Este artículo presenta dos protocolos: uno para medir las bacterias anaeróbicas que pueden invadir y sobrevivir con éxito dentro del huésped, y el otro para visualizar las bacterias anaeróbicas interactuando con las células huésped. Este estudio se puede aplicar a cualquier anaerobio cultivable y a cualquier tipo de célula eucariota.
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Artículo de método
Porphyromonas gingivalis como organismo modelo para la evaluación de la interacción de bacterias anaerobias con células huésped
En este artículo
Resumen
Resumen
Las bacterias anaerobias son mucho más numerosos aerobios en muchos nichos humanos, como el intestino, la boca y la vagina. Además, las infecciones anaeróbicas son comunes y con frecuencia de origen indígena. La capacidad de algunos patógenos anaeróbicos para invadir las células humanas les da medidas de adaptación para escapar de la inmunidad innata, así como para modular el comportamiento de la célula huésped. Sin embargo, lo que garantiza que las bacterias anaerobias son en vivo durante la investigación experimental de los eventos puede plantear desafíos. Porphyromonas gingivalis, un anaerobio Gram-negativas, es capaz de invadir una variedad de células no fagocíticas eucariotas. En este artículo se describe cómo con éxito la cultura y evaluar la capacidad de P. gingivalis para invadir las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC). Se desarrollaron dos protocolos: uno para medir las bacterias que pueden invadir y sobrevivir con éxito dentro del huésped, y el otro para visualizar las bacterias que interactúan con las células huésped. Estas técnicas requieren el uso de un anaeRobic cámara para suministrar P. gingivalis con un ambiente anaeróbico para un crecimiento óptimo.
El primer protocolo se basa en el ensayo de protección a los antibióticos, que se utiliza en gran medida para estudiar la invasión de células huésped por bacterias. Sin embargo, el ensayo de protección de antibiótico es limitada; sólo las bacterias intracelulares que son cultivables tras el tratamiento antibiótico y la lisis de la célula huésped se miden. Para evaluar todas las bacterias que interactúan con las células huésped, tanto vivas y muertas, hemos desarrollado un protocolo que utiliza la microscopía de fluorescencia para examinar la interacción huésped-patógeno. Las bacterias se marcaron fluorescentemente con 2 ', 7'-bis- (2-carboxietil) -5- (y-6) carboxifluoresceína acetoximetilo éster (BCECF-AM) y se utiliza para infectar las células eucariotas bajo condiciones anaeróbicas. Después de la fijación con paraformaldehído y permeabilización con 0,2% Triton X-100, las células huésped se etiquetan con TRITC faloidina y DAPI para etiquetar el citoesqueleto de la célula y el núcleo, respectivamente. Múltiple images tomadas en diferentes puntos focales (Z-pila) se obtienen para la visualización temporal-espacial de las bacterias. Los métodos utilizados en este estudio se pueden aplicar a cualquier anaerobio cultivable y cualquier tipo de célula eucariota.
Introducción
Las bacterias anaerobias colonizan casi todas las superficies del cuerpo humano. Aunque predominante en la flora de los tractos intestinales y genitourinarias, donde las concentraciones de oxígeno son bajos, sino que también existen en altos niveles en la piel, la boca, la nariz y la garganta 1. Las bacterias anaerobias son una causa común de infecciones endógenas y se aíslan con frecuencia de sitios enfermos. Sin embargo, debido a su naturaleza fastidioso, anaerobios pueden ser difíciles de aislar y cultivar. Los estudios que incluyen bacterias anaerobias deben realizarse bajo condiciones restringidas. Técnicas anaeróbica de cultivo modernos permiten a lo....
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Protocolo
Los siguientes protocolos se describen métodos para el cultivo y el estudio de la invasión por las especies anaerobias, P. gingivalis; sin embargo, estos protocolos pueden ser utilizados para una serie de patógenos anaerobios. Aunque se utilizan HUVECs, este protocolo puede ser utilizado para otras células eucariotas, tanto inmunes y no inmunes.
1. anaeróbico Cámara de uso y mantenimiento
Nota: P. gingivalis es un anaerobio sensible a los niveles normales de oxígeno encontrado en el aire ambiente. Un ambiente anaeróbico controlado es vital para el cultivo de P. gingivalis.
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Resultados
Protocolos mencionados anteriormente fueron utilizados en el estudio de la interacción huésped-patógeno entre P. gingivalis y las células endoteliales. P. gingivalis W83 y P. gingivalis V3150 que porta una deleción de PG0228 se utilizaron en el estudio. El PG0228 se prevé para codificar una proteína que puede alterar los niveles de ARN y proteínas, lo que puede afectar en última instancia interacción de P. gingivalis con células huésped. Para investigar el efecto de la PG0228.......
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Discusión
Todos los métodos anteriores se pueden utilizar para diseñar ensayos específicos para evaluar la interacción de las bacterias anaeróbicas con células eucariotas. Sin embargo, hay varias consideraciones para realizar con éxito los experimentos. Primero están los cepas microbianas para ser utilizados en un estudio.
Es crucial en la comparación de dos cepas tanto con el ensayo de supervivencia así como por análisis de microscopía de que están en fases de crecimiento similares y alcanzan concent.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer al Dr. Hiroshi Miyazaki, al Dr. Scott Henderson, al Dr. Todd Kitten, al Dr. Justin Hutcherson, a la Dra. Catherine Jauregui y a Collin R. Berry. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de NIH NIDCR R01DE016124, R01DE018039 y R01DE023304 a J.P. Lewis.
Microscopía se realizó en el Centro de Microscopía del Departamento de Anatomía y Neurobiología de la VCU, financiada, en parte, con fondos de la subvención central del Centro NIH-NINDS (5P30NS047463).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cámara anaeróbica de vinilo-tipo B | de laboratorio Coy Modelo | 2000 incubadora | |
| TSA II Agar Tripticasa de Soja con 5% de Sangre de Oveja | BBL | 221261 | |
| Células endoteliales de la vena umbilical humana Pool de 10 donantes | Tecnología LifeLine | FC-0044 | |
| VascuLife VEGF Medio Kit completo | Tecnología LifeLine | LL-0003 | |
| TrypKit | LifeLine | LL-0013 | |
| Saponina | Riedel-de Haen | 16109 | |
| Sal de sulfato de gentamicina | Sigma-Aldrich | G-1264 | |
| metronidazol | Sigma-Aldrich | M-3761 | |
| BCECF-AM | LifeTechnologies | B1150 | |
| TRITC Phalloidin | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| 18 mm Cubreobjetos | circulares Microscopía Electrónica Ciencias | 72222-01 | |
| Medio de montaje VectaShield con DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
Referencias
- Hentges, D. J. The Anaerobic Microflora of the Human Body. Clin. Infect. Dis. 16 (4), S175-S180 (1993).
- Willis, A. T. Anaerobic bacteriology: clinical and laboratory practice. , (2014).
- Wren, M. W., Baldwin, A. W., Eldon, C. P., Sanderson, P. J.
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Reimpresiones y permisos
