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Artículo de método

Los enfoques experimentales para estudiar mitocondrial localización y función de un ciclo celular quinasa nuclear, Cdk1

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DOI:

10.3791/53417

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25 de febrero de 2016

 ,  ,  , 
1Radiation Oncology, University of California, Davis

En este artículo

Resumen

Aquí, describimos cómo estudiar la localización mitocondrial de una quinasa (ciclo celular) y cómo determinar su ubicación submitocondrial, así como los posibles sustratos/objetivos mitocondriales. La expresión forzada de proteínas en las mitocondrias proporciona una herramienta útil para estudiar las consecuencias funcionales de la localización mitocondrial de una proteína de interés.

Resumen

Aunque las mitocondrias poseen su propia maquinaria transcripcional, solo el 1% de las proteínas mitocondriales se sintetizan dentro del orgánulo. Las proteínas codificadas nuclear se transportan a las mitocondrias guiadas por sus secuencias de diana mitocondriales (MTS); sin embargo, la mayoría de las proteínas mitocondriales localizadas carecen de un MTS identificable. Sin embargo, el hecho de que el MTS pueda instruir a las proteínas para que entren en las mitocondrias proporciona una herramienta valiosa para estudiar las funciones mitocondriales de las proteínas normalmente nucleares y/o citoplasmáticas. Recientemente hemos identificado el complejo ciclina quinasa del ciclo celular ciclina B1/Cdk1 en las mitocondrias. Para estudiar específicamente las funciones mitocondriales de este complejo, fue esencial la sobreexpresión mitocondrial y la eliminación de este complejo sin interferir con sus funciones nucleares o citoplasmáticas. Al marcar CyclinB1/Cdk1 con MTS, pudimos lograr la sobreexpresión mitocondrial de este complejo para estudiar sus objetivos mitocondriales, así como sus funciones. A través del marcaje de Cdk1 dominante negativo con MTS, se logró la inhibición de la actividad de Cdk1 particularmente en las mitocondrias. Los posibles objetivos mitocondriales del complejo CyclinB1/Cdk1 se identificaron utilizando un enfoque proteómico basado en gel. A diferencia del análisis en gel 2D tradicional, empleamos la tecnología de electroforesis en gel de diferencia bidimensional (2D-DIGE) seguida de tinción de fosfoproteínas para marcar con fluorescencia proteínas fosforiladas diferencialmente en células mitocondriales que expresan Cdk1. La identificación de manchas de fosfoproteínas que estaban alteradas en las mitocondrias de tipo salvaje frente a las mitocondrias dominantes negativas portadoras de Cdk1 reveló la identidad de los objetivos mitocondriales de Cdk1. Por último, para determinar el efecto de la localización mitocondrial de CyclinB1/Cdk1 en la progresión del ciclo celular, se utilizó un ensayo de proliferación celular utilizando un análogo sintético de timidina EdU (5-etinil-2′-desoxiuridina) para monitorizar las células a medida que atraviesan el ciclo celular y replican su ADN. En conjunto, demostramos una variedad de enfoques disponibles para estudiar la localización mitocondrial y la actividad de una quinasa del ciclo celular. Estos son métodos avanzados, pero fáciles de seguir, que serán beneficiosos para muchos investigadores de biología celular.

Introducción

En los mamíferos, la progresión del ciclo celular depende de eventos altamente ordenadas controlados por ciclinas y quinasas dependientes de ciclina (CDK) 1. A través de su citoplasmática, nuclear, y la localización centrosómicas, CyclinB1 / Cdk1 es capaz de sincronizar diferentes eventos en la mitosis tales como rotura de la envuelta nuclear y la separación del centrosoma 2. CyclinB1 / Cdk1 protege a las células contra la apoptosis mitótico 3 y promueve la fisión mitocondrial, un paso crítico para una distribución equitativa de las mitocondrias de las células hijas recién formadas 4.

En la proliferación de células de mamíferos, mitocondrial ATP se genera a través de la fosforilación oxidativa (OXPHOS) maquinaria (cadena de transporte de electrones), que se compone de 5 complejos de múltiples subunidades; complejo I - complejo V (IC-CV). Nicotinamida adenina dinucleótido (NADH): ubiquinona oxidorreductasa o complejo I (CI) es la más grande y menos comprendido de los cinco complejos 5. El complejo consists de 45 subunidades, 14 de los cuales forman el núcleo catalítico. Una vez montado, el complejo adopta una estructura en forma de L con un brazo que sobresale en la matriz y el otro brazo incrustado en el 6,7 membrana interna. Las mutaciones en las subunidades de CI son la causa de una variedad de trastornos mitocondriales 8. Se requiere un CI funcionalmente eficiente en la fosforilación oxidativa, no sólo para la respiración mitocondrial general 9, sino también para la progresión del ciclo celular con éxito 10. Desentrañar los mecanismos que subyacen al funcionamiento de este complejo enzimático unido a la membrana en la salud y la enfermedad podría permitir el desarrollo de nuevos procedimientos de diagnóstico y estrategias terapéuticas avanzadas. En un estudio reciente, se ha encontrado que el complejo CyclinB1 / Cdk1 se transloca a la mitocondria en el G2 (mitosis) fase M (Gap 2) / y fosforila subunidades IC para mejorar la producción de energía mitocondrial, potencialmente, para compensar el aumento de las necesidades de energía de las células durante celular ciclo de 11. Aquí nos Showcase procedimientos experimentales y las estrategias que se pueden utilizar para estudiar la translocación mitocondrial de quinasas de otro modo núcleo / citoplasma, sus sustratos mitocondrial, así como consecuencias funcionales de su localización mitocondrial usando CyclinB1 / Cdk1 como un ejemplo.

El hallazgo de que el complejo CyclinB1 / Cdk1 se transloca a la mitocondria cuando sea necesario se le solicite los estudios de sobreexpresión y desmontables de este complejo-mitocondria específica. Para conseguir la expresión-mitocondria específico de proteínas, se puede añadir una secuencia de mitocondrias de orientación (MTS) en el N-terminal de la proteína de interés. Las mitocondrias de orientación secuencias permiten la clasificación de las proteínas mitocondriales en las mitocondrias, donde residen normalmente 12. Hemos utilizado una secuencia dirigida a las mitocondrias 87 de base procedentes del precursor de la citocromo oxidasa subunidad humana c 8A (COX8) y se clonó en Green Fluorescent Protein (GFP)-etiquetados CyclinB1 o rojo fluorescenteProteína (RFP)-etiquetados Cdk1 que contiene plásmidos en el marco. Este método nos ha permitido también identificar los CyclinB1 y Cdk1 en la mitocondria, cambiando específicamente la expresión mitocondrial de estas proteínas sin afectar a su piscina nuclear. Mediante el etiquetado con fluorescencia estas proteínas, hemos sido capaces de controlar su localización en tiempo real. Del mismo modo, hemos introducido MTS en un plásmido que contiene RFP-etiquetados dominante Cdk1 negativo, lo que permitió a la detonación específicamente por la expresión mitocondrial y funciones de Cdk1. Es esencial distinguir entre las funciones mitocondriales y nucleares de las quinasas que tienen localizaciones duales como Cdk1. Ingeniería MTS en el N-terminal de estas quinasas duales funcionales ofrece una gran estrategia que es fácil de ser empleado y eficaz.

Desde Cdk1 es un ciclo celular quinasa, es fundamental para determinar la progresión del ciclo celular cuando Cdk1 se localiza en las mitocondrias. Para lograr esto, hemos utilizado un nuevo method para supervisar el contenido de ADN en las células. Los métodos tradicionales incluyen el uso de BrdU (bromodesoxiuridina), un análogo de timidina sintético, que incorpora en el ADN recién sintetizado durante la fase S del ciclo celular para sustituir timidina. A continuación, las células que están replicando activamente su ADN se pueden detectar usando anticuerpos anti-BrdU. Una desventaja de este método es que requiere la desnaturalización del ADN para proporcionar acceso para el anticuerpo BrdU por métodos agresivos como tratamiento con ácido o calor, que pueden resultar en inconsistencia entre los resultados de 13,14. Alternativamente, se utilizó un enfoque similar para monitorear las células que se dividen activamente con un análogo de la timidina diferente, edu. EdU detección no requiere desnaturalización del ADN duras como tratamiento detergente suave permite que el reactivo de detección para acceder a la UDE en el ADN recién sintetizado. El método EdU ha demostrado ser más fiable, consistente y con un potencial de análisis de alto rendimiento 15.

Finalmente, to determinar los sustratos mitocondriales de Cdk1, se utilizó una herramienta de proteómica llamado 2D-DIGE, que es una versión avanzada de la electroforesis bidimensional en gel clásico. Dos electroforesis dimensional separa las proteínas en función de su punto isoeléctrico en la primera dimensión y el peso molecular en el segundo. Desde modificaciones post-traduccionales tales como fosforilación afectan el punto isoeléctrico y el peso molecular de las proteínas, geles 2D pueden detectar las diferencias entre los estados de fosforilación de las proteínas dentro de las diferentes muestras. El tamaño (área e intensidad) de la proteína de spots de cambios con el nivel de expresión de las proteínas, lo que permite la comparación cuantitativa entre múltiples muestras. Usando este método, hemos sido capaces de diferenciar las proteínas fosforiladas en el tipo salvaje frente a las células que expresan Cdk1 mitocondrias orientada mutantes. Se aislaron las manchas de proteínas específicas que mostraron en el tipo salvaje, pero faltaban en el mutante preparación Cdk1 mitocondrias y las orientadas poridentificado mediante espectrometría de masas.

En los geles en 2D tradicionales, colorantes de trifenilmetano se utilizan para visualizar las proteínas en el gel. 2D-DIGE utiliza etiquetas de la proteína fluorescente con un efecto mínimo sobre la movilidad electroforética de proteínas. Diferentes muestras de proteína pueden ser marcadas con diferentes colorantes fluorescentes, mezclados entre sí y separadas por los geles idénticos, lo que permite la co-electroforesis de múltiples muestras en un solo gel 16. Esto minimiza las variaciones de gel a gel, lo cual es un problema crítico en estudios de proteómica a base de gel.

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Protocolo

1. Aislamiento de las mitocondrias de las células cultivadas

  1. Preparación de aislamiento de células Buffer (IBC) Buffer
    1. Preparar 0,1 M Tris / MOPS (tris (hidroximetil) aminometano / 3- (N morfolino) propanosulfónico): Disolver 12,1 g de Tris en 800 ml de agua destilada, ajustar el pH a 7,4 usando MOPS en polvo, añadir agua destilada hasta un total volumen de 1 L y se almacena a 4 ° C
    2. Preparar 0,1 M EGTA (etilenglicol bis (éter de 2-aminoetil) tetraacético) / Tris: Disolver 38,1 g de EGTA en 800 ml de agua destilada, ajustar el pH a 7,4 usando polvo de Tris, añadir agua destilada hasta un volumen total de 1 l y almacenar a 4 ° C.
    3. Preparar 1 M de sacarosa: Disolver 34,23 g de sacarosa en 100 ml de agua destilada, hacer alícuotas de 20 ml y se almacena a -20 ° C.
    4. Preparar tampón C IB: Preparar 100 ml de IB c Buffer por adición de 10 ml de Tris 0,1 M / MOPS y 1 ml de 0,1 M EGTA / Tris a 20 ml; De 1 M de sacarosa. Añadir agua destilada hasta un volumen total de 100 ml. Ajustar el pH a 7,4.
  2. Preparación de Tampón de Lisis Celular
    1. Preparar el tampón de lisis que contiene 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), NaCl 150 mM, EDTA 1 mM (ácido etilen diamino), EGTA 1 mM, 1% de Triton-X-100, 2,5 mM de pirofosfato de sodio, 1 mM β- glicerofosfato, 1 mM ortovanadato de sodio. Añadir inhibidores de proteinasa 1 mg / ml de leupeptina y PMSF 1 mM (fluoruro de fenilmetilsulfonilo) justo antes de su uso.
  3. Aislamiento de mitocondrias
    1. Cosecha 3 x 10 7 células con enfriado con hielo 1x PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7,4 y centrifugar las células a 600 xg durante 10 min a 4 ° C. Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento en tampón IB c 5 ml enfriado con hielo.
    2. Homogeneizar las células utilizando un triturador de tejidos de vidrio / vidrio durante aproximadamente 10 min. Transferir el homogeneizado a un tubo de 15 ml y centrifugar a 600 g durante 10 millasn a 4 ° C. Para mitocondrias funcional, se utiliza el acoplamiento de vidrio / teflón, ya que es menos perjudicial para mitocondrias que el triturador de tejidos de vidrio / vidrio.
    3. Recoger el sobrenadante en tubos de 1,5 ml y centrifugar a 7000 xg durante 10 min a 4 ° C. Transferir el sobrenadante a un tubo de 1,5 ml y guardar como proteína de citosol.
    4. Lavar el sedimento (mitocondrias) dos veces con tampón IB c enfriado con hielo 200 l y se centrifuga a 7000 xg durante 10 min a 4 ° C.
    5. Desechar el sobrenadante y resuspender el precipitado en el tampón de lisis celular y usarlo inmediatamente o almacenar a -80 ° C para su uso futuro. Si se necesitan las mitocondrias funcionales, volver a suspender el sedimento en el tampón restante después de descartar el sobrenadante. La dilución de la fracción mitocondrial adicional puede resultar en la pérdida de la función de las mitocondrias. Almacenar en hielo y el uso de la preparación in 1 - 3 horas para obtener mejores resultados.
    6. Sonicar el sedimento se volvió a suspender durante treinta ráfagas de 3 seg en unabaño de hielo, se centrifuga a 10.000 xg durante 5 min, y guardar el sobrenadante como la fracción mitocondrial.

2. Co-inmunotinción de Cdk1, CyclinB1 y COXIV, una proteína mitocondrial Residente

  1. Crecer 5 x 10 4 células en cubreobjetos en placas de 24 pocillos O / N o hasta el 70% de confluencia. Aspirar el medio y lavar las células dos veces con 500 l enfriado en hielo 1 x PBS, pH 7,4.
  2. Fijar las células con 500 l enfriado en hielo paraformaldehído al 4% a TA durante 10 min. Aspirar la solución de fijación y se lavan las células con 500 l 1 x PBS 3 veces, 5 minutos cada uno con agitación suave a temperatura ambiente.
  3. Permeabilizar las células con 0,2% Triton X-100 en 500 l de PBS durante 5 min a TA. Aspirar la solución y se lavan las células 3 veces, 5 minutos cada uno con 500 l de PBS. Añadir la solución de bloqueo (500 l, 1% de BSA (albúmina de suero bovino) en PBS que contenía 1% de Tween 20) durante 30 min a TA.
  4. Diluir los anticuerpos primarios 1: 250 (v: v) en 5001; l de solución de bloqueo e incubar las células con anticuerpos primarios deseados planteadas en diferentes especies para evitar la señalización de cruz (CyclinB1 (ratón) y COXIV (conejo) o Cdk1 (ratón) y COXIV (conejo) a TA durante 30 - 60 min o O / N a 4 ° C.
  5. Lavar los cubreobjetos con 500 l de 1 x PBS 3 veces, 5 minutos cada uno y luego se incuba con el anticuerpo secundario diluido 1: 1000 en 500 l solución a TA durante 1 h seguido de lavado con 500 l de PBS 3 veces, 5 min cada bloqueo.
  6. Montar el cubreobjetos con 20 l de solución de montaje anti-fade y sellar las diapositivas con esmalte de uñas. Imagen de las diapositivas utilizando un microscopio de fluorescencia de inmediato o se mantienen en la oscuridad a 4 ° C durante 1 - 2 semanas.

3. Carbonato de Sodio La extracción de mitocondrias intactas

  1. Crecer de aproximadamente 20 x 10 7 células, cosecha, lavado una vez con PBS y aislar las mitocondrias como se describe en la sección 1. mitocondrial Divide en dos aislamientos parts antes de la última centrifugación para sedimentar las mitocondrias (antes del paso 1.3.4); salvo un medio para ser utilizado como la mitocondria total (paso 3.2), utilizar el otro medio para la extracción de carbonato de sodio (siguiendo los pasos 3.3 a 3.6) para separar las proteínas unidas solubles y de membrana.
  2. Lyse las mitocondrias total del pellet con 30 l de tampón de lisis celular y almacenar el lisado a -80 ° C hasta que se utilizó en inmunotransferencia.
  3. Añadir 250 l de 0,1 M Na 2 CO 3 (carbonato de sodio), pH 11,0, a la otra mitad de la pastilla mitocondrial e incubar en hielo durante 30 min.
  4. Centrifugar a 100.000 xg durante 20 min. Recoger el sobrenadante y proceda al paso 3.5. Lyse el sedimento usando 30 l de tampón de lisis celular y se somete a ultrasonidos como en el paso 1.3.6. Almacenar a -80 ° C hasta que se utilizó en inmunotransferencia.
  5. Añadir un volumen igual de 20% de ácido tricloroacético recién hecho (TCA) al sobrenadante para precipitar las proteínas y mantener en hielo durante 30 min.
  6. CentrifUGE a 15.000 xg durante 10 min. Descartar el sobrenadante, disolver el precipitado en 80 l de tampón de lisis celular y se almacena a -80 ° C hasta que se utilizó en inmunotransferencia.

4. La separación de membranas interior y exterior de las mitocondrias (Aislamiento de Mitoplasts)

  1. Crecer de aproximadamente 20 x 10 7 células, cosecha, lavado una vez con PBS y aislar las mitocondrias como se describe en el apartado 1. Separar las fracciones mitocondriales en 10 porciones iguales antes de la última centrifugación para sedimentar las mitocondrias (antes de la etapa 1.3.4).
  2. Disolver cada sedimento en 30 l de la concentración indicada de tampón de sacarosa hipotónica (EDTA 1 mM, 10 mM MOPS / KOH (hidróxido de potasio), pH 7,2; concentración de sacarosa que oscila desde 25 hasta 200 mM) con o sin 50 mg / ml de tripsina ( véase la Tabla 1) y se incuba 30 min en hielo.
  3. Añadir 3 l de PMSF 10 mM (para llegar a una concentración final de PMSF 1 mM) a la tripsina que contiene viales para detener tque la digestión con tripsina y se incuba en hielo durante 10 min.
  4. Centrifugar a 14.000 xga 4 ° C durante 10 minutos. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo, lisar el precipitado en 30 l de tampón de lisis celular, se somete a ultrasonidos como en el paso 1.3.6, y se almacena a -80 ° C

5. Construcción de mitocondrias-dirigida de GFP / RFP-etiquetados CyclinB1 / Cdk1 vectores y la confirmación de su localización mitocondrial

  1. Clonar la mitocondria secuencia de direccionamiento (MTS; derivado del precursor de la citocromo humano c oxidasa subunidad 8A (COX8) entre los nucleótidos 76 - 161) en marco en el extremo N-terminal de GFP o RFP en los sitios NheI y BamHI del pEGFP-N1 o pERFP vectores -N1 utilizando técnicas de clonación molecular estándar.
  2. En el diseño de cebadores de PCR para genes CyclinB1 y Cdk1, añadir BamHI sitios de reconocimiento de enzimas de restricción (en negrita) al extremo 5 'de los cebadores de PCR.
    Reenviar BamH1 Cdk15 'CAG T GG ATC C AA TGG AAG ATT ATA CCA AAA T
    Revertir Cdk1 BamH1 5 'CTG T GG ATC C TG CAT CTT CTT AAT CTG ATT
    Adelante CyclinB1 BamH1 5 'ATA TGG ATC CAA TGG CGC TCC GAG TCA
    Revertir CyclinB1 BamH1 5 'TGG ATA ATC CTG CAC CAC CTT TGC AGC C
  3. Amplificar los genes Cdk1 y CyclinB1 utilizando estos cebadores siguiendo técnicas estándar. Digerir los productos de PCR con 1 l de enzima de restricción BamHI a 37 ° C durante 2 hr. Ejecutar los productos de digestión en un gel de agarosa al 1%. El uso de una cuchilla de afeitar, cortar los fragmentos de ADN -sized correctas y purificar el ADN del gel usando un kit de extracción de gel.
  4. Digerir 1 g de MTS-pEGFP-N1 y plásmidos MTS-pERFP-N1 con 1 l de enzima BamHI a 37 ° C durante 2 horas. Añadir 1 l de Calf-Intestinal fosfatasa alcalina (CIP) durante 30 minutos a 37 ° C. Ejecutar los productos de digestión en un gel de agarosa al 1% y purificar plásmidos lineales de gel como en el paso 5.3.
  5. Configurar una reacción de unión mediante la adición de 1 l de plásmido a partir del paso 5.4 y 5 l de Cdk1 o CyclinB1 del Paso 5.3 a 3 l de tampón ligasa, 0,5 l de T4 ligasa, y 20,5 l de dH2O Incubar O / N a 4 ° C.
  6. Transformar Escherichia coli DH5a competentes células con 10 l de mezcla de ligación siguiendo las técnicas estándar y crecer las bacterias en 10 mg / ml de kanamicina que contiene placas de agar LB O / N a 37 ° C para obtener colonias.
  7. Escoja una colonia de O / N placas adultos utilizando una punta de pipeta estéril, inserte la punta en un 5 ml de kanamicina-LB que contiene el tubo e incubar S / N. Aislar el plásmido utilizando kits de miniprep de acuerdo con el protocolo del fabricante, y la secuencia del plásmido utilizando técnicas estándar.
  8. Transfectar crecimiento exponencial MCF1Células 0A (1,5 x 10 4 células sembradas en placas de 96 pocillos) con MTS-Cdk1-RFP o MTS-CyclinB1-GFP plásmidos de Paso 5.7 mediante la preparación de una relación de reactivo de plásmido / transfección de 1: 2 (w: v, 100 ng : 0,2 l) en 100 l de suero y medio libre de antibióticos.
  9. Se incuban las células en el plásmido mezcla / reactivo durante 48 horas a 37 ° C en una incubadora de CO 2 con control de humedad (5% de CO 2, 95% de humedad relativa).
  10. Preparar 1 mM solución madre de tintes fluorescentes rojos y verdes mitocondriales mediante la disolución de 50 g de polvo en 100 l de DMSO. Diluir las soluciones madre 1: 400 en PBS 1x para obtener 2,5 M soluciones de trabajo. Las soluciones madre pueden ser almacenadas a -20 ° C durante un año.
  11. Mezcle 2 l de 2,5 M de colorante rojo con 98 l de medio de cultivo para preparar una concentración final de 50 nM.
  12. Sustituir el medio de cultivo celular de CyclinB1-GFP teniendo células MCF10A (generados en la etapa 5.8) con el tinte rojo que contiene medio de 2 min. Repite elmismo procedimiento con colorante verde para las células MCF10A rodamiento Cdk1-RFP.
  13. Lavar dos veces con 100 l 1 x PBS para deshacerse del exceso de solución de tinción, se añaden 100 l de PBS 1x a la placa de 96 pocillos.
  14. Visualizar la mitocondria y CyclinB1-GFP (excitación por 488 nm y emisión a 494 hasta 536 nm) y Cdk1-RFP (excitación por 560 nm y emisión a 565 hasta 620 nm) en placas de 96 pocillos bajo el microscopio fluorescente a un aumento de 40X.

6. Identificación de proteínas diferencialmente fosforilados a través de 2D-DIGE

  1. Preparación de la muestra
    1. Aislar las mitocondrias y la lisis de las fracciones mitocondriales como en el paso 1.3. Añadir un volumen igual de 20% de TCA (ácido tricloroacético en agua) a cada muestra y agitar durante 15 seg. Incubar las muestras en hielo durante 30 min como las proteínas precipitan fuera de la solución.
    2. Centrifugar las muestras a 9.300 xga 4 ° C durante 5 min, eliminar el sobrenadante y añadir 60 l de acetona fría (100%), seguido decentrifugación a 9300 xga 4 ° C durante 5 min.
    3. Repita el paso de lavado acetona (Paso 6.1.2) una vez más, eliminar el sobrenadante y volver a suspender las muestras en 50 l de tampón de etiquetado DIGE (7 M urea, tiourea 2 M, 4% CHAPS, Tris 30 mM, pH 8,5).
  2. Preparar el tintes fluorescentes
    1. Preparar la solución madre: Disolver colorantes (5 nmol) en 5 l de formamida fresca de dimetilo (DMF) a una concentración final de 1 nmol / l. La solución madre de tinte a -20 ° C hasta su uso durante unos meses.
    2. Preparar la solución de trabajo: Permitir a los tintes para establecer a temperatura ambiente durante 5 min. Diluir 1 l de colorante con 4 l de DMF a una concentración final de 200 pmol / l. Mantener en hielo durante el uso. Nota: La solución de trabajo se puede mantener a -20 ° C durante 3 semanas.
  3. Las proteínas de la etiqueta
    1. Mezclar 1 l de solución de colorante por 12,5 g de proteína de trabajo. Ampliar según sea necesario. Para los estándares agrupados, agregar 61; l de solución de trabajo Cy2 a 300 g de proteína agrupados.
    2. Vortex durante 30 segundos y se centrifuga a 4 ° C durante 30 segundos a 12.000 x g. Incubar en hielo en la oscuridad durante 30 min. Detener el etiquetado mediante la adición de 1 l de 10 mM de lisina por 1 l de solución de trabajo utilizados. Mezclar bien e incubar en hielo en la oscuridad durante 10 min.
    3. Piscina etiquetados individualmente y mezclar las muestras con tampón de rehidratación (7 M urea, tiourea 2 M, 4% CHAPS, 1,2% destreak, 1% pharmalytes, azul de bromofenol). Volumen total será de 125 l.
    4. muestras de vórtice durante 30 segundos y permita que las muestras fijaron a temperatura ambiente durante 30 min. Carga 125 l de muestras sobre 7 cm pH 4-9, enfoque isoeléctrico (IEF) tiras.
  4. Primera dimensión electroforesis
    1. Coloque los soportes de tira (ataúdes) en la placa de electrodos, asegurándose de que los titulares de la tira son completamente limpia y seca. Pipetear 125 muestras l en un ataúd, extendiendo uniformemente a través de todo el ataúd.
    2. usando tweezers, recogen la tira IEF, retirar con cuidado la cubierta protectora de plástico, y lo colocan (lado gel de abajo) en tampón ataúd / rehidratación. Evitar que queden atrapadas burbujas de aire. Llenar lentamente el ataúd (1 - 1,5 ml) con aceite mineral y colocar el ataúd cubre a los ataúdes.
    3. Comience enfoque isoeléctrico siguiendo el protocolo en la Tabla 2:
      Nota: Una vez que la ejecución se ha completado, las tiras pueden ser almacenadas en tubos de plástico a -80 ° C o directamente trasladaron a equilibración y la segunda dimensión.
  5. Segunda dimensión - dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida electroforesis en gel (SDS-PAGE)
    1. Equilibrio
      1. Descongelar el tampón de equilibrado SDS (8 ml por cada tira, 6 M de urea, glicerol al 30%, SDS al 2%). Pesar ditiotreitol (DTT; 10 mg TDT por 1 ml de tampón de equilibrio SDS). Disolver la TDT en 4 ml tampón de equilibrado SDS.
      2. Pesar IAA (yodoacetamida, 25 mg de IAA por 1 ml de tampón de equilibrio SDS).Disolver IAA en 4 ml tampón de equilibrado SDS.
      3. Derretir 1 ml de sellado solución de agarosa en un baño de agua para su uso posterior.
      4. Si se congelaron las tiras, permitir que se descongelen por completo. Coloque las tiras de gel de lado arriba en la bandeja reswelling. Añadir 4 ml de tampón de equilibrado SDS con DTT a cada tira y se incuba durante 15 min con agitación suave.
      5. Retirar todo el tampón de equilibrado SDS con TDT. Añadir 4 ml de tampón de equilibrado SDS con IAA a cada tira y se incuba durante otros 15 min con agitación suave. Después del equilibrado con el tampón de IAA, se vierte el tampón de equilibrado de SDS.
    2. SDS-PAGE
      1. Desenvolver minigeles, retire el peine y enjuague el gel y los pocillos con ddH2O Retire la cinta blanca en la parte inferior del gel antes de ejecutar. Orientar correctamente la tira en el gel, gel de orientación es fundamental para el corte in situ.
      2. Coloque la plana gel en barra con la placa pequeña arriba y de arriba hacia gel de correoxperimenter. Coloque la tira sobre la placa de altura con el extremo anódico (++ terminar con el código de barras) que mira hacia el lado izquierdo de la gel. Usando una regla, empujar lentamente la tira hacia abajo sobre la superficie del gel. Evitar que queden atrapadas burbujas de aire entre la banda y el gel. Colocar el gel en un soporte de la placa de vidrio.
      3. Añadir 1 ml de solución de agarosa de sellado caliente para la apertura de la cassette. Asegúrese de que todas las burbujas de aire se presionan a cabo usando una regla plana. Montar el aparato y correr el gel a una constante de 125 V durante 90 min.
      4. Cuando el gel se haya ejecutado, colocar el gel en un generador de imágenes biomoleculares con 2 ml ddH2O y escanear el gel en el modo de adquisición de fluorescencia con láser de 635 nm de excitación y 665 nm de emisión filtro.
    3. La tinción fosfoproteína
      1. Fijar el gel con 50% de metanol y la mezcla de ácido acético al 10% (10 ml) durante 30 min dos veces. Lavar con 10 ml de agua durante 10 minutos tres veces y mancha con 10 ml fosfoproteína mancha durante 60-90 min, seguido dedecoloración con 10 ml de solución decolorante durante 30 minutos tres veces.
      2. Lavar con 10 ml de agua 5 min dos veces y la imagen de gel con un escáner de gel láser a 532 nm / 560 nm de excitación / emisión.
    4. La digestión de proteínas e Identificación
      1. Impuestos Especiales toda la expresados ​​diferencialmente manchas de proteínas desde el gel en pocillos de la microplaca utilizando un spot-selector de robot de acuerdo con las especificaciones del fabricante, y añadir bicarbonato de amonio 100 mM (2 ml) durante 1 hora a RT a destain las piezas de gel. Deshidratar con 2 ml 100% de acetonitrilo se lava dos veces y se seca en un concentrador de vacío durante 30 min.
      2. Rehidratar las piezas de gel con 100 l de 13 ng / l tripsina porcina modificada en bicarbonato de amonio 50 mM durante 16 horas a 37 ° C. Recoger los sobrenadantes y extraer aún más las proteínas con 100 l de ácido trifluoroacético 5% en 50% de acetonitrilo durante 30 min.
      3. Concentrar los péptidos de hasta 5 l mediante vacío concent centrífugarator y analizar con láser asistida por matriz de desorción ionización - tiempo de vuelo - tandem análisis espectrometría de masas (MALDI TOF-MS / MS) 17.

7. In Vitro Ensayo de quinasa

  1. Preparación de sustratos
    1. I (IC) subunidades sub-clon complejas (NDUFV1, NDUFV3, Ndufs2, NDUFB6, y NDUFA12), que se identifican como blancos Cdk1 diferencialmente fosforilados, en pGEX-5X-1 vectores que generan glutatión-S-transferasa (GST)-etiquetados expresión bacteriana plásmidos 11. Purificar subunidades IC utilizando las columnas de alta afinidad de glutatión siguiendo el protocolo a continuación.
      1. Cultura GST-tagged subunidad CI que contiene Escherichia coli cepa BL-21 en medio Luria-Bertani (LB) caldo con 50 g / ml de ampicilina en un agitador a 37 ° C hasta una densidad óptica (DO) de 0,6 se alcanzó. Añadir isopropil-BD-tio-galactopiranósido (IPTG) al cultoure a una concentración final de 0,1 mM, y se incuba durante un 3 h adicionales.
      2. Centrifugar a 600 xg durante 10 min para recoger las bacterias y volver a suspender en 5 ml de 1 x tampón de PBS que contiene 5 mM de DTT 1 x cóctel inhibidor de proteinasa, y 0,1% de lisozima. Lyse las células por sonicación durante veinte 5 s ráfagas, y eliminar los restos celulares por centrifugación a 600 xg durante 10 min.
      3. Recoger el sobrenadante e incubar con cuentas de 4B de glutatión-agarosa en una relación en volumen de 4: 1 (sobrenadante: perla) durante 1 hora a RT.
      4. La elución de las proteínas de fusión GST de las perlas con 3 ml de tampón de glutatión elución (10 mM de glutatión reducido en 50 mM Tris-HCl, pH 8,0) y someter las proteínas eluidas a diálisis en tubo de membrana porosa molecular (peso molecular de corte 12 -14 kiloDaltons) con EDTA 1 x PBS / 1 mM. Almacenar las proteínas purificadas a - 80 ° C
  2. Cdk1 Ensayo de quinasa
    1. Antes de iniciar el culo quinasaay, establecer bloques de calentamiento a 30 ° C y 100 ° C. Descongelar complejo comercial CyclinB1 / Cdk1 enzima y los sustratos sobre hielo.
    2. Preparar la mezcla de reacción en hielo. Desde 32 isótopos P ATP está involucrado, preparar todas las mezclas de reacción en tubos de 1,5 ml de muestra con tapones de rosca que contiene una junta tórica para evitar la propagación de la radiactividad.
      Precaución: Siga las normas de protección de materiales radiactivos. Utilice un niño de 8 mm de espesor de plexiglás de blindaje y el trabajo por lo menos en condiciones de independencia mutua. Limpie cualquier área contaminada con agua.
    3. Preparar un tampón de reacción 30 l que contiene 1 x tampón de Cdk1 (50 mM Tris-HCl, MgCl2 10 mM, DTT 2 mM, EGTA 1 mM, 0,01% de Brij 35, pH 7,5), 0,6 mM ATP frío, 0,1 Ci 32 P ATP, 2 unidades de CyclinB1 / Cdk1 y 6 g de proteína sustrato. Ajuste el volumen a 30 l con ddH2O Para la reacción de control positivo, reemplazar el sustrato con 0,01 mM de histona H1, un sustrato CyclinB1 / Cdk1 bien conocido.
      1. Para contro negativol reacciones, (1) reemplazar el sustrato con única proteína GST y (2) reemplazar el sustrato con 0,01 mM de histona H1 + 0,5 M RO-3306, un inhibidor selectivo de Cdk1.
    4. Mezclar bien con la pipeta y se centrifuga para llevar todo el líquido al fondo del tubo, lo que minimiza el riesgo de contaminación. Incubar a 30 ° C durante 60 min.
    5. Añadir 6 l de tampón de muestra SDS 5x para detener la reacción y desnaturalizar a 100 ° C durante 10 min. muestras analizadas, el 10% SDS-PAGE gel a 160 V durante 2 horas, o hasta frente de colorante ha alcanzado el final del gel. Transferencia de gel sobre un papel de cromatografía y envolver con papel film.
      Precaución: Todo el líquido en contacto con radioisótopos debe ser tratado como residuo radiactivo y desecharse en un bidón de 5 galones poli proporcionada por los servicios de salud y seguridad ambiental de acuerdo con las directrices institucionales.
    6. Exponer el gel a una película de rayos X durante 1 día o hasta 1 semana a -20 ° C, dependiendo de la actividad específica del radioisótopo utilizadoy la enzima.

8. mutagénesis dirigida al sitio para generar dominante Cdk1 Negativo (D146N)

  1. Diseño cebadores de mutagénesis; dos cebadores, complementarios entre sí, que contiene el sitio mutante (G serán sustituidos por un nucleótido para codificar N en lugar de D aminoácido) flanqueada por 20 bases en cada lado 11.
  2. Preparar un 50 l Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR) mezcla que contenía tampón de reacción 1x, dNTPs 2,5 mM, 10 mM de los cebadores (directa e inversa), 40 ng de la plantilla, y ddH2O Añadir 2,5 U de ADN polimerasa en la reacción.
  3. Ejecutar el siguiente programa de PCR: 95 ° C 3 min, 95 ° C 30 seg, 55 ° C 30 min, 68 ° C 6 min; 16 ciclos (Nota: 68 ° C tiempo de incubación se determina por el tamaño del ADN se requiere 1 min / kb de ADN ≤ 10 kb Para el ADN más grande, 2 min / kb, más 10 segundos por ciclo..). Siga por 68 ° C 7 min y mantener a 4 ° C hasta que esté listo para su uso.
  4. Añadir2 l de la enzima de restricción Dpn I (10 U / l) y 5,7 l Dpn I buffer, se mezclan bien con suave toque con el dedo e incubar la reacción a 37 ° C durante 1 hora.
  5. Transferencia de 10 l Dpn I tratados con productos de PCR en 50 l de células competentes DH5a para la transformación. Incubar en hielo durante 30 min, seguido de 45 segundos de choque térmico a 42 ° C y 5 min en hielo. Añadir 500 l de LB y agitar a 37 ° C durante 1 hora antes de placas en placas de agar LB. Incubar O / N a 37 ° C.
  6. Escoja una colonia de la O / N cultiva placas de agar utilizando una punta de pipeta estéril de color amarillo, la caída de la punta en un tubo que contiene 5 ml de LB, y crecer O / N en un agitador C 37 °. Aislar el plásmido utilizando un kit miniprep y la secuencia del plásmido para confirmar la mutación de acuerdo con el protocolo del fabricante.

9. Determinación del ciclo celular de fase longitudes con EdU Ensayo de incorporación

  1. Clasificación celular
    1. Transfect 2 x 10 5 células con los vectores indicados (MTS-GFP / RFP, MTS-CyclinB1-GFP / Cdk1-peso-RFP o MTS-Cdk1-dn-RFP) en una placa de 6 pocillos usando 1: 2 (w: v , 2,5 mg: 5 relación l) de ADN: reactivo de transfección mezcla preparada en 2,5 ml de suero y medio de cultivo libre de antibióticos durante 48 horas. ordenar las células vivas que expresan establemente las proteínas GFP-etiquetados CyclinB1 Cdk1 y RFP-etiquetados mediante citómetro de flujo.
      1. Lavar las células con 1 x PBS, añadir 100 l de tripsina en el plato y se incuba a 37 ° C durante 5 min. Añadir 2 ml de medio de cultivo para recoger las células y pasar a través de un filtro de 70 micras para generar una suspensión de células individuales. Se lava la suspensión de células individuales con 500 l de 1% suero de ternera fetal en PBS (FCS / PBS) antes de cargarlos en citómetro de flujo.
      2. Configurar los parámetros de clasificación siguientes protocolos establecidos compuerta 18 para las células doble positivas teñidas con tanto GFP y RFP. Recoger las células clasificadas que sale del citómetro en un tubo contaiNing medio de cultivo celular y el uso de estas células para el análisis de la progresión del ciclo celular con el etiquetado EdU pulso-caza como en el protocolo 9.2.
  2. La medición de la duración del ciclo celular usando el ensayo de EdU Etiquetado Citometría de Flujo
    1. Se siembran las células ordenados en placas de 6 pocillos a una densidad de 2,5 x 10 5 células por pocillo y la cultura de O / N a 37 ° C en una incubadora de CO 2. Añadir EdU al medio de cultivo a una concentración final de 25 mM. Incubar a 37 ° C en una incubadora de CO 2 durante 1 hora.
    2. Lavar las células con 1% de BSA en 500 l de PBS y recoger en un tubo de 1,5 ml a intervalos de 2 horas para un total de 10 a 12 hr.
    3. centrifugar las células a 350 xg durante 5 min, descartar el sobrenadante. Desalojar el sedimento por adición de 100 l de solución de fijación (proporcionado por el fabricante en el kit de marcaje de EDU) durante 15 min a RT y mezclar bien.
    4. Lavar las células con 1 ml de 1% de BSA en PBS tres veces. Arregla ellas células de nuevo con 0,5 ml de 70% de etanol O / N a 4 ° C.
      Nota: El etanol fijación es crítica para extinguir la fluorescencia de GFP / RFP interna debido a la expresión de proteínas recombinantes con etiqueta.
    5. Centrifugar las células de nuevo a 350 xg durante 5 min y se lava el sedimento con 1 ml de BSA 1% en PBS una vez. Vuelva a suspender las células en 1 ml de tampón de permeabilización (0,1% Triton-X-100, 1% de BSA, 0,2 mg / ml RNasa A en PBS) durante 20 min a TA.
    6. Lavar las células con 1 ml de 1% de BSA en PBS una vez. Añadir 0,5 ml de mezcla de reacción en cada tubo y mezclar bien. Incubar mezcla de reacción a TA durante 30 min en la oscuridad.
    7. Lavar con 1 ml de 1% BSA en PBS una vez y el ADN mancha con 50 mg / ml de yoduro de propidio (PI) en 1 ml de BSA 1% en PBS.
    8. Analizar las células por citometría de flujo para seguir la población EdU-positivo. Presente gráfico de puntos de dispersión de las células marcadas con EdU teñidas para contenido de ADN (tinción PI, eje X) y Edu (Alexa 647 de tinción, eje Y).
      1. Utilizar el canal de APC para AlexA647-edu utilizando un filtro de paso de banda de 670/30 con todos los presentes luz inferior a 685 nm golpear ese filtro; y ficoeritrina (PE) de canal para PI con un filtro de paso de banda de 581/15 delante de ella con todos los presentes luz inferior a 600 nm golpear ese filtro.
      2. Introduzca las primeras células tubulares que contiene en la citometría de flujo y el uso de una estrategia de compuerta estándar para la adquisición: Parcela FSC-Zona X SSC-Área de la morfología seguido por PI (canal PE) X Alexa647-EDU (canal APC) para la tinción de células. datos de registro para todos los tubos uno por uno adquisición de 10.000 eventos por muestra.
      3. Determinar la distribución de fase del ciclo celular de las células y las longitudes de fase utilizando una citometría de flujo de software de análisis de datos siguiendo los protocolos establecidos 11,30.

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Resultados

Sub-localización mitocondrial de CyclinB1 y Cdk1

extracción de carbonato de sodio se utiliza para determinar si una proteína se encuentra dentro de la mitocondria o en la superficie exterior, a saber, la membrana exterior. Una vez que se muestra una proteína de localizar dentro de la mitocondria, mas la determinación de la sub-localización mitocondrial puede realizarse a través mitoplasting combinado con la di...

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Discusión

Al igual que las proteínas destinadas a otros orgánulos subcelulares, las proteínas mitocondriales dirigida poseen señales de orientación dentro de su estructura primaria o secundaria que los dirigen hacia el orgánulo con la ayuda de elaborada de translocación de proteínas y plegadoras 21,22. Las mitocondrias de orientación secuencias (MTS) obtenidos a partir de las proteínas residentes exclusivamente mitocondriales tales como COX8 se pueden añadir al extremo N-terminal de cualquier secuencia de genes a prote...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los NIH CA133402, CA152313 y la Oficina de Ciencia DE-SC0001271 del Departamento de Energía. Agradecemos al Laboratorio de Recursos Compartidos de Citometría de Flujo Davis de la Universidad de California con fondos del CA0933730 NCI P30 y las subvenciones de los 026825 NCRR C06-RR12088, S10 RR12964 y S10 RR de los NIH y con la asistencia técnica de la Sra. Bridget McLaughlin y el Sr. Jonathan Van Dyke por su ayuda con los experimentos de citometría de flujo.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
32P ATP PerkinElmerBLU002001MC 
Anticuerpo secundario anti-ratónInvitrogen A-11003Alexa-546 anticuerpo
secundario anti-conejoInvitrogen A11029Alexa-488
ATPResearch Organics1166APara ensayo de quinasa in vitro
Anticuerpo Cdk1Tecnología de señalización celular9112
Tampón de quinasa Cdk1New England BiolabsP6020S
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Kit de imágenesLife TechnologiesC10337Para el análisis del ciclo celular con etiquetado EdU
Tecnología de señalización celular4844Spara inmunotinción mitocondrial
Anticuerpo de ciclina B1Santa Cruz Biotechsc-752
Complejo enzimático CyclinB1/Cdk1New England BiolabsP6020SEvite la congelación/descongelación
CyDye DIGE Kit de etiquetado con flúorGE Healthcare Life Sciences25-8009-83
DIGE Gel y kit de tampón DIGEGE Ciencias de la Vida para el Cuidado de la Salud28-9480-26 AA
Dimetilformamida Sigma Aldrich319937DMF
DithiothreitolBio-Rad161-0611DTT
dNTPEMD Millipore71004Para mutagénesis
Enzima Dpn IStratagene200519-53Para mutagénesis dirigida
al sitio Fluido de cobertura de tira secaGE Healthcare Life Sciences17-1335-01Utilizado como aceite mineral
EDTAJ.T. Baker4040-03
EGTAAcros Organics409910250
Eppendorf Concentrador de vacíoFisher Scientific07-748-13Utilizado como concentrador de centrífuga al vacío
Fluoromount GSouthern Biotech0100-01Solución de montaje antidecoloración
Fortessa Citómetro de flujo BDBiosciences649908Para el ciclo celular análisis con marcaje EdU
Histone H1Calbiochem382150Para ensayo de quinasa in vitro
QIAquick Kit de extracción de gelQiagen28704Para purificar fragmentos de ADN de geles de agarosa
Geles Immobiline DryStrip GEHealthcare Life Sciences18-1016-61Tiras IEF (enfoque isoeléctrico)
Glutatión inmovilizadoThermo Scientific15160Perlas de glutatión-agarosa
YodoacetamidaSigma AldrichI1149IAA
IPGphor 3 Unidad de enfoque isoeléctricoGE Healthcare Life Sciences11-0033-64Soportes de tiras IPGphor
Isopropil-b-D-tio-galactopiranósido RPI Corp156000-5.0IPTG
LeupeptinaSigma AldrichL9783Para tampón de lisis celular
Lipofectamina 2000Life Technologies11668027Reactivo de transfección
LysineSigma AldrichL5501Para el etiquetado CyDye
LisozymeEMD Chemicals5960
Mitoctracker Rojo/VerdeInvitrogen M7512/M7514Colorantes fluorescentes mitocondriales
MOPSEMD Chemicals6310
pEGFP-N1Clonetech6085-1Vector que expresa GFP
PfuStratagegene600-255-52
pGEX-5X-1 GE Healthcare Life Sciences28-9545-53Vector que expresa GST
Fluoruro de fenilmetilsulfoniloShelton ScientificIB01090PMSF
Solución salina tamponada con fosfatoLife Technologies14040PBS
Spectra/Por 4 tubo de diálisisSpectrum Labs132700como tubo de membrana porosa para diálisis
Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel StainLife TechnologiesP-33300Para la tinción de fosfoproteínas en geles 2D
Cóctel de inhibidores de proteinasaCalbiochem539134Para tampón de lisis celular
QuikChange kit de mutagénesis dirigida al sitioStratagene200519-5
QIAprep Spin Miniprep Kit MiniprepQiagen27104MiniPrep Kit de aislamiento de plásmidos
RO-3306Alexis Biochemicals270-463-M001Inhibidor de Cdk1
RotenonaMP Biomedicals150154Inhibidor del complejo I
Carbonato de sodioFisher ScientificS93359
Cloruro de sodioEMD ChemicalsSX0420-5Para tampón de lisis celular
Ortovanadato de sodioMP Biomedicals159664Para tampón de lisis celular
Pirofosfato de sodio decahidratoAlfa Aesar33385Para tampón de lisis celular Tampón
sodio β-glicerofosfatoAlfa AesarL03425Para tampón de lisis celular
SpectraMax M2e Molecular DevicesM2E Lectormicroplacas
SacarosaFisher Scientific57-50-1
Triturador de tejidosKimble Chase885301-0007Para el aislamiento de mitocondrias
Tubo de trituración de tejidosKimble Chase885303-0007Para el aislamiento de mitocondrias
Solución de ácido tricloroacéticoSigma AldrichT0699TCA
TrisMP Biomedicals103133
Triton-x-100TeknovaT1105
TripsinaCalbiochem650211
Typhoon ImagerGE Healthcare Life Sciences28-9558-09 Escáner degel láser para 2D-DIGE
UbiquinonaSigma AldrichC7956
conjugado conjugado de anticuerpos COX IV dirigida al sitio de de

Referencias

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