre las células adyacentes y proporcionan el marco estructural para la organización del epitelio seminífero. Las células de Sertoli y las células espermatogénicas adyacentes mantienen contactos íntimos durante todo el desarrollo de las células ge.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a Guido Verhoeven y Ludo Deboel, Lovaina, que eran extremadamente útil para establecer el aislamiento de las células de Sertoli primarias en el laboratorio Meinhardt en Giessen. Monika Fijak, Giessen, es reconocido por su ayuda en la figura 1A y asesoramiento. Los estudios fueron apoyados por la Deutsche Forschungsgemeinschaft a través BH subvención 93 / 1-1 (SB) y la financiación de la Investigación de Graduados de la universidad de Giessen JLU Internacional (Alemania) / Universidad de Monash (Melbourne, Australia) GRK 1871 (SB). El apoyo también se obtuvo de una subvención del Estado de Hessen, dentro del programa "Landes-ofensivo zur E....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Clon de anticuerpo de actina (músculo liso) 1A4 | Dako | M0851 | Anticuerpo monoclonal de ratón anti humano. Utilice la dilución 1:100 para la inmunofluorescencia. |
| Albúmina fracción bovina V Grado estándar, liofilizado | Serva | 11930.04 | Filtro (0.45 µ m) Soluciones de BSA utilizadas para la inmunofluorescencia. |
| Coladores de células Corning 70 y micro; m | Corning | 431751 | color blanco |
| de Clostridium histolyticum | Roche | 10103586001 | |
| DAPI mountant ProLong Gold Antifade | Life technologies | P-36931 | |
| D-glucosa | Sigma | G8644 | 100 g/L |
| Dulbecco&agudo; s PBS sin Ca2+/Mg2+ | Gibco | 14190-094 | |
| DNasa I | Roche | 10104159001 | |
| Microscopio electrónico | Zeiss | EM 109S | |
| Microscopio de fluorescencia | Zeiss | Axioplan 2 | |
| Hialuronidasa de testículo bovino | Sigma | H3506 | |
| Luz invertida microscopio | Olympus | CKX41 | Microscopio de cultivo celular de rutina |
| Ratón IgG / IgM (H+L) policlonal secundario Anticuerpo | Life technologies | A-10684 | Alexa Fluor 488 aceite conjugado |
| rojo O | Sigma | O0625 | ha reemplazado a Sudán III y Sudán IV debido a un color más brillante. |
| Paraformaldehído | Sigma | P6148 | |
| Penicilina (5,000 U/ml)/ Estreptomicina (5.000 y micro; g/ml) | Gibco | 15070-063 | Solución 100x |
| RPMI-1640 | Gibco | 21875-034 | Contiene 300 mg/L L-glutamina |
| Tripsina de páncreas porcino | Sigma | T5266 | |
| Tinción azul de tripán (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Inhibidor de tripsina de soja | Sigma | T6522 | El producto Sigma es considerablemente más barato que el utilizado anteriormente BPTI (Aprotinin) de Roche. |
| Anticuerpo de vimentina (V9) | Sigma | V6630 | Anticuerpo monoclonal de vimentina anti cerdo en ratón. Utilice la dilución 1:100 para la inmunofluorescencia. |
| Las ratas Wistar WU | Charles River | deben tener 19 días de edad el día del experimento. |
Referencias
- Andrology. Male Reproductive Health and Dysfunction. Nieschlag, E., Behre, H., Nieschlag, S. , 3rd ed, Springer. (2010).
- Esaki, S. Über Kulturen des Hodengewebes der Säugetiere und über die Natur des interstitiellen Hodengewebes und der Zwischenzellen. Z. Mikros....
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Reimpresiones y permisos
