Materiales biomiméticos para caracterizar las interacciones bacteria-huésped

Resumen

La unión bacteriana a las células huésped es un paso clave durante la colonización e infección del huésped. Este protocolo describe la generación de adhesinas recombinantes acopladas a polímeros como materiales biomiméticos que permiten analizar la contribución de adhesinas individuales a estos procesos, independientemente de otros factores bacterianos.

Resumen

La unión bacteriana a las células del huésped es uno de los primeros eventos durante la colonización bacteriana de los tejidos del huésped y, por lo tanto, un paso clave durante la infección. La caracterización bioquímica y funcional de las adhesinas que median estas interacciones iniciales bacteria-huésped a menudo se ve comprometida por la presencia de otros factores bacterianos, como componentes de la pared celular o moléculas secretadas, que interfieren con el análisis. Este protocolo describe la producción y el uso de materiales biomiméticos, que consisten en adhesinas recombinantes puras acopladas químicamente a perlas de poliestireno funcionalizado disponibles comercialmente, que se han utilizado con éxito para diseccionar las interacciones bioquímicas y funcionales entre las adhesinas bacterianas individuales y los receptores de las células huésped. También se discuten los protocolos para diferentes químicas de acoplamiento, que permiten la inmovilización direccional de adhesinas recombinantes en andamios poliméricos, y para la evaluación de la eficiencia de acoplamiento de los materiales "bacteriomiméticos" resultantes. Describimos con más detalle cómo estos materiales se pueden utilizar como herramienta para inhibir la citotoxicidad mediada por patógenos y discutimos el alcance, las limitaciones y las aplicaciones posteriores de este enfoque en el estudio de las interacciones bacteriano-huésped.

Introducción

Diseccionar las interacciones entre las adhesinas bacterianas y los receptores de la superficie del huésped en la interfaz huésped-patógeno es un paso esencial hacia nuestra comprensión de los mecanismos subyacentes que impulsan la adhesión bacteriana. En última instancia, esto nos ayudará a identificar estrategias para interferir en estos procesos durante las infecciones. Al realizar este tipo de estudios, a menudo nos enfrentamos a un dilema: el análisis bioquímico y biofísico de los mecanismos moleculares de la unión de las adhesinas requiere su separación de otros componentes de la pared celular, lo que puede interferir con los eventos de adhesión. Por otro lado, el uso de proteínas solubles recombinantes simplifica en exceso el evento de adhesión, al ignorar el anclaje de la proteína en la pared celular bacteriana y la multivalencia de unión lograda a través de la visualización de la superficie bacteriana. Del mismo modo, desde la perspectiva de la célula huésped, el encuentro y la unión a moléculas individuales de adhesina no siempre tiene el mismo impacto en términos de organización de la membrana plasmática, fluidez de la membrana y agrupación de receptores¹ y esto, en última instancia, dificulta la evaluación del impacto de la adhesión en la señalización celular del huésped y el resultado de las interacciones bacteria-huésped.

Recientemente se ideó un método, mediante el cual las adhesinas purificadas recombinantes o fragmentos de adhesina se acoplan direccional y covalentemente a partículas poliméricas de tamaño similar a las bacterias, imitando así la visualización de la superficie bacteriana. Este enfoque se ha utilizado en una variedad de adhesinas diferentes, desde moléculas de adhesión multivalentes (MAM) gramnegativas2^{, 3}, hasta adhesinas grampositivas, incluida la proteína de unión a fibronectina Staphylococcus aureus (FnBPA)^{4, 5} y Streptococcus pyogenes F1 ^{6, 7}. Este método ha permitido la disección de fragmentos de adhesina importantes para la unión de la célula huésped, la identificación de los receptores de la superficie del huésped y la determinación de su comportamiento en la superficie de la célula huésped, teniendo en cuenta tanto la afinidad de unión como la avidez ^{1, 8}. Además, este enfoque se ha utilizado para investigar la eficacia de las adhesinas inmovilizadas y sus derivados como inhibidores de las interacciones huésped-patógeno ^{8, 9}. Se ha demostrado que los derivados acoplados a la superficie de la molécula de adhesión multivalente (MAM) 7 de Vibrio parahaemolyticus pueden utilizarse para atenuar una serie de infecciones bacterianas in vitro, incluidas las causadas por patógenos multirresistentes como Acinetobacter baumannii y S. aureus resistente a la meticilina (SARM) ^{7, 9}.

Aquí, describimos diferentes químicas que se pueden utilizar para inmovilizar adherencias a partículas de poliestireno funcionalizado disponibles comercialmente. Debido a la amplia gama de funcionalidades de superficie, etiquetas y tamaños de partícula disponibles, estos son un andamio útil para la producción de materiales bacteriomiméticos para investigar las interacciones adhesina-huésped. Describimos además los métodos para la caracterización inicial de la reacción de acoplamiento y para el cálculo de propiedades importantes de los materiales resultantes. Finalmente, se discute el uso de adhesinas acopladas a perlas como inhibidores competitivos de infecciones bacterianas in vitro como ejemplo de su aplicación, así como el alcance futuro y las limitaciones de este enfoque.

Protocolo

1. Química Acoplamiento de proteínas de perlas de polímero

1. Acoplamiento direccional tiol-amina
   Nota: Este protocolo es adecuado para el acoplamiento de la cisteína que contiene proteínas para funcionalizada con amina perlas de polímero, utilizando sulfosuccinimidilo 4- (p -maleimidophenyl) butirato (sulfo-SMPB) como agente de reticulación (Figura 1).
   
   Figura 1. La reticulación estrategia utilizada para el acoplamiento tiol-amina direccional de las proteínas a perlas de polímero. Perlas de poliestireno modificadas con amina se activan con sulfo-SMPB. La maleimida reacciona con cisteínas gratuitas para direccionalmente proteínas par de perlas. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
   1. Preparación de reactivos:
      1. Preparar PBS (fosfato de sodio 100 mM, NaCl 150 mM, pH 7,0) y autoclave.
      Preparar una acción 100x (0,5 M o 287 mg / ml en PBS) de TCEP (tris (2-carboxietil) fosfina) inmediatamente antes de su uso.
   2. Preparar un 5x de stock (10 mM o 4,58 mg / ml en dH ₂ O) de sulfo-SMPB inmediatamente antes del uso.
   3. Preparar un 10x (500 mM o 88 mg / ml en PBS, pH 7,0) de cisteína inmediatamente antes del uso.
2. La activación del grano:
   1. Mezclar la suspensión de perlas por inversión suave y transferir la cantidad requerida de suspensión de perlas (por ejemplo, 12 ml) en un tubo de 1,5 ml estéril que contiene 1 ml de PBS estéril, pH 7,0.
   2. Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para lavar los granos y pellets por centrifugación en una microcentrífuga (2 min a 16.000 xg).
   3. Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta y descarte. Resuspender el sedimento de perlas en 1 ml de PBS estéril fresco y repetir la etapa de lavado. Resuspender el sedimento de perlas en 0,8 ml de PBS.
   4. Añadir 200 ml de recién preparada 10 mM sulfo-SMPB, para dar una concent definitivaración de 2 mM.
   5. Se incuba la suspensión de microesferas durante 1 hora a 25 ° C en una rueda giratoria.
3. Reducción de Proteínas:
   1. Durante el período de incubación de la etapa de activación, preparar la proteína para la siguiente etapa de acoplamiento para que pueda ser inmediatamente añadió a las perlas activadas.
      Nota: Aunque este paso de reducción no siempre es necesaria para la GST (glutatión S-transferasa) proteínas de fusión, se recomienda para asegurar una alta eficiencia de acoplamiento.
      1. Comprobar la concentración de proteína, y ajustarlo a la concentración final requerida para la reacción de acoplamiento. Nota: proteína de 6 mM en PBS, y un volumen de 1 ml se utilizan generalmente.
      2. Añadir TCEP acciones para dar una concentración final de 5 mM. Incubar la solución durante 30 min a RT.
         Nota: La mezcla de reacción se puede utilizar directamente para la siguiente reacción de acoplamiento.
      3. Conserve una pequeña cantidad (unos pocos ml) de la solución de proteína para determinar la pro concentración de proteína y el cálculo de la eficiencia de acoplamiento (véase la sección 2).
4. Proteína etapa de acoplamiento:
   1. Sedimentar las perlas activadas mediante centrifugación (2 min, 16.000 xg en una microcentrífuga), y lavar el pellet una vez en 1 ml de PBS estéril fresco.
   2. Resuspender el precipitado en la solución de proteína preparada (por ejemplo, 1 ml), para dar la concentración deseada de proteína.
      Nota: La concentración de proteínas durante la etapa de acoplamiento dependerá de la eficacia de acoplamiento medio (ver sección 2 para la determinación de la eficacia de acoplamiento) y la densidad de acoplamiento deseado (como se calcula en 1.1.4.3). La eficiencia es de aproximadamente 85% y de la deseada concentración final 5 mM en la suspensión 10x del grano, por lo que la concentración de proteína durante la etapa de acoplamiento debe ser de aproximadamente 6 mM.
   3. Calcular la densidad de acoplamiento usando la siguiente fórmula:
      jpg "/> donde
      densidad de acoplamiento ρ _c [número de moléculas de proteína / nm ^2],
      concentración de proteína concentrada de proteínas [mg / ml],
      proteína M _w peso molecular de proteínas [Da],
      concentración concentrado grano del grano [número de cuentas / L],
      diámetro del grano d [nm ^2]
      El número de Avogadro
   4. Utilice la densidad de acoplamiento para calcular la separación media ligando:
      
   5. Se incuba la suspensión de proteína-grano durante 2 horas a 25 ° C en una rueda giratoria.
      Nota: Algunosproteínas pueden no ser estable a temperatura ambiente. En estos casos, la reacción puede llevarse a cabo a 4 ° CO / N.
   6. Desactivar restantes grupos activados en las perlas mediante la adición de cisteína de stock a una concentración final de 50 mM y se incuba la suspensión durante 30 min a 25 ° C en una rueda giratoria. Sedimentar las perlas por centrifugación (2 min, 16.000 xg en una microcentrífuga).
   7. Mantenga el sobrenadante para determinar la concentración de proteínas y el cálculo de la eficiencia de acoplamiento (véase la sección 2).
   8. Lavar el sedimento de perlas dos veces con 1 ml de PBS y se resuspenden en 1 ml de PBS fresco para dar el producto final.
      Nota: El protocolo anterior será típicamente dar 1 ml de proteína acoplada, a una concentración final de proteína de 5 mM, que se puede utilizar como un stock de 10x para experimentos posteriores (véase la sección 3).
   9. Para proceder a la sección 3 del protocolo, trabajar con 100 ml / ml de grano de valores, o a una concentración final de 500 nM de proteína. Nota: Un buen punto de partida para este procedure será de 2 × 10 ¹² perlas / ml, lo que resulta en una densidad de acoplamiento promedio de 3 × 10 ^-4 proteínas / NM ² o un espaciamiento promedio de 57 nm sobre una perla de 2 mm de diámetro.

Acoplamiento direccional tiol-carboxi
Nota: Este protocolo es adecuado para el acoplamiento de cisteína que contiene proteínas a perlas de poliestireno funcionalizado con carboxilo. El resto carboxilo se activa por primera vez el uso de 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) / N-hidroxisuccinimida (NHS), amina modificada y luego reticulado usando sulfo-SMPB (Figura 2).

Figura 2. La reticulación estrategia utilizada para el acoplamiento tiol-direccional carboxilo de las proteínas a perlas de polímero. Perlas de poliestireno carboxilado son activados primero con EDC y modificados con NHS para formar un éster de NHS-semi-estable. Con posterioridad amina de acoplamiento de etilendiresultados de amina en un grupo amina libre, que reacciona con sulfo-SMPB. Maleimida activa perlas entonces pueden reaccionar con cisteínas gratuitas para direccionalmente proteínas par de perlas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Preparación de reactivos:
   1. Preparar PBS (fosfato de sodio 100 mM, NaCl 150 mM, pH 7,0) y autoclave.
   2. Preparar una acción 100x (0,5 M o 287 mg / ml en PBS,) de TCEP inmediatamente antes del uso.
   3. Preparar una 10x de stock (20 mM, o 4 mg / ml en PBS) de EDC (1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida) inmediatamente antes de su uso.
   4. Preparar una 10x de stock (50 mM, o 6 mg / ml en PBS) de NHS (N-hidroxisuccinimida) inmediatamente antes de su uso.
   5. Preparar un 5x de stock (10 mM o 4,58 mg / ml en dH ₂ O) de sulfo-SMPB inmediatamente antes del uso.
   6. Preparar un 10x (500 mM o 88 mg / ml en PBS, pH 7,0) de la cisteína inmediatamente buso ntes.
2. La activación del grano:
   1. Mezclar la suspensión de microesferas por inversión suave y transferir la cantidad requerida de suspensión de perlas (por ejemplo, 12 ml) en un tubo de 1,5 ml estéril que contiene 1 ml de PBS estéril, pH 7,0.
   2. Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para lavar los granos y pellets por centrifugación en una microcentrífuga (2 min a 16.000 xg).
   3. Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta y descarte.
   4. Resuspender el sedimento de perlas en 1 ml de PBS estéril fresco y repetir la etapa de lavado.
   5. Resuspender el sedimento de perlas en 0,8 ml de PBS.
   6. Añadir 100 ml de 10x EDC social (2 mM concentración final) y de inmediato 100 ml de solución madre 10x NHS (5 mM concentración final) para la suspensión de perlas.
   7. Se incuba la suspensión de microesferas durante 30 min a 25 ° C en una rueda giratoria.
   8. Lavar perlas una vez en 1 ml de PBS y se resuspenden en 0,8 ml de PBS estéril fresco.
   9. Añadir 200 ml de etilendiamina, y incUbaté la suspensión de microesferas durante 1 hora a 25 ° C en una rueda giratoria.
   10. Lávese las cuentas una vez con PBS 1 ml y resuspender las perlas en 0,8 ml de PBS fresco.
   11. Proceda de la sección 1.1.2.4 (activación de cuentas con sulfo-SMPB) como se describe en la sección 1.1.2 y seguir el resto del protocolo descrito en la sección 1.1 (acoplamiento direccional Tiol amina). Realizar preparación de proteína y los pasos de acoplamiento de proteínas de una manera idéntica a las descritas en la sección 1.1.
       Nota: La eficacia de acoplamiento típica usando este protocolo es ligeramente inferior en comparación con la sección 1.1, por lo tanto, ajustar la concentración inicial de proteína en consecuencia para conseguir la misma densidad de acoplamiento (75% aprox.).

2. Determinación de la eficiencia de acoplamiento

Nota: Para determinar la concentración de proteína, utilizar Bradford Reactivo ¹⁰ y ensayos colorimétricos como sigue:

1. Invierta suavemente Bradford reactivo al correo Nsure homogeneidad del reactivo.
2. El uso de una solución madre de BSA 10 mg / ml, se preparan patrones de proteínas que cubren las concentraciones a partir de 0,1 a 1,5 mg / ml de BSA en tampón.
3. Añadir 250 ml de reactivo de Bradford a los pocillos de una placa de 96 pocillos. Preparar suficientes pozos para todas las muestras, estándares de proteína y controles negativos (tampón solamente).
4. Añadir 5 ml de muestra de proteína (estándares de proteína o tampón, para el control negativo) con el reactivo en la placa de 96 pocillos.
5. Incubar la placa en un agitador orbital a temperatura ambiente durante 10 min.
6. Medir la absorbancia a 595 nm usando un lector de placas.
7. Generar una curva estándar de la concentración de BSA en comparación A595 nm y utilizar esto para determinar concentraciones de proteína en las muestras iniciales y el sobrenadante.
8. Calcular la concentración de proteína acoplada como sigue:
   
9. Calcular la eficiencia de acoplamiento como:
   00eq4.jpg "/>

3. El uso de acoplado Bead Adhesinas en ensayos de competición

1. Preparación:
   1. Semilla de 1 ml por pocillo de células Hela a una concentración de 150.000 células / ml en una placa de 24 pocillos el día antes de que el ensayo de competición, para permitir que las células alcanzan aproximadamente 80% de confluencia antes de iniciar el experimento.
   2. Configure cada condición experimental por triplicado. Incluya pozos para controles negativos (sin bacterias añadidas durante ensayos de competición), controles positivos (perlas de control junto a la fusión etiqueta única añadida durante ensayos de competición) y controles de lisis (para experimentos de citotoxicidad).
   3. Inocular un LB (MLB) cultivo de 5 ml marina con una colonia fresca de V. parahaemolyticus y crecer O / N a 30 ° C, agitando.
   4. Preparar suficiente MAM grano acoplados, como se describe en el apartado 1. (Coupling). Permitir 100 ml de 10x grano Stock por pocillo.
2. Ensayo de competición:
   1. En el día de la competención experimento, medir el diámetro exterior ₆₀₀ del cultivo bacteriano.
   2. Preparar los medios de comunicación la infección mediante la dilución de cultivos bacterianos en DMEM sin color y sin aditivos, pre-calentado a 37 ° C, que contiene un 10% de suspensión / v del grano v (ya sea adhesina acoplados a perlas o cuentas de control), para dar una MOI de 10. Prepare 1 ml / pocillo y 10-20% exceso de volumen por muestra. Nota: Para las condiciones antes mencionadas (placas de 24 pocillos, V. parahaemolyticus, MOI 10), el volumen necesario de la cultura de O / N que se añade por pozo (ml / ml) se calcula como 3 / OD ₆₀₀ de la cultura. Por ejemplo, 1 ml de medio de infección se suelen contener 100 ml suspensión de perlas, unos pocos ml de cultivo bacteriano y se efectuarán hasta 1 ml con color, DMEM sin suplementar.
   3. Eliminar el medio viejo de los pocillos y lavar las células Hela cultivadas mediante la adición de 1 ml de PBS estéril pre-calentado a 37 ° C a cada pocillo.
   4. Retire PBS y añadir 1 ml de medio de infección por pocillo. También establecer controles, añadiendo soluciones containing bolas de control y bacterias (control positivo) o perlas de adhesina y no hay bacterias (controles negativos), o DMEM que contenía Triton X-100 (control de lisis, sólo es necesaria para mediciones de citotoxicidad) 0,1%.
   5. Incubar la placa en un incubador de cultivo de tejidos a 37 ° C durante la cantidad de tiempo deseada (por ejemplo, 4 hr para las mediciones de citotoxicidad o 1 hr para las mediciones de adhesión).
      Nota: Tanto la adhesión bacteriana y la citotoxicidad en células huésped se pueden utilizar como-outs para leer la eficacia de la inhibición. Si los puntos de tiempo de las mediciones de citotoxicidad y de adhesión coinciden, ambos ensayos se pueden realizar utilizando muestras del mismo pozo, ya que la citotoxicidad se determina usando los ensayos de sobrenadante de cultivo y de fijación utilizan muestras derivadas de la capa de células restante.
3. Mediciones de citotoxicidad:
   1. En los puntos de tiempo indicados (por ejemplo, después de la infección de 4 horas), retire tres veces 200 ml de cada 24 pocillos y trasladouna placa de 96 pocillos.
   2. Haga girar las placas de 96 pocillos a 1.500 xg, 5 min y transferencia de 100 ml de cada pocillo en una placa de 96 pocillos fresco. Añadir 100 ml de los medios de comunicación utilizados durante la infección experimentos a pozos frescos de la placa de 96 pocillos por triplicado (éstos serán utilizados como espacios en blanco).
   3. Llevar a cabo el ensayo deshidrogenasa (LDH) liberación de lactato utilizando un kit de detección de citotoxicidad LDH y siguiendo las instrucciones del fabricante.
      1. En pocas palabras, el cálculo de la cantidad de reactivo necesario en incrementos de 25 (por ejemplo, si 62 muestras se van a medir, conforman mezcla de reactivos suficientes para 75 etc.).
      2. Por ejemplo, para 100 muestras, mezclar 11,25 ml de reactivo A con 250 l de reactivo B. Invertir, no hacer vórtice para evitar la formación de espuma.
      3. Ponga la mezcla en un depósito para ser capaz de pipetear con una pipeta multicanal. Añadir 100 l de mezcla de reactivos a cada muestra.
      4. Incubar la placa a temperatura ambiente y leer la absorbancia a 490 nm en un lector de placas a 10, 20, 30 min.
      Analizar el conjunto de datos para el que la absorbancia de la muestra de control de lisis es alto, pero aún dentro del rango lineal del lector de placas (por lo general, 2-3 unidades de absorbancia).
   4. Expresar los resultados como% de citotoxicidad, utilizando la siguiente fórmula para la conversión:
      

Medición de la adhesión bacteriana:

1. En los puntos de tiempo indicados (por ejemplo, después de la infección de 1 hora), quitar el medio de la capa de células.
2. Lave bien la capa de células con estéril, PBS precalentado (al menos 3-4 lavados de 1 ml de PBS cada uno) para eliminar cualquier célula-un adjunto.
3. Células anfitrionas Lyse mediante la adición de 1 ml de una 1% v / v estéril Triton X-100 en PBS solución por pocillo. Incubar la placa a 37 ° C durante 5 min.
4. Pipetear cada muestra arriba y abajo varias veces antes de transferir el contenido de cada pocillo para separar tubos de 1,5 ml. Preparar 10 veces diluciones seriadas de las muestrasen PBS estéril (por ejemplo, utilizar 100 ml de muestra y 900 ml de PBS).
5. Placa 100 ml de cada muestra en agar MLB y difundir el uso de un esparcidor de células. Optimizar que diluciones a la placa en función de las cepas bacterianas y punto de tiempo. Nota: Para la configuración experimental descrito, 10 ⁵ o 10 ⁶ diluciones dan un número adecuado de UFC.
6. Incubar las placas a 37 ° CO / N y enumerar las bacterias por recuento de colonias.

Resultados

El V. parahaemolyticus adhesina MAM7 contiene siete tándem entrada de células de mamíferos (MCE) dominios implicados en el reconocimiento de receptores de la superficie acogida. Se utilizó perlas de poliestireno acopladas a recombinante, fragmentos purificados que abarca o bien todos los dominios de siete MCE tándem (MAM7) o sólo el dominio primero MCE (MAM1) para probar la capacidad de estos materiales para competir con V. parahaemolyticus célula huésped para la unión y la eficacia resultante de estos materiales como inhibidores de la adhesión. Se infectaron células HeLa con V. parahaemolyticus cepa POR1, y la citotoxicidad resultante de la infección in vitro se evaluó después de 4 horas (Figura 3). El tratamiento de células HeLa con 0,1% Triton X-100 (control de lisis positivo) dio lugar a la lisis celular completa, las células no infectadas muestran niveles muy bajos de citotoxicidad. In vitro la infección de células no tratadas con POR1 resultó en niveles muy altos de lisis celular, y esto fue inhibida por MAM7-coupled perlas pero no acoplado MAM1 o perlas de control de GST acoplada (Figura 3).

Figura 3. Caracterización de Vibrio parahaemolyticus induce citotoxicidad en células epiteliales durante ensayos de competición. Las células fueron tratadas con V. parahaemolyticus (Vp), indicados con (+) o no hay bacterias (-) en la presencia de diferentes entidades que compiten (. comp) como se indica. Entre ellos o bien no comp. (-), Perlas de MAM7 (MAM7), perlas MAM1 (MAM1) o perlas de control de GST (GST). Como controles, las células se trataron con Triton X-100 (triton, control de lisis), o se dejan sin infectar (uninf). La liberación de LDH después de 4 horas se midió como se describe en el apartado 3, y los resultados se normalizó a los controles Triton (100%) y los blancos (0%) como se ha descrito anteriormente. Los resultados son medias ± SEM de tres experimentos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La enumeración de V. parahaemolyticus unido a cualquiera de las células no tratadas Hela, o células incubadas con MAM7-, MAM1-, o bolas de control GST, reveló que MAM7 perlas pero no MAM1- o perlas de control GST outcompete V. parahaemolyticus para la fijación de acoger receptores de la superficie celular (Figura 4).

Figura 4. Caracterización de la unión bacteriana durante experimentos de competición. Se infectaron células HeLa con V. parahaemolyticus POR2 (Vp +), en ausencia (-) o presencia de competir entidades de la siguiente manera: perlas MAM7 (MAM7), perlas de MAM1 (MAM1) o perlas de control de GST (GST) (comp.). La adhesión bacteriana se midió después de 1 hora, como se describe en la sección 3. Los resultados son medias ± SEM de tres experimentos. Medios (FLTR en UFC / ml) son 2.3010 ^{6, 5} 1.5310, 2.0510 ^6, 2.1210 ^6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Adhesinas acoplados a fluoróforo marcado con perlas dan lugar a la generación de materiales que imitan la adhesión bacteriana a las células huésped y son herramientas poderosas para imágenes celulares (Figura 5). El uso de cuentas azules fluorescentes acopladas MAM7, que caracteriza el proceso de unión mediada MAM7 a las células epiteliales. La unión de MAM7 a las células huésped dio lugar a reordenamientos de actina y formación de fibras de estrés, que eran co-visualizado utilizando rodamina-faloidina para teñir de F-actina (Figura 5B).

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Figura 5. Preparación y uso de fluoróforo etiquetados perlas biomiméticos para los propósitos de formación de imágenes. (A) suspensión de perlas fluorescentes azules biomiméticos (tubo de la derecha, 10x) y tampón de control (tubo de la izquierda). (B) La unión de perlas acopladas a MAM7 Hela células resultados en reordenamientos de actina y la formación de fibras de estrés. Accesorio de cuentas azules fluorescentes y resultando de actina estrés fibras (rojo, teñidas con rodamina-phalloidin) fueron imágenes por microscopía. Bar, 10 micras. Imágenes en el panel B fueron adaptadas de Lim et al. ¹ y se reproducen bajo la licencia Creative Commons Attribution. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

En este documento, se describen dos protocolos, que se pueden utilizar para las proteínas que contienen tiol par de amina o perlas de poliestireno modificado con carboxilato, respectivamente. Debido a la facilidad del procedimiento, el acoplamiento tiol-amina es preferible, pero dependiendo de la especificación del grano deseado (diámetro, propiedades de fluorescencia), el uso de perlas de amina funcionalizada puede no ser posible y por lo tanto hemos incluido un protocolo que convertirá el carboxilato - en un resto de amina para dar el investigador la mayor flexibilidad posible en la elección de andamio. Aunque tanto tiol-amina y el trabajo de acoplamiento tiol-carboxilo para cualquier cisteína que contiene proteína, el acoplamiento direccional (es decir, la inmovilización de la proteína por su extremo N-terminal, imitando la presentación en superficie) requiere una proteína sin restos de cisteína, que se produce como una fusión GST proteína, o que contiene un único residuo de cisteína terminal de introducido por mutagénesis dirigida al sitio. Si están contenidas múltiples cisteínas reactivasdentro de la proteína, esto dará lugar a la inmovilización aleatoria que puede impedir la función de proteínas. Muchos adhesinas bacterianas no contienen cisteínas naturalmente. Para otros, estos pueden ser eliminados por mutagénesis dirigida al sitio, aunque esto requeriría ensayos extensos para asegurar la estructura y función nativa se retienen en el mutante. Para las proteínas de fusión GST, GST-tag purificado acoplado a perlas puede ser utilizado como un control negativo adecuado. El uso de cuentas no acoplados como control se debe evitar, ya que a menudo tienen una mayor tendencia a agruparse o adherirse a las células de forma no específica. Una versión simplificada del protocolo 1.2., Usando sólo EDC, se puede utilizar para proteínas par de perlas de polímero funcionalizado con carboxilo, sin embargo en este caso el acoplamiento tiene lugar a través de aminas primarias en la proteína y por lo tanto no garantiza acoplamiento direccional.

TCEP como agente reductor no debe ser reemplazado con otros agentes reductores disponibles comercialmente y usados ​​comúnmente, tales como dithiothreitol (DTT) o 2-mercaptoetanol (BME), como los tioles contenidas dentro de ellos competirán con acoplamiento de proteínas en la etapa de acoplamiento tiol-maleimida. PBS se puede sustituir por otros tampones, pero con las siguientes consideraciones: Buffers no puede contener aminas primarias (SO tampones Tris-que contienen no son adecuados). El uso de tampones que contienen (<10 mm) muy bajas concentraciones de sal conduce a talón aglutinación y también debe ser evitado. Pureza proteína es también un factor importante a considerar durante este procedimiento, y para conseguir datos de alta calidad, deben utilizarse proteínas puras. Rutinariamente purificar proteínas en varios pasos, incluyendo al menos una etapa de purificación de afinidad y filtración en gel, pero en algunos casos cromatografía de intercambio iónico se hace como un tercer paso. Como resultado, la pureza de las proteínas utilizadas para el acoplamiento es por lo general 90% o superior, como se juzga por SDS-PAGE.

Se recomienda para determinar las concentraciones de proteína tanto en la mezcla de reacción inicial, así como de THe sobrenadante después de la finalización de la reacción. Esto ayudará a determinar la concentración aparente de la proteína del grano de acoplamiento, y por lo tanto la densidad de acoplamiento. Determinación de ambos valores también permitirá el cálculo de la eficiencia de acoplamiento. Esto puede ser tomado en cuenta cuando se prepara la solución de proteína inicial en reacciones subsiguientes, para lograr la densidad y la concentración de acoplamiento final deseado. Reactivo de Bradford es particularmente adecuado para la determinación de la concentración de proteína antes y después de la reacción de acoplamiento, como ninguna de las sustancias en la reacción interfiere con la formación de complejo de colorante a las concentraciones utilizadas. Si las concentraciones de proteína inferiores se van a utilizar, este método puede tener que ser sustituido por un método de detección más sensible, sin embargo tiene que ser pagado atención al hecho de que tiene que ser compatible con las sustancias contenidas dentro de la reacción de acoplamiento. También se recomienda el uso de reactivos recién preparados y manipular reactivos en polvo con cuidado (por ejemplo, almacenaren un recipiente sellado y usar perlas de sílice, para evitar los reactivos dibujo de humedad), ya que la calidad de los reactivos puedan influir en la eficiencia de acoplamiento. Si la eficacia de acoplamiento es menor de lo esperado, los posibles remedios incluyen el aumento de las concentraciones iniciales de cuentas y proteínas. Si se utilizan concentraciones más altas, la concentración de reactivos de acoplamiento tiene que ser aumentada proporcionalmente para asegurar suficiente exceso molar. Modificación de las concentraciones de grano / proteína suele ser una mejor paso hacia la optimización en lugar de aumentar los tiempos de reacción. Dado que los protocolos para el acoplamiento del grano son largos, que comúnmente preparamos un gran lote de material. Las alícuotas de la suspensión pueden congelar complemento en nitrógeno líquido y se almacenaron a -20 ° C durante varios meses. Alícuotas descongeladas no deben volver a congelarse y deben mantenerse a 4 ° C y utilizarse dentro de 1-2 días. Sin embargo, esto puede variar con la naturaleza y la estabilidad de la proteína usada como debe ser probado en un pequeño lote inicialmente.

adhesinas acoplados-Bead se puede utilizar para muchas aplicaciones, como veremos a continuación. Este protocolo describe un ensayo que se utiliza comúnmente para medir la inhibición de la citotoxicidad y de unión mediada por patógeno bacteriano en células huésped. El ensayo se realiza comúnmente para medir la capacidad de MAM de talón de acoplamiento para inhibir competitivamente la infección de células epiteliales HeLa con la comida de mar de patógenos transmitidos por Vibrio parahaemolyticus, utilizando ya sea una disminución de la unión bacteriana a las células huésped o se reduce la citotoxicidad como una lectura de salida . En ambos casos, los ensayos de preparación y de competencia siguen el mismo protocolo. Dependiendo de la lectura, diferentes cepas de V. parahaemolyticus se están utilizando: la cepa citotóxico POR1 se utiliza para las mediciones de citotoxicidad, mientras que la cepa no citotóxico POR2 se utiliza para medir la adhesión bacteriana, ya que la muerte celular y desprendimiento celular compromete el procedimiento para la cuantificación de bacterias adheridas.

Inicialmente, compeexperimentos compe- se establecieron como un protocolo por etapas, donde las células anfitrionas fueron pre-incubadas con los granos antes de la adición de bacterias. Para V. parahaemolyticus y las especificaciones de talón utilizados (2 micras perlas acopladas a MAM7), ambos talones y las bacterias se pueden añadir al mismo tiempo sin cambios en la citotoxicidad resultante. Es decir, en esta configuración experimental, perlas de outcompete bacterias para la unión de la célula huésped. Dependiendo de la especie bacteriana y de talón geometría utilizada, puede haber buenas razones para mantener la adhesión del grano y la infección bacteriana como dos pasos separados. Por ejemplo, para infectar células con bacterias no móviles, las placas se centrifugan comúnmente después de la adición de los medios de infección. Sin embargo, la centrifugación de las placas que contienen suspensiones de perlas debe evitarse, ya que esto conduce a una distribución muy irregular de los granos en la capa de células. Si se utilizan tamaños de partículas más pequeñas, cuentas tardarán más en asentarse en la superficie celular, en cuyo caso sutiempo ficiente se debe permitir para reborde de unión antes de la infección. Cuando se utiliza la adhesión bacteriana como leer, las muestras deben ser tomadas en momentos en que las células huésped no se dañen de manera significativa por la cepa infectante, como desprendimiento de células y lisis puede comprometer la cuantificación de bacterias adheridas.

En lugar de enumerar la adhesión bacteriana por dilución en placas, muestras, alternativamente, se pueden procesar para formación de imágenes (Figura 5). En este caso, las células de cultivo de tejidos deben ser sembradas en cubreobjetos de vidrio, en vez de directamente en los pozos. Además, perlas fluorescentes y las bacterias que expresan una proteína fluorescente se pueden utilizar, junto con marcadores de células huésped de la infección específica. Por ejemplo, experimentos de competición se crean imágenes comúnmente usando rojo fluorescente rodamina-phalloidin a manchar la actina del citoesqueleto de las células huésped 'y evaluar los cambios morfológicos que resultan de la infección, junto con los granos azules fluorescentes y fluorescentesverde (GFP expresar o SYTO18 manchado) bacterias.

Una gama de adhesinas de talón de acoplamiento, incluyendo Staphylococcus aureus FnBPA, Streptococcus pyogenes F1 FUD y Vibrio parahaemolyticus MAM, se han utilizado como materiales biomiméticos para estudiar la adhesión, inhibición de la adhesión y la contribución de adhesión al patógeno citotoxicidad mediada ^{1, 7, 8.} Una de las ventajas de la utilización de este enfoque es la facilidad de la visualización de los acontecimientos de fijación, ya que las perlas de polímero utilizados como andamios están disponibles en una amplia gama de colores (por ejemplo, azul, rojo fluorescente, azul, verde, naranja). Por lo tanto, el etiquetado directo de proteína, que puede interferir con la función, se puede evitar. Además, la superficie de acoplamiento imita la pantalla multivalente de adhesinas en la superficie bacteriana, lo que refleja una conformación más fisiológicamente relevantes en comparación con las proteínas solubles.

En comparación con los estudios que utilizan las bacterias intactas o bacteriAL mutantes, el enfoque del grano elude los problemas asociados con el crecimiento bacteriano. Por ejemplo, a más largo plazo (por ejemplo, O / N) estudios de la adhesión bacteriana a las células huésped utilizando bacterias intactas a menudo comprometida por los fenómenos que acompañan el crecimiento bacteriano - acidificación del agotamiento del medio de crecimiento y nutrientes afectar negativamente a las células huésped, y la replicación bacteriana compromete con el tiempo calidad de imagen.

Más recientemente, el uso de adhesinas de talón de acoplamiento se ha extendido para incluir su uso como herramientas para purificaciones de afinidad de los factores del huésped celular implicados en los procesos aguas abajo de la unión bacteriana de señalización. V. parahaemolyticus MAM7, a través de la unión a ácidos fosfatídicos en la membrana de la célula huésped, provoca la activación de RhoA y actina reordenamientos ^{1, 3.} perlas de MAM acoplado se utilizan para purificar e identificar proteínas implicadas en las plataformas de señalización ensamblados como consecuencia de célula MAM-anfitrión Unión. Desde cuentas puedefácilmente separarse del sobrenadante mediante una etapa de centrifugación corta, y la proteína de interés se acopla covalentemente, este es un buen método para conseguir la separación de las proteínas contaminantes y enriquecer los complejos de proteínas relevantes, que se puede utilizar para aplicaciones posteriores tales como la proteómica o Western secante.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Reactivos
Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP)	Sigma		646547 Peligro; corrosivo se puede comprar como solución o recién preparado
Sulfosuccinimidil 4-(p-maleimidofenil)butirato (Sulfo-SMPB)	Fisher		PN22317 Peligro;
tóxico L-cisteína	Sigma	30089	Peligro; tóxico
Perlas de látex, poliestireno modificado con aminas, azul fluorescente - suspensión acuosa, 2.0  μ m tamaño medio de partícula	Sigma	L0280	nocivo; una gama de tamaños y colores de partícula alternativos está disponible
1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC)	Thermo scientific	22980
N-hidroxisuccinimida (NHS)	Thermo scientific	24500
Perlas de poliestireno modificado con carboxilato	Sigma	CLB9	nocivo; una gama de tamaños y colores de partícula alternativos
está disponible Etilendiamina	Sigma	E26266	Peligro; inflamable, corrosivo, tóxico, sensibilizante
Albúmina sérica bovina (BSA)	Promega	W3841
Bradford reactivo	Sigma	B6916	Peligro; corrosivo y tóxico
Dulbecco' s Águila Modificada' s Glucosa media - alta - Con 4.500 mg/L de glucosa y bicarbonato de sodio, sin  L-glutamina, piruvato de sodio y rojo de fenol, líquido, filtrado estéril, apto para el cultivo celular	Sigma	D1145	para experimentos de infección
DMEM	Sigma	D6429	para el mantenimiento de células huésped cultivadas
Suero bovino fetal, inactivado por calor	Sigma	F9665	suplemento para medio
de cultivo de tejidosPenicilina-Estreptomicina - Solución estabilizada, con 10.000 unidades de penicilina y 10  mg de estreptomicina/mL, filtrado estéril, Biorreactivo, apto para cultivo celular	Sigma	F9665	suplemento para medio de cultivo
de tejidos PBS	Sigma	D8537
LDH Kit de detección de citotoxicidad	Takara	MK401
Depósitos de reactivos de
	Greiner	662160
Placas de 96 pocillos	Greiner	655182
Equipment hemocitómetro
microcentrífuga
Pipeta