Las patas delanteras y la probóscide de Drosophila contienen un rico repertorio de neuronas sensoriales gustativas. Aquí, presentamos un método que utiliza imágenes de calcio para medir las respuestas fisiológicas de las neuronas sensoriales en la pata delantera y la probóscide de moscas vivas tras la aplicación exógena de una feromona gustativa.
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Artículo de método
La medición de las respuestas fisiológicas de
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Resumen
Resumen
A diferencia de los mamíferos, insectos, tales como Drosophila tienen múltiples órganos del gusto. Las neuronas quimiosensriales en las piernas, trompa, las alas y ovipositor de Drosophila expresan receptores gustativos 1,2 canales iónicos, 3-6, y los receptores ionotrópicos 7 que están involucrados en la detección de señales sensoriales volátiles y no volátiles. Estas neuronas en contacto directamente con estimulantes del gusto tales como alimentos, sustancias nocivas y las feromonas y por lo tanto influyen muchos comportamientos complejos tales como la alimentación, la puesta de huevos y el apareamiento. grabaciones de electrodos y de imágenes de calcio se han usado ampliamente en los insectos para cuantificar las respuestas neuronales evocadas por estos estimulantes del gusto. Sin embargo, la electrofisiología requiere un equipo especializado y las mediciones de obtener de una sola sensillum sabor puede ser técnicamente difícil dependiendo del tipo de células, tamaño y posición. Además, la resolución de la neurona individual en Drosophila puede ser difícil de lograr ya que Hou sabor sensillase más de un tipo de neurona quimiosensorial. El método de formación de imágenes en vivo de calcio descrito aquí permite respuestas de las neuronas gustativas individuales en moscas vivas que han de medirse. Este método es especialmente adecuado para obtener imágenes de las respuestas neuronales a las feromonas de lípidos y otros tipos de ligandos que tienen baja solubilidad en disolventes a base de agua.
Introducción
Los animales dependen de la información olfativa y gustativa para mediar en las decisiones esenciales para la supervivencia y la reproducción. La comprensión de cómo las señales chemosensory se detectan y procesan por el sistema nervioso requiere la identificación del receptor (s) sensorial y los correspondientes ligandos químicos. Drosophila detectar una asombrosa variedad de compuestos volátiles y no volátiles y son un excelente modelo en el que estudiar la fisiológico mecanismos que subyacen chemosensation. Mientras que los órganos olfativos perciben moléculas volátiles, los órganos gustativos están especializados para detectar compuestos de baja volatili....
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Protocolo
1. Preparación de muestras
- Cruzar la línea Gal4 3,22 controlador de UAS-GCaMP5G 19 moscas (1118 w; P {20XUAS-IVS-GCaMP5G} attP40). Deje que la cruz de crecer a 25 ° C.
Nota: Generación vuela con múltiples copias de los transgenes o Gal4 UAS-GCaMP puede ayudar a aumentar la intensidad de la señal fluorescente. Una versión anterior del transgén UAS-GCaMP (UAS-GCaMP3) mostró intensidad de fluorescencia muy débil cuando se expresa bajo el control del controlador de Gr68a-Gal4.- Recoger y separada por sexo recién eclosed moscas adultas y eleva....
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Resultados
El indicador de calcio GCaMP se expresó genéticamente utilizando conductores ppk23-Gal4 Gr68a-Gal4 o. Poblaciones distintas de neuronas pata delantera y células de apoyo no neuronales son etiquetados por cada conductor (Figura 3A-C). Se observaron respuestas-ligando específico a la feromona CH503 lipofílica en Gr68a-Gal4 y las células que expresan Gal4-ppk23 GCaMP (Figura 3D). El cambio relativo en la intensidad de fluorescencia de la señal GCaMP5G
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Discusión
Se describe aquí un método para realizar las imágenes en vivo de calcio de las neuronas periféricas de Drosophila en 2 órganos sensoriales diferentes. El Ca2 + -evoked respuestas fluorescentes GCaMP en Gr68a-neuronas inducidos por el ligando feromona CH503 eran dependientes de la dosis y cuantitativa. También era posible discernir diferentes patrones de respuesta neural tales como fásica y respuestas tónicas.
Se cree que las neuronas que muestran respuestas fásicas para p.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Investigación de Singapur (subvención NRF-RF2010-06 a J.Y.Y.).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Gr68a-Gal4 | Regalo de H. Amrein (Texas A& M Centro de Ciencias de la Salud, TX, EE. UU.) y J. Carlson (Universidad de Yale, CT, EE. UU.) | ||
| PPK23-Gal4 | Regalo de K. Scott (Univ. de California, Berkeley, CA, EE. UU.) | ||
| UAS-GCaMP5 | 42037 | Bloomington Drosophila Cubreobjetos de | |
| 0,17 mm (cubreobjetos Gold-Seal)Servicios de | Microscopía Electrónica | 63790-10 | |
| Esmalte de uñas, "Duro como las uñas transparente" | Sally Hansen | ||
| Pluma PAP | Sigma-Aldrich | ||
| Pincel | pincel de punta fina | ||
| Cinta | Marca | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 13021 | |
| Etanol, grado de laboratorio | Merck | 10094 | |
| Hexano, grado HPLC | Sigma-Aldrich | H303SK-4 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | ||
| PBST | descrita en la sección de protocolo | ||
| CH503 | Synthesis descrita en Mori et al., 2010 | ||
| sCMOS Camera (ORCA Flash4.0) | Hamamatsu | Microscopio C11578-22U | |
| (Ti-Eclipse) | Nikon | Ni-E | |
| Yokogawa | CSU-X1-A1 | ||
| Aquistion Software (MetaMorph Premier) | Molecular Devices | 40002 | |
| Fiji software | de código | http://fiji.sc/Fiji |
Referencias
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science. 287, 1830-1834 (2000).
- Dunipace, L., Meister, S., McNealy, C., Amrein, H. Spatially restricted expression of candidate taste receptors in the Drosophila gustatory system. Curr. Biol.
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