De alta resolución de cuantificación del comportamiento guiado Olor en Drosophila melanogaster Uso de la Flywalk Paradigma

Summary

El Flywalk automatizado sistema de seguimiento se utiliza para la alta resolución de la cuantificación del comportamiento de olor guiada en Drosophila melanogaster.

Abstract

En su ambiente natural, los insectos como la mosca del vinagre Drosophila melanogaster son bombardeados con una gran cantidad de olores químicamente distintas. Para complicar aún más las cosas, los olores detectados por el sistema nervioso de los insectos no suelen ser compuestos simples, pero las mezclas cuya composición y proporciones de concentración variar. Esto conduce a una cantidad casi infinita de diferentes estímulos olfativos que tienen que ser evaluada por el sistema nervioso.

Para entender qué aspectos de un estímulo olor determinan su evaluación por parte de la marcha, por lo que es conveniente examinar de manera eficiente el comportamiento olor guiada hacia muchas sustancias odoríferas y mezclas de olores. Para correlacionar directamente el comportamiento a la actividad neuronal, la conducta debe ser cuantificado en un plazo de tiempo similar y bajo condiciones de estímulo idénticos como en experimentos neurofisiológicos. Sin embargo, muchos bioensayos olfativas que actualmente se utilizan en Drosophila neuroetología son bastante specializado ya sea hacia la eficiencia o hacia la resolución.

Flywalk, un sistema de entrega olor y seguimiento automatizado, llena el vacío entre la eficiencia y la resolución. Permite la determinación de exactamente cuando un paquete olor estimula una mosca libremente caminar, y para determinar las del animal reacción de comportamiento dinámico.

Introduction

El objetivo primordial de cualquier investigación neuroethological es establecer una relación de causalidad entre los estados de actividad de neuronas individuales o circuitos neuronales y el comportamiento de un organismo. Para lograr este objetivo la actividad neuronal y el comportamiento debe ser monitoreado en condiciones de estímulo idénticas y estas condiciones de estímulo debería idealmente ser similares a los del sistema nervioso bajo escrutinio evolucionado para darle sentido. Particularmente cuando se trata de bioensayos de comportamiento, estos requisitos históricamente han demostrado ser muy exigente en Drosophila melanogaster neuroetología olfativo.

Una vez liberado de la fuente, plumas olor rompen rápidamente en filamentos delgados con difusión turbulenta provocada por el movimiento del aire es el principal determinante de la distribución de olor ^1. Como resultado, un insecto navegando hacia una fuente de olor experimenta estimulación intermitente con paquetes de olor intercalados con intervalos variables de aire limpio. Ambas cosascaminar y los insectos voladores - incluyendo Drosophila - se han demostrado para explotar este régimen estimulación intermitente para la navegación por el aumento en ceñida al encuentro penacho y predominantemente movimiento transversal del viento en la ausencia de olores ^{2 - 5.} Considerando que los procedimientos de estimulación en experimentos fisiológicos imitar en gran medida los de un insecto puede experimentar en su entorno natural o bien proporcionando bocanadas individuales de olores intercalados con períodos prolongados de aire limpio o secuencias de estimulación dinámicos ^{6 - 11,} muchos bioensayos de comportamiento utilizados en Drosophila neuroetología tales como ensayo TRAP , arenas en campo abierto o T-laberinto confían en olor-gradientes de ^{12 - 15.} Sin embargo, debido a los gradientes de olor, por definición, son variables en la concentración dependiendo de la distancia desde la fuente de olor, un comportamiento particular no puede atribuirse a una concentración de olor precisa el uso de estos paradigmas. Además, la pendiente deun gradiente olor depende fundamentalmente de las propiedades fisicoquímicas de la sustancia odorífera. Un gradiente de un compuesto muy volátil será menos profunda que la creada por un compuesto menos volátil y por lo tanto también más difíciles de rastrear para un organismo basándose en la medición de diferencias de concentración en el espacio como el único medio de navegación ^{16 - 20,} que puede conducir a una interpretación errónea de las preferencias olfativas particularmente en ensayos de elección. Este efecto también es muy perjudicial cuando se investiga el comportamiento hacia mezclas de olores, ya que conduce a diferentes relaciones de componentes de mezcla en cada punto en el espacio, por lo que una vez más se opone a una clara correlación entre la fisiología y el comportamiento.

Mientras moscas del vinagre tienden a agregarse en la fermentación de la fruta, que son solitarias en su navegación hacia fuentes de alimento y sitios de oviposición. Sin embargo, en lugar de pruebas de los animales individuales muchos paradigmas conductuales utilizadas en Drosophila neuroethología examinar el comportamiento de olores guiada por cohortes de moscas y la atracción se anotó como la fracción de moscas que eligen el olor más de un estímulo de control. Estos experimentos de cohortes han contribuido en gran medida a la comprensión de neuroetología mosca y muchas de las observaciones formuladas por el uso de ellos podría ser confirmado en experimentos de una sola mosca. Sin embargo, se ha observado que las moscas pueden influir en cada decisión other's ²¹ y en casos extremos la evaluación de un olor puede pasar de la indiferencia a la evitación en función de la densidad de población ^22. Además, los resultados de este tipo de experimentos proporcionan a menudo sólo el punto final de una secuencia de decisiones de comportamiento en lugar de observar lo que está haciendo la marcha mientras se está haciendo, lo que sería deseable cuando se intenta correlacionar el comportamiento con la actividad neuronal. Estos experimentos de cohortes en vez de baja resolución contrastan con alta resolución de los métodos de una sola mosca tales como arenas de vuelo atados y cintas de correr que permitenpara una observación directa de las respuestas de comportamiento en el momento del estímulo se presenta ^20,23,24. Sin embargo, los experimentos de cohortes siguen siendo populares, porque son muy eficientes y proporcionan resultados sólidos, incluso a baja comparativamente tamaños de muestra, porque la variabilidad inter-individual y entre ensayos están parcialmente en promedio debido a la observación de las poblaciones durante períodos prolongados de tiempo. Mientras vuelo atado cinta de correr y probablemente proporcionan el estándar de oro en relación con la presentación del estímulo y la resolución temporal, las arenas utilizadas están diseñados para los animales individuales y por lo tanto es mucho tiempo para obtener el tamaño de muestra necesario para un análisis estadístico. Recientemente se han desarrollado varios otros enfoques que permiten una adquisición eficiente de los datos de comportamiento de alta resolución en combinación con un régimen de estímulo bien definido. Estos incluyen sin supervisión seguimiento 3D de múltiples moscas del vinagre en un túnel de viento en combinación con un modelo 3D preciso del olor penacho ⁵ , el seguimiento de múltiples moscas individuales en cámaras elección suministradas con corrientes de aire de ambos lados ^{25 y} el paradigma Flywalk ^26.

En Flywalk, 15 moscas individuales están situados en pequeños tubos de vidrio y monitoreados continuamente por una cámara aérea en condiciones de luz roja. Los olores se añaden a una corriente de aire continua de 20 cm / seg y se desplazan por los tubos de vidrio a una velocidad constante. La corriente de aire se humidifica pasándolo a través de botellas de 250 ml que contenían agua destilada (humidificadores) antes de entrar en el sistema de suministro de olor. Las posiciones flies' se registran dentro de una región cuadrada de interés (ROI) que abarca la mayor parte de la longitud de los tubos de olor (pero excluyendo los bordes exteriores de los tubos (aproximadamente 5 mm en cada lado), donde las moscas no pueden moverse más hacia arriba o hacia a favor del viento) en la época de presentación de olor (Figura 1 A, B). Fly identidades se mantienen constantes por el sistema de seguimiento de turante el experimento sobre la base de sus Y-posiciones (es decir, sus límites de tubo de vidrio). Olor estimulación se consigue utilizando un dispositivo de estímulo multi-componente que permite la presentación de hasta 8 olores individuales y todas las mezclas posibles de los mismos ^26,29 (Figura 1B). El curso de un experimento se controla por un ordenador que regula el sistema de suministro de olor y la recolección de la temperatura y la humedad información (ordenador 1, la Figura 1C). Este equipo también controla un datalogger (iniciar / detener la grabación) en un segundo equipo que rastrea continuamente las posiciones de la mosca a 20 fotogramas por segundo (ordenador 2). Vuela posiciones, estado de la válvula de olor (es decir, el tiempo-punto de apertura de la válvula), el olor de identificación, la temperatura y la humedad alrededor de los ciclos de estimulación olor se registran en el ordenador 2. De esta manera la información sobre el olor y volar posiciones están sincronizados y se exportan como .csv archivos que se pueden procesar más y analizados mediante rutinas de análisis personalizadas escrita. Porquetodo el sistema es controlado por ordenador, ninguna intervención humana es necesaria durante una sesión experimental.

Protocol

Los detalles constructivos y técnicos de Flywalk se han descrito en otra parte ²⁶ (en caso de cualquier problema de establecer esta configuración, más información se puede solicitar desde MK). Aquí nos centramos en las instrucciones detalladas sobre el manejo del paradigma que le ayudará a obtener resultados fiables.

1. Fly Manipulación

1. Posterior vuela en bajo a las culturas media densidad en medio alimenticio ²⁷ en virtud de un 12 h luz: 12 h: régimen de oscuridad a 23-25 ​​° C y una humedad relativa del 70%. Con este fin, permitir 20-30 adultos recién surgido vuela de reproducir en un gran frasco de comida durante 1 semana, luego descarta moscas adultas y esperar a surgir descendencia.
2. Recoger 30-40 recién emergidas (edad <24 h) las moscas adultas y les envejecer en en nuevo un vial que contiene medio de los alimentos ²⁷ durante 3-5 días.
3. Veinticuatro horas antes del inicio del experimento de comportamiento: Transferir todo el 30-40 recogido previamente 3-5 d de edad (ver 2.2) vuela a una nueva vial que contiene un tapón de espuma de caucho húmedo o un pañuelo de papel humedecido utilizando un aspirador.
   NOTA: No anestesiar las moscas utilizando CO _2.

2. Preparación de la instalación de Flywalk

1. Use 250 ml botellas como humidificadores. Llenar humidificadores con 100 ml de agua destilada.
2. Preparar viales de olor.
   1. Preparar 500 l 10 ^-3 diluciones del acetato de etilo olores puros, butirato de etilo, acetato de isopentilo y 2,3-butanodiona en el aceite mineral disolvente.
   2. Adjuntar dos válvulas de retención de bola por el olor vial. El registro de entrada válvulas permiten únicamente el flujo de aire unidireccional. Por lo tanto, conectar válvulas de retención de tal manera que el aire pueda entrar en el vial en un lado y dejarlo en el otro lado.
   3. Retirar la tapa de un tubo de reacción de PCR 200 l. Pipetear 100 l de cada dilución de olor en un tubo de reacción separado y colocar los tubos en viales de olores distintos. También preparará un olor vial que contiene sólo el oi mineral disolventel.
   4. Sellar herméticamente los viales de olor por cerrarlos utilizando tapones de acero inoxidable y juntas de goma.
   5. Conectar los 5 viales de olor (4 olores que contienen 1 y que contienen aceite mineral) al sistema de suministro de olor. Asegúrese de conectar en la dirección de flujo de la derecha. Una conexión incorrecta no sólo pondrá en peligro el experimento planeado, pero también puede contaminar el sistema de entrega.
3. Compruebe si hay fugas mediante el sellado de la salida de la cámara de mezcla del dispositivo de estímulo. Asegúrese de que todas las corrientes de aire antes de que el dispositivo de estímulo ahora caen progresivamente a cero. Si no es así, compruebe si hay fugas que ahora se pueden identificar por el silbido de aire que sale del sistema.
4. Transferir cuidadosamente 15 moscas individuales a 15 tubos de vidrio individuales utilizando un aspirador y tubos de vidrio cercanos en ambos lados utilizando los adaptadores correspondientes.
   Nota: Debido a que el sistema debe estar herméticamente sellado para experimentos exitosos, asegúrese de que los adaptadores encajan tubos de vidrio herméticamentey tenga en cuenta que los tubos de vidrio pueden romperse durante este paso. Tenga cuidado para evitar lesiones por el uso de guantes y gafas de protección.
5. Conecte los tubos de vidrio a la configuración Flywalk y, a partir de ahora, esperar por lo menos 15 minutos antes de comenzar el experimento para permitir que las moscas que se habitúan al nuevo entorno.
6. Después de colocar tubos de vidrio: compruebe la lectura de los medidores de flujo aguas abajo digitales en el ordenador 1 si los 16 flujos de aire después de que los tubos de vidrio se suman al flujo de aire que entra en el sistema. También puedes ver en el ordenador 1, si la humedad está entre 60% y 80%.
7. Diseño de protocolo de estímulo que controla la secuencia y el calendario de los estímulos de olor presentados a las moscas. Para obtener los datos descritos por ejemplo, presentes 4 olores y el control (aceite mineral) individualmente y es posible ternario y las mezclas cuaternarias de los olores de forma simultánea durante 40 veces cada uno. Establecer duración de pulso de 500 ms a un intervalo inter de 90 segundos y de forma aleatoria secuencia de estímulo.
8. Encienda la lifuente de lucha (cluster LED; λ = 630). Asegúrese de proporcionar suficiente luz para el seguimiento eficiente sin incrementar la temperatura en el interior de los tubos de vidrio.
9. Configurar una región de interés del sistema de seguimiento arrastrando un marco a través del área a monitorizar de una manera tal que se incluyen todos los 15 tubos de vidrio y aproximadamente 5 mm de los bordes de los tubos están excluidos.
10. Configurar 14 líneas de separación paralelas entre tubos individuales en el sistema de seguimiento por el cambio de sus Y-posiciones en la secuencia de comandos correspondiente para mantener individuo vuela identificables durante todo el experimento. Asegúrese de situar ellos de tal manera que siempre hay un tubo de vidrio entre dos de tales líneas de separación, ya que sólo una mosca se realizará un seguimiento entre cualquier conjunto de dos líneas.
11. Asegúrese de establecer parámetros de la cámara de tal manera que las moscas se realiza un seguimiento de forma fiable a través de los tubos de vidrio. Si moscas se pierden en los bordes de la región de interés, aumentar el brillo o la ganancia de la s de seguimientooftware. Evitar las vibraciones mecánicas del sistema de seguimiento. Seguir utilizando software comercial de acuerdo con el protocolo del fabricante.
12. Comience experimento iniciando el protocolo de estímulo. Grabar flies' XY coordenadas a 20 fps (fotogramas por segundo) e ingrese combinación con el estado de la válvula olor en archivos de texto.

Análisis 3. Datos

NOTA: Los siguientes pasos en el análisis de datos están automatizados utilizando rutinas personalizadas-escrita programadas en R. Debido a que estos pasos son cruciales para obtener resultados significativos del análisis obstante, se presenta de una manera paso a paso. Los datos en bruto para el análisis son .csv archivos que contienen información sobre el estado de la válvula sincronizada olor, número de impulsos en el experimento y 15 de la mosca x posiciones en cm sobre un eje de tiempo común para el ciclo de estimulación de un olor. El código personalizado para el análisis de los datos se puede proporcionar a petición.

1. Abrir .csv-file, encontrar tiempo-punto de apertura de la válvula significada por un chaENS en la columna que representa el estado de la válvula.
2. Calcular la función lineal de la posición olor de la forma
   f (t) = s * t + i
   donde t es el tiempo en el ciclo de estimulación, s es la velocidad del viento (aquí 20 cm / seg) y el intercepto i se puede calcular utilizando el punto de tiempo el olor entra en los tubos en la posición 0 (apertura de la válvula, más retraso).
3. Encuentra el punto de tiempo en el que el olor y vuela posición x se cruzan por cada mosca y establecer este punto de tiempo a 0. Nota: De esta manera las posiciones de moscas están alineados con cada uno del individuo encuentro con el olor.
4. Excluir moscas sentadas en los bordes de la región de interés.
5. Calcula la velocidad de X-posiciones dividiendo el desplazamiento a lo largo del eje x por el intervalo de tiempo (100 ms) y repetir el procedimiento para cada ciclo de estimulación.
6. Para obtener cursos temporales de velocidad, como se muestra en la Figura 2E calcular media-transcurso de tiempo de velocidad para cada mosca y olor y de los que el curso temporal media para un olor determinado.
7. Para obtener desplazamiento neto como se muestra en la Figura 3C calcular el desplazamiento neto dentro de 4 seg después del pulso de olor para cada evento de seguimiento y después el desplazamiento neto medio por mosca y el olor.

4. Procedimiento de limpieza

1. Limpia Tubos de cristal
   1. Retire las moscas y los adaptadores de tubos de vidrio y disfrutar de tubos de vidrio en detergente.
   2. Enjuagar los tubos de cristal bajo el chorro de agua destilada y secarlos usando aire a presión.
   3. Tubos de vidrio térmico a 200 ° C durante 8 horas.
2. Limpie Olor Sistema de Entrega
   1. Retire todos los viales de olor y tubo de la cámara de mezcla central.
   2. Eliminar los adaptadores de tubo de la cámara de mezcla.
   3. Cámara de mezcla limpia por lavado con solución de limpieza de laboratorio y disolventes (por ejemplo, etanol, acetona). Realice estos pasos bajo la campana de laboratorio.
   4. Cámara de mezcla en seco utilizando aire a presión y se calienta a 200 ° C durante 8 horas.
3. Limpie olor Viales y Válvulas
   1. Retire el tapón de acero (junta de goma de descarte) y válvulas de retención de viales de olor y disfrutar todos los componentes de la solución de limpieza de laboratorio.
   2. Componentes sonicado en un baño de ultrasonidos y enjuague con agua destilada.
   3. Limpie todos los componentes excepto válvulas de retención con etanol y acetona. Realice estos pasos bajo la campana de laboratorio.
   4. Componentes secos utilizando aire a presión y les calientan a 200 ° C durante 8 horas.
   5. Limpie las válvulas de retención en el interior por el lavado con etanol y acetona usando una jeringa (considerar la dirección del flujo). Realice estos pasos bajo la campana de laboratorio usando gafas de laboratorio. Debido a la acetona ataca a las piezas de goma, inmediatamente las válvulas de retención en seco mediante el lavado con aire a presión.
   6. Quite los olores residuales mediante un pulso de aire a través de las válvulas de retención durante varios días. Utilice una incubadora a 60 ° C y un aire de 1 segundo encendido / 1 segundo aire de régimen para esta etapa de limpieza.

Results

Debido a que las moscas pueden distribuir libremente dentro de sus tubos de vidrio entre los pulsos de olor y viaja por el pulso de olor a través de los tubos de vidrio a una velocidad constante moscas encuentran el olor en diferentes momentos dependiendo de su posición x en el momento de la estimulación. Como resultado, los inicios de las trayectorias contra el viento evocadas por un pulso de 500 mseg de una atractiva 10 ^-3 dilución de acetato de etilo se retrasan en alrededor de 1 seg para las moscas en el ...

Discussion

Aunque el sistema Flywalk parece bastante sofisticada a primera vista, una vez puesto en marcha, es fácil de usar y produce resultados muy robustos. Para destacar la consistencia de los resultados obtenidos con el bioensayo se puede decir que los resultados representativos se muestran aquí se obtuvieron casi 2 años después de algunos de los resultados que se muestran en un estudio previo ²⁹ con una configuración modificada usando un nuevo software de seguimiento y de la fuente de luz. Sin embargo, las respues...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Configuración de Flywalk	Detalles personalizados		disponibles a pedido
Dispositivo de estímulo	Detalles personalizados		disponibles a pedido
de LED	Detalles personalizados		disponibles a pedido
HD Pro Webcam C920	Logitech, Lausana, Suiza
2 Computadoras
Flywalk Reloaded v1.0 software	Electricidade Em Pó (electricidadeempo.net)
Software Labview 11.0	National Instruments, Austin, TX
Alimento estándar para moscas	Personalizado
Viales estándar para moscas	Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Alemania
Viales estándar para moscas	Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Alemania
aspirador	personalizado
aceite mineral	Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)
odors	Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)
200 µ l Tubos de reacción PCR	Biozym Scientific GmbH, Oldendorf, Alemania