Los enfoques experimentales para estudiar mitocondrial localización y función de un ciclo celular quinasa nuclear, Cdk1

Summary

Aquí, describimos cómo estudiar la localización mitocondrial de una quinasa (ciclo celular) y cómo determinar su ubicación submitocondrial, así como los posibles sustratos/objetivos mitocondriales. La expresión forzada de proteínas en las mitocondrias proporciona una herramienta útil para estudiar las consecuencias funcionales de la localización mitocondrial de una proteína de interés.

Abstract

Aunque las mitocondrias poseen su propia maquinaria transcripcional, solo el 1% de las proteínas mitocondriales se sintetizan dentro del orgánulo. Las proteínas codificadas nuclear se transportan a las mitocondrias guiadas por sus secuencias de diana mitocondriales (MTS); sin embargo, la mayoría de las proteínas mitocondriales localizadas carecen de un MTS identificable. Sin embargo, el hecho de que el MTS pueda instruir a las proteínas para que entren en las mitocondrias proporciona una herramienta valiosa para estudiar las funciones mitocondriales de las proteínas normalmente nucleares y/o citoplasmáticas. Recientemente hemos identificado el complejo ciclina quinasa del ciclo celular ciclina B1/Cdk1 en las mitocondrias. Para estudiar específicamente las funciones mitocondriales de este complejo, fue esencial la sobreexpresión mitocondrial y la eliminación de este complejo sin interferir con sus funciones nucleares o citoplasmáticas. Al marcar CyclinB1/Cdk1 con MTS, pudimos lograr la sobreexpresión mitocondrial de este complejo para estudiar sus objetivos mitocondriales, así como sus funciones. A través del marcaje de Cdk1 dominante negativo con MTS, se logró la inhibición de la actividad de Cdk1 particularmente en las mitocondrias. Los posibles objetivos mitocondriales del complejo CyclinB1/Cdk1 se identificaron utilizando un enfoque proteómico basado en gel. A diferencia del análisis en gel 2D tradicional, empleamos la tecnología de electroforesis en gel de diferencia bidimensional (2D-DIGE) seguida de tinción de fosfoproteínas para marcar con fluorescencia proteínas fosforiladas diferencialmente en células mitocondriales que expresan Cdk1. La identificación de manchas de fosfoproteínas que estaban alteradas en las mitocondrias de tipo salvaje frente a las mitocondrias dominantes negativas portadoras de Cdk1 reveló la identidad de los objetivos mitocondriales de Cdk1. Por último, para determinar el efecto de la localización mitocondrial de CyclinB1/Cdk1 en la progresión del ciclo celular, se utilizó un ensayo de proliferación celular utilizando un análogo sintético de timidina EdU (5-etinil-2′-desoxiuridina) para monitorizar las células a medida que atraviesan el ciclo celular y replican su ADN. En conjunto, demostramos una variedad de enfoques disponibles para estudiar la localización mitocondrial y la actividad de una quinasa del ciclo celular. Estos son métodos avanzados, pero fáciles de seguir, que serán beneficiosos para muchos investigadores de biología celular.

Introduction

En los mamíferos, la progresión del ciclo celular depende de eventos altamente ordenadas controlados por ciclinas y quinasas dependientes de ciclina (CDK) ^1. A través de su citoplasmática, nuclear, y la localización centrosómicas, CyclinB1 / Cdk1 es capaz de sincronizar diferentes eventos en la mitosis tales como rotura de la envuelta nuclear y la separación del centrosoma ^2. CyclinB1 / Cdk1 protege a las células contra la apoptosis mitótico ³ y promueve la fisión mitocondrial, un paso crítico para una distribución equitativa de las mitocondrias de las células hijas recién formadas ^4.

En la prol....

Protocol

1. Aislamiento de las mitocondrias de las células cultivadas

1. Preparación de aislamiento de células Buffer (IBC) Buffer
   1. Preparar 0,1 M Tris / MOPS (tris (hidroximetil) aminometano / 3- (N morfolino) propanosulfónico): Disolver 12,1 g de Tris en 800 ml de agua destilada, ajustar el pH a 7,4 usando MOPS en polvo, añadir agua destilada hasta un total volumen de 1 L y se almacena a 4 ^° C
   2. Preparar 0,1 M EGTA (etilenglicol bis (éter de 2-aminoetil) tetraacético) / Tris: Disolver 38,1 g de EGTA en 800 ml de agua destilada, ajustar el pH a 7,4 usando polvo de Tris, añadir agua destilada hasta un volumen total ....

Results

Sub-localización mitocondrial de CyclinB1 y Cdk1

extracción de carbonato de sodio se utiliza para determinar si una proteína se encuentra dentro de la mitocondria o en la superficie exterior, a saber, la membrana exterior. Una vez que se muestra una proteína de localizar dentro de la mitocondria, mas la determinación de la sub-localización mitocondrial puede realizarse a través mitoplasting combinado con la di.......

Discussion

Al igual que las proteínas destinadas a otros orgánulos subcelulares, las proteínas mitocondriales dirigida poseen señales de orientación dentro de su estructura primaria o secundaria que los dirigen hacia el orgánulo con la ayuda de elaborada de translocación de proteínas y plegadoras ^21,22. Las mitocondrias de orientación secuencias (MTS) obtenidos a partir de las proteínas residentes exclusivamente mitocondriales tales como COX8 se pueden añadir al extremo N-terminal de cualquier secuencia de genes a prote.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
32P ATP	PerkinElmer	BLU002001MC
Anticuerpo secundario anti-ratón	Invitrogen	A-11003	Alexa-546 anticuerpo
secundario anti-conejo	Invitrogen	A11029	Alexa-488
ATP	Research Organics	1166A	Para ensayo de quinasa in vitro
Anticuerpo Cdk1	Tecnología de señalización celular	9112
Tampón de quinasa Cdk1	New England Biolabs	P6020S
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Kit de imágenes	Life Technologies	C10337	Para el análisis del ciclo celular con etiquetado EdU
	Tecnología de señalización celular	4844S	para inmunotinción mitocondrial
Anticuerpo de ciclina B1	Santa Cruz Biotech	sc-752
Complejo enzimático CyclinB1/Cdk1	New England Biolabs	P6020S	Evite la congelación/descongelación
CyDye DIGE Kit de etiquetado con flúor	GE Healthcare Life Sciences	25-8009-83
DIGE Gel y kit de tampón DIGE	GE Ciencias de la Vida para el Cuidado de la Salud	28-9480-26 AA
Dimetilformamida	Sigma Aldrich	319937	DMF
Dithiothreitol	Bio-Rad	161-0611	DTT
dNTP	EMD Millipore	71004	Para mutagénesis
Enzima Dpn I	Stratagene	200519-53	Para mutagénesis dirigida
al sitio Fluido de cobertura de tira seca	GE Healthcare Life Sciences	17-1335-01	Utilizado como aceite mineral
EDTA	J.T. Baker	4040-03
EGTA	Acros Organics	409910250
Eppendorf Concentrador de vacío	Fisher Scientific	07-748-13	Utilizado como concentrador de centrífuga al vacío
Fluoromount G	Southern Biotech	0100-01	Solución de montaje antidecoloración
Fortessa Citómetro de flujo BD	Biosciences	649908	Para el ciclo celular análisis con marcaje EdU
Histone H1	Calbiochem	382150	Para ensayo de quinasa in vitro
QIAquick Kit de extracción de gel	Qiagen	28704	Para purificar fragmentos de ADN de geles de agarosa
Geles Immobiline DryStrip GE	Healthcare Life Sciences	18-1016-61	Tiras IEF (enfoque isoeléctrico)
Glutatión inmovilizado	Thermo Scientific	15160	Perlas de glutatión-agarosa
Yodoacetamida	Sigma Aldrich	I1149	IAA
IPGphor 3 Unidad de enfoque isoeléctrico	GE Healthcare Life Sciences	11-0033-64	Soportes de tiras IPGphor
Isopropil-b-D-tio-galactopiranósido	RPI Corp	156000-5.0	IPTG
Leupeptina	Sigma Aldrich	L9783	Para tampón de lisis celular
Lipofectamina 2000	Life Technologies	11668027	Reactivo de transfección
Lysine	Sigma Aldrich	L5501	Para el etiquetado CyDye
Lisozyme	EMD Chemicals	5960
Mitoctracker Rojo/Verde	Invitrogen	M7512/M7514	Colorantes fluorescentes mitocondriales
MOPS	EMD Chemicals	6310
pEGFP-N1	Clonetech	6085-1	Vector que expresa GFP
Pfu	Stratagegene	600-255-52
pGEX-5X-1	GE Healthcare Life Sciences	28-9545-53	Vector que expresa GST
Fluoruro de fenilmetilsulfonilo	Shelton Scientific	IB01090	PMSF
Solución salina tamponada con fosfato	Life Technologies	14040	PBS
Spectra/Por 4 tubo de diálisis	Spectrum Labs	132700	como tubo de membrana porosa para diálisis
Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel Stain	Life Technologies	P-33300	Para la tinción de fosfoproteínas en geles 2D
Cóctel de inhibidores de proteinasa	Calbiochem	539134	Para tampón de lisis celular
QuikChange kit de mutagénesis dirigida al sitio	Stratagene	200519-5
QIAprep Spin Miniprep Kit Miniprep	Qiagen	27104	MiniPrep Kit de aislamiento de plásmidos
RO-3306	Alexis Biochemicals	270-463-M001	Inhibidor de Cdk1
Rotenona	MP Biomedicals	150154	Inhibidor del complejo I
Carbonato de sodio	Fisher Scientific	S93359
Cloruro de sodio	EMD Chemicals	SX0420-5	Para tampón de lisis celular
Ortovanadato de sodio	MP Biomedicals	159664	Para tampón de lisis celular
Pirofosfato de sodio decahidrato	Alfa Aesar	33385	Para tampón de lisis celular Tampón
sodio β-glicerofosfato	Alfa Aesar	L03425	Para tampón de lisis celular
SpectraMax M2e	Molecular Devices	M2E Lector	microplacas
Sacarosa	Fisher Scientific	57-50-1
Triturador de tejidos	Kimble Chase	885301-0007	Para el aislamiento de mitocondrias
Tubo de trituración de tejidos	Kimble Chase	885303-0007	Para el aislamiento de mitocondrias
Solución de ácido tricloroacético	Sigma Aldrich	T0699	TCA
Tris	MP Biomedicals	103133
Triton-x-100	Teknova	T1105
Tripsina	Calbiochem	650211
Typhoon Imager	GE Healthcare Life Sciences	28-9558-09 Escáner de	gel láser para 2D-DIGE
Ubiquinona	Sigma Aldrich	C7956