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Summary

Este manuscrito describe un método simple y de alto rendimiento para el montaje de las proteínas solubles en agua con pigmentos hidrófobos que se basa en las emulsiones de agua-en-aceite. Se demuestra la eficacia del método en el montaje de las clorofilas nativas con cuatro variantes de soluble en agua-clorofila recombinante de unión a proteínas (WSCPs) de las plantas de Brassica expresan en E. coli.

Abstract

Clorofilas (Chls) y bacterioclorofilas (Bchls) son los co-factores principales que llevan a cabo la recolección de luz fotosintética y de transporte de electrones. Su funcionalidad depende críticamente de su organización específica dentro de los complejos de proteínas de múltiples subunidades transmembrana grandes y elaborados. A fin de comprender a nivel molecular cómo estos complejos facilitan la conversión de energía solar, es esencial para comprender la proteína de pigmento, y las interacciones de pigmento en pigmentos, y su efecto sobre la dinámica excitados. Una forma de obtener este entendimiento es mediante la construcción y el estudio de complejos de Chls con proteínas recombinantes simples solubles en agua. Sin embargo, la incorporación de los Chls lipófilos y Bchls en proteínas solubles en agua es difícil. Por otra parte, no existe un método general, que podría ser utilizado para el montaje de las proteínas solubles en agua con pigmentos hidrófobos. Aquí, demostramos un sistema simple y rendimiento alto a base de emulsiones de agua en aceite, que permite culoembly de las proteínas solubles en agua con Chls hidrófobos. El nuevo método fue validado mediante el ensamblaje de las versiones recombinantes de la proteína de unión a la clorofila soluble en agua de plantas Brassicaceae (PCSW) con Chl a. Demostramos el montaje exitoso de Chl a utilizando lisados ​​crudos de E. expresan PCSW células coli, que puede utilizarse para el desarrollo de un sistema de pantalla genética para nuevas proteínas de unión a Chl solubles en agua, y para el estudio de interacciones proteína-Chl y procesos de montaje.

Introduction

pigmentos hidrófobos tales como las clorofilas (Chls), bacterioclorofilas (Bchls) y los carotenoides son los cofactores primarios en los centros de reacción fotosintéticos y proteínas de recolección de luz que llevan a cabo el transporte de electrones, y la captura de energía de la luz y la transferencia. Los centros de reacción y la mayor parte de los complejos de recolección de luz Chl-de unión son proteínas transmembrana. La proteína Fenna-Matthews-Olson (FMO) de la bacteria fotosintética verde-azufre no oxigénica ^1,2, y la proteína peridinina-Chl (PCP) de dinoflagelados ³ son ejemplos excepcionales de proteínas solubles en agua captadores de luz. La unión de clorofila proteínas solubles en agua (WSCPs) de Brassicaceae, Polygonaceae, Chenopodiaceae y plantas Amaranthaceae ^{4, 5} son otro ejemplo único, sin embargo, en contraste con FMO y el PCP, éstos no son ni involucrarse en recolección de luz ni en ninguna de la reacción fotosintética primaria y su grafía precisasiological funciones todavía no están claros ^5-8. Su alta afinidad de unión a Chl han dado lugar a una función sugerido como portadores transitorios de Chls y derivados de Chl ^9,10. Alternativamente, se planteó la hipótesis de que PCSW juega un papel en los basureros Chls en las células dañadas y protege contra el daño foto-oxidativa inducida por Chl ^7,11-13. Más recientemente, se sugirió que las funciones PCSW como un inhibidor de la proteasa y desempeña un papel en la resistencia herbívoro, así regula la muerte celular durante el desarrollo de la flor ^14. WSCPs se dividen en dos clases principales de acuerdo con sus propiedades fotofísicas. La primera clase (clase I, por ejemplo. De Chenopodium album) puede someterse a fotoconversión tras la iluminación. WSCPs Clase II de las plantas del género Brassica, que no sean objeto de fotoconversión ^5,10, se subdividen en la clase IIa (por ejemplo., De Brassica oleracea, Raphanus sativus) y IIb (por ejemplo., De Lepidium virginicum </em>). La estructura de clase IIb PCSW de Lepidium virginicum fue resuelto por cristalografía de rayos X a una resolución de 2,0 Å ^8. Revela un homotetrámero simétrica en la que las subunidades de la proteína forman un núcleo hidrófobo. Cada subunidad se une una sola Chl que se traduce en una disposición apretada de cuatro Chls estrechamente empaquetados dentro de los core.This sencilla todo disposición Chl hace WSCPs un sistema modelo potencialmente útil para el estudio de unión y ensamblaje de complejos Chl-proteína, y los efectos de la vecina Chls y entornos de proteínas en las propiedades espectrales y electrónicas de Chls individuales. Además, se puede proporcionar plantillas para la construcción de proteínas de unión a Chl artificiales que pueden ser utilizados para los módulos de captación de luz en dispositivos fotosintéticos artificiales.

Estudios rigurosos de WSCPs nativos no son factibles debido a que los complejos purificados de plantas siempre contienen una mezcla heterogénea de tetrámeros con diferentes combinaciones de Chl ay Chl b ^9. Por lo tanto, se requiere un método para el montaje de WSCPs expresadas de forma recombinante con Chls in vitro. Este es desafiada por la insignificante solubilidad en agua de Chls que hace imposible ensamblar el complejo in vitro mezclando simplemente las apoproteínas solubles en agua con pigmentos en soluciones acuosas. Ensamblaje in vitro mediante la mezcla de las apoproteínas con membranas tilacoides ¹⁵ se demostró, pero este método se limita a la nativa Chls presente en los tilacoides. Schmidt et al. informaron sobre el montaje de varios derivados de Chl y BChl con PCSW de la coliflor (CaWSCP) mediante la expresión de una proteína recombinante marcado con histidina en E. coli inmovilizándolo en una columna de Ni-afinidad y la introducción de derivados de Chl solubilizan en detergentes ^11. Con éxito la reconstitución de WSCPs recombinantes a partir de A. ⁶ thaliana, y las coles de Bruselas (BoWSCP), rábano japonés salvaje (RshWSCP) unaTambién se informó d Virginia pepperweed (LvWSCP) por un método similar.

A continuación, presentamos una novela, método general y directa para el montaje de Chls con PCSW que no requiere etiquetado o la inmovilización de las proteínas. Se basa en la preparación de emulsiones de sus soluciones acuosas de los apoproteínas solubles en agua en aceite mineral. Las proteínas se encapsulan por lo tanto en agua-en-aceite (W / O) microgotas con muy alta relación de superficie a volumen ^16. Los cofactores hidrofóbicos se disuelven en el aceite y se introducen fácilmente en las gotitas de la fase de aceite. Se presenta sobre el uso del método para el montaje de varias variantes de apoproteínas PCSW recombinante expresadas en E. coli con Chl a. Se demuestra el conjunto de lisado crudo de bacterias PCSW sobreexpresan que pueden ser utilizados como un sistema de detección para el desarrollo de nuevas proteínas de unión de Chl.

Protocol

1. Preparación de Chl un Colección de Soluciones Paso crítico: Realizar todos los pasos de la preparación de clorofila en una campana química, bajo la luz verde (520 nm) o en la oscuridad con el fin de minimizar el daño solar. Siempre agregue nitrógeno o argón antes de congelar los pigmentos para el almacenamiento. Asegúrese de que todos los disolventes son de calidad analítica. Pesar aproximadamente 5 mg de Spirulina platensis células liofilizadas u otras células que contienen sólo cianobacteria Chl a en las membranas tilacoides y aplastar usando un mortero y una mano de mortero. Cargar las células trituradas en una columna de vidrio y se lava con aproximadamente 50 a 100 ml de acetona al 100% con el fin de eliminar los carotenoides. Desechar la fracción naranja / verde eluido. Nota: Si la fracción de naranja no se eluye con 100 ml de acetona seguir lavando las células con acetona hasta fracción verde empieza a eluir. Acetona intercambio con metanol al 100% y recoger la fracción verde que contiene clorofila a. El volumen de eluido fraction puede variar entre 50-100 ml. Al principio, la fracción eluida tiene un color verde oscuro, que cambia en color verde pálido al final de la elución. Cuando el color de la fracción eluida se convierte en verde pálido detener la elución. Se evapora el metanol en el evaporador rotativo hasta que el extracto esté completamente seco. No aplique calor a la solución; asegúrese de que la temperatura del baño de agua del evaporador no supera los 30 ° C. Nota: El tiempo de evaporación depende del volumen de la fracción de metanol se evapora y puede variar entre 10 a 60 min. Es importante secar el extracto completo. Disolver los pigmentos del extracto se seca en un pequeño volumen de éter dietílico (alrededor de 5 a 10 ml), y filtrar a través de lana de algodón. Asegúrese de que los pigmentos se disuelven completamente en éter antes de filtrar. Se evapora el éter dietílico hasta que los pigmentos estén completamente secas (10-30 min). Nota: Los pigmentos secos se pueden purgar con y mantenerse bajo nitrógeno o argón a -20 ° C, en la oscuridad hasta su posterior procesamiento. Disolver los pigmentos secos en el menor volumen posible de 100% de metanol (alrededor de 1 ml), incluso si no todo está completamente suspendida. Añadir 4 ml de acetona a la solución, y la película de la copa suavemente con el fin de disolver completamente los pigmentos. Utilizando una pipeta Pasteur, la carga de la muestra con cuidado sobre una columna de DEAE Sepharose equilibrada en 100% de acetona. carotenoides (eluir una banda de color naranja-amarillo) con acetona al 100%. A continuación, se eluye Chl a (banda verde) con mezcla 3: 1 v / v de acetona / metanol. Nota: El volumen de acetona y la mezcla de acetona / metanol es aproximadamente equivalente al volumen de DEAE Sepharose se cargó en la columna. Verificar Chl una pureza por cromatografía en capa fina utilizando un 68: 25: 5: 2 de diclorometano / n-hexano / isopropanol / metanol (v / v) como eluyente una mezcla 17. Se evapora el disolvente utilizando un evaporador rotatorio hasta que la Chl a está completamente seco (10-60 min). Nota: El Chl seco una se puede purgar con nitrógeno o argón y se almacenó bajo atmósfera de argón a -20 ° C en la oscuridad. Preparar Chl una solución de stock de volver a disolver el seco Chl a en 2-4 ml de etanol al 100%. Nota: El coeficiente de extinción de Chl a en 663 nm es 74.400 cm-1 M-1 (83,3 cm-1 (mg / ml) -1) en etanol. Una solución de reserva típica debe tener un diámetro exterior de 1860 correspondiente a una concentración de 25 mM (23 mg / ml). La adición de 20 l de esta población a una emulsión que contiene 5 ml de la fase orgánica, y 1 mg de PCSW en 1 ml de los resultados de la fase acuosa en una mezcla con un exceso molar de 10 veces de la Chl a vs. PCSW. 2. Preparación de la fase orgánica de la emulsión Nota: La fase orgánica de la emulsión se compone de aceite mineral que contiene 4,5% (v / v) Span 80, y 0,4% (v / v) de Tween 80. Pesar en un tubo de 50 ml 0,2 g de tween 80, 1,8 g de Span 80, y 38 g de aceite mineral. Mezclar bien todos los componentes y enfriar en hielo. Nota: La fase orgánica se puede almacenar en 4 ° C durante hasta una semana. 3. Preparación de la fase acuosa de la emulsión Nota: La fase acuosa de la emulsión puede estar compuesta de cualquiera de PCSW purificada o extracto crudo de bacterias que sobreexpresan PCSW. Preparar una fase acuosa que contiene PCSW purificada. Crecer bacterias BL21 de E. coli que contiene el plásmido PCSW 12 en 1 l de medio LB a 37 ° C hasta que la DO de desde 0,3 hasta 0,6. Inducir la expresión de proteína mediante la adición de IPTG 1 mM. Después de la inducción crecer las bacterias a 30 ° C durante 12-16 horas. Cosecha bacterias por centrifugación a 5.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Disolver el precipitado en tampón de unión y se somete a ultrasonidos en hielo (30 segundos en 15 segundos fuera, cinco veces). Usar 10 ml de tampón para el sedimento obtenido a partir de centrifugación de 250 ml demedio LB con células que sobreexpresan la proteína. Nota: Dependiendo del método de purificación, el tampón de unión puede estar compuesta de tampón fosfato 100 mM, pH 7,2 o Tris 50 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM, EDTA 5 mM. Centrifugar el lisado de células a 12.000 xg durante 30 min a 4 ° C. Se purifica mediante cromatografía de afinidad PCSW. Dependiendo de la etiqueta fusionado a PCSW, purificar proteínas recombinantes utilizando el sistema de cromatografía de afinidad comercialmente disponible adecuado para la purificación de proteínas siguiendo las instrucciones del fabricante. Para la preparación de la emulsión, utilizar PCSW purificada en tampón fosfato 50 mM, pH 7,8. Asegúrese de que la cantidad final de proteína utilizada para la reconstitución es de 0,5-1,0 mg por 1 ml de tampón. Preparar una fase acuosa que contiene lisado bacteriano bruto con PCSW. Se cultivan las células BL21 de E. coli que contienen el plásmido que expresa PCSW en 250 ml de medio LB a 37 ° C hasta que OD desde 0,3 hasta 0,6. Inducir la expresión de proteína con1 mM de IPTG y hacer crecer las bacterias durante la noche a 30 ° C. células bacterianas de la cosecha por centrifugación a 5000 xg durante 10 min a 4 ° C. Disolver el precipitado en 1 a 2 ml de 50 mM de tampón de fosfato de sodio de pH 7,8, se somete a ultrasonidos (30 seg en, 15 seg apagado, tres veces) y se centrifuga a 12.000 xg durante 30 min a 4 ° C. Preparar la fase acuosa de la emulsión mediante la mezcla de 0.125 ml de sobrenadante con 0,875 ml de tampón de fosfato de sodio 50 mM pH 7,8. 4. Montaje de PCSW con Chl a en Emulsión Transferencia de 5 ml de la mezcla de aceite-agente tensioactivo en un vial de vidrio y enfriar en hielo. Antes de pipeteado, compruebe que todos los componentes de la fase orgánica se mezclan a fondo y no hay separación de fases entre tensioactivos y aceite mineral. Añadir 1 ml de fase acuosa enfriada con hielo preparadas como en la sección 3 a 5 ml de fase orgánica. Mezclar las dos fases utilizando un homogeneizador de tejidos durante 2 minutos a 9500 rpm en hielo. Paso crítico: A partir de esta etapa, realice todos los pasos siguientes menores de luz verde (520 nm) con el fin de minimizar el daño solar. Añadir 20 l de Chl 25 mM de una solución de reserva (véase la sección 1.13) a la emulsión. Se dispersa con un movimiento rápido e invirtiendo el vial de vidrio. Asegúrese de que la Chl se distribuye uniformemente en la emulsión. Incubar la emulsión durante 1-2 horas en hielo en la oscuridad. Con el fin de romper la emulsión y las gotitas de agua separados de la fase orgánica Se transfiere la emulsión a tubos de plástico de 1,5 ml y centrifugar a 14.000 xg durante 5 min a temperatura ambiente. Nota: Si el conjunto tiene éxito, la fase acuosa inferior debe tener un color verde. Desechar la fase superior de aceite y añadir 1 ml de aceite mineral. Mezclar bien el aceite mineral con la emulsión sedimentaron por vórtice o volteando el tubo a fondo. Centrifugar la muestra a 14.000 xg durante 5 min a temperatura ambiente. Repita este paso hasta que un menisco clara separación de la fase acuosa y la minerafases de aceite al, sin ningún tipo de emulsión intermedia se obtiene. Realice este paso en una campana química. Después de las fases de aceite y minerales acuosos están claramente separadas, eliminar el aceite mineral y añadir 1 ml de éter dietílico saturado de agua. Vortex y centrifugar la muestra a 14.000 xg durante 5 min a temperatura ambiente. Repita este paso dos veces. Después de la segunda centrifugación, eliminar el éter dietílico y dejar los tubos abiertos de 5-20 minutos en la campana. Por último, la carga de la fase acuosa que contiene el PCSW / Chl un complejo en una columna de desalado y se eluye con tampón apropiado para experimentos adicionales. Nota: La proteína es estable en tampones fosfatos y tris en una amplia gama de pH (6,0 a 7,5). La muestra se puede almacenar a 4 ° C protegido de la luz hasta un mes.

Representative Results

Apoproteínas PCSW recombinantes se montan con Chl a en emulsiones W / O de acuerdo con el protocolo descrito en la sección anterior. El protocolo fue implementado utilizando fases acuosas que contienen ya sea WSCPs puros, o lisados ​​de E. coli que sobreexpresan células PCSW (Figura 1). El protocolo es simple, rápido y no requiere ningún equipo especial excepto un homogeneizador de tejidos. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-pa…

Discussion

Nuestro objetivo era desarrollar un nuevo sistema general de ensamblaje de las proteínas de unión a la clorofila-solubles en agua con pigmentos hidrofóbicos. Aquí se demuestra que el nuevo sistema basado en la reconstitución de emulsión W / O es un enfoque general demostrado que funciona para el montaje de apoproteínas PCSW de las coles de Bruselas, coliflor, rábano picante japonés y pepperweed Virginia recombinante expresado en E. coli. Aquí se presentan los resultados de la reconstitución de 1 mg d…

Materials

Mineral oil	Sigma	M5904
Span80	Sigma	85548
Tween80	Sigma	P8074
Bio-Scale Mini Profinity eXact Cartridges	Bio Rad	10011164	Affinity chromatography for WSCP purification with native sequence.
His Trap HF column	GE Healthcare Life Science	17-5248-02	Affinity chromatography for WSCP purification with His-tag
DEAE Sepharose Fast Flow	GE Healthcare Life Science	17-0709-01	Chromatography medium for chlorophyll purification