La capa externa del gránulo del cerebelo es el sitio de la amplificación de tránsito más grande en el cerebro en desarrollo. A continuación, presentamos un protocolo para orientar la modificación genética a esta capa en el pico de la proliferación mediante electroporación ex vivo y la cultura de las rebanadas del cerebelo a partir de embriones Día 14 embriones de pollo.
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Artículo de método
Ex Vivo Cultura de polluelo cerebelosos Rebanadas y espacialmente focalizadas Electroporación de gránulos precursores celulares
En este artículo
Resumen
Resumen
La capa externa del gránulo cerebelosa (EGL) es el sitio de la amplificación de tránsito más grande en el cerebro en desarrollo, y un excelente modelo para el estudio de la proliferación y diferenciación neuronal. Además, las modificaciones evolutivas de su capacidad proliferativa han sido responsables de la dramática expansión del tamaño del cerebelo en los amniotas, por lo que el cerebelo un excelente modelo para estudios de evo-devo del cerebro de los vertebrados. Las células que constituyen el EGL, progenitores granulares del cerebelo, también representan una célula importante de origen para el meduloblastoma, el tumor neuronal pediátrica más frecuente. Después de la amplificación de tránsito, los precursores de gránulos migran radialmente en la capa granular interna del cerebelo donde representan la mayor población neuronal en el cerebro mamífero maduro. En polluelo, el pico de la proliferación EGL se produce hacia el final de la segunda semana de gestación. Con el fin de apuntar a la modificación genética a esta capa enel pico de la proliferación, hemos desarrollado un método para la manipulación genética a través ex vivo electroporación de rebanadas cerebelo de embriones Día 14 embriones de pollo. Este método recapitula varios aspectos importantes de desarrollo in vivo de las neuronas gránulo y será útil en la generación de un conocimiento profundo de la proliferación de células granulares del cerebelo y la diferenciación, y por lo tanto del desarrollo del cerebelo, la evolución y la enfermedad.
Introducción
El cerebelo se encuentra en el extremo anterior de la parte posterior del cerebro y es responsable de la integración de procesamiento sensorial y motora en el cerebro madura, así como la regulación de los procesos cognitivos superiores 1. En los mamíferos y las aves, posee una morfología elaborado y está fuertemente foliada, un producto de la extensa amplificación de tránsito de progenitores durante el desarrollo que produce más de la mitad de las neuronas en el cerebro adulto. El cerebelo ha sido objeto de estudio para los neurobiólogos durante siglos y en la era molecular asimismo ha recibido mucha atención. Esto se refiere no sólo a su biología inherent....
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Protocolo
Nota: Todos los experimentos se realizaron con arreglo a la del Kings College de Londres, Reino Unido y las pautas de cuidado de animales Reino Unido Home Office.
1. Disección de e14 Cerebelo
- Incubar huevos marrones gallina embrionados a 38 ° C para el día embrionario 14.
- Con una tijera de huevo decapitan embrión de pollo in ovo y quitar la cabeza a una placa de Petri que contiene el hielo frío PBS (Figura 1).
- Con unas pinzas estándar, hacer incisiones detrás de cada ojo todo el camino a través del tejido, la eliminación de los ojos y la mandíbula superior. Hacer una segunda incisió....
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Resultados
En esta sección se ilustra ejemplos de los resultados que se pueden obtener mediante electroporación y la cultura del cerebelo rebanada de embriones Día 14 pollitos. La disección del cerebelo se ilustra en la Figura 1 y la cámara de electroporación establecido se muestra en la Figura 2. Se demuestra que es posible para electroporar y con éxito rebanadas cerebelares de cultivo, que retienen su estructura y morfologías cel.......
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Discusión
El protocolo informó aquí describe un método para la disección, la electroporación y cultivo de rebanadas de embrionario Día 14 cerebelo del polluelo. Este protocolo permite la focalización de electroporación para pequeñas regiones focales de la EGL, incluyendo aislados focalización de los lóbulos del cerebelo individuales. Permite el análisis genético y de imagen en alta resolución y conveniencia, ya un bajo costo en comparación con las técnicas establecidas en roedores 43-47. Este análisis no es posible en .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
El método presentado en este artículo surgió de un trabajo financiado por el BBSRC BB / I021507 / 1 (TB, RJTW) y una beca de doctorado MRC (MH).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Picadora de tejidos McIlwain | Mickle Laboratory Engineering Ltd | Corte a 300 μ m para obtener los mejores resultados. | |
| Medio basal Eagle (Gibco) | Life Technologies | 41010-026 | |
| L-glutamina | Sigma | G7513 | |
| penicilina/estreptomicina | Sigma | P4333 | |
| 0.4 μ m inserto de cultivo | Millipore | PICM0RG50 | |
| TSS20 Ovodyne electroporator | Intracel | 01-916-02 | Utilice 3 pulsos de 10 V y 10 mseg para la electroporación. |
Referencias
- Schmahmann, J. D. The role of the cerebellum in cognition and emotion: personal reflections since 1982 on the dysmetria of thought hypothesis, and its historical evolution from theory to therapy. Neuropsychology Review. 20, 236-260 (2010).
- Becker, E. B., Stoodley, C. J.
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Reimpresiones y permisos
