Imágenes en tiempo real de la Planta Dinámica superficie celular con Variable de ángulo epifluorescencia Microscopía

Summary

El objetivo de este protocolo es demostrar cómo monitorear la dinámica de proteínas con fluorescencia de etiquetado en las superficies celulares de las plantas con la microscopía de epifluorescencia de ángulo variable, mostrando parpadear puntos de PATROL1 GFP-etiquetados, una proteína tráfico de membrana, en la corteza celular del complejo estomático en Arabidopsis thaliana.

Abstract

La superficie celular de una planta es su interfaz para percibir las señales ambientales; responde con cambios biológicos celulares como el tráfico de membranas y el reordenamiento del citoesqueleto. El análisis de imágenes en tiempo real y de alta resolución de tales eventos intracelulares aumentará la comprensión de la biología de las células vegetales a nivel molecular. La microscopía de epifluorescencia de ángulo variable (VAEM) es una técnica emergente que proporciona imágenes de alta calidad en intervalos de tiempo de proteínas marcadas con fluorescencia en la superficie de las células vegetales. En este artículo, se describen los procedimientos prácticos para la preparación de muestras VAEM, el ajuste del sistema óptico VAEM, la captura de películas y el análisis de imágenes. Como ejemplo de observación del VAEM, se presentan resultados representativos sobre la dinámica de PATROL1. Se trata de una proteína esencial para el movimiento de los estomas, que se cree que está implicada en la entrega de la bomba de protones a las membranas plasmáticas del complejo estomático de Arabidopsis thaliana. La observación en tiempo real del VAEM de las células protectoras y las células subsidiarias en los cotiledones de A. thaliana mostró que los PATROL1 marcados con fluorescencia aparecieron como estructuras en forma de puntos en las membranas plasmáticas durante varios segundos y luego desaparecieron. El análisis del cimograma de los datos de la película VAEM determinó la distribución temporal de la presencia (denominada "tiempo de residencia") de las estructuras en forma de puntos. El uso de VAEM se analiza en el contexto de este ejemplo.

Introduction

La superficie de la célula vegetal, incluyendo la membrana plasmática y su citoplasma inmediatamente adyacente, es la región principal de la percepción e integración de una célula vegetal de las señales bióticas y abióticas del entorno extracelular. En respuesta a estas señales, los componentes de la superficie celular, incluidas las proteínas de la membrana plasmática y el citoesqueleto cortical, experimentan cambios dinámicos, en una escala de tiempo de segundos a minutos^1-4. Por lo tanto, las imágenes en tiempo real y de alta resolución de proteínas fluorescentes en la superficie celular pueden iluminar las respuestas de una planta a las señales ambientales a nivel molecular.

La microscopía de barrido láser confocal es una poderosa herramienta para la determinación de la localización de proteínas marcadas con fluorescencia³, sin embargo, a menudo es difícil monitorear la dinámica de proteínas en tiempo real debido a sus tiempos de captura relativamente largos. Una técnica emergente para el monitoreo en tiempo real de proteínas en la célula vegetal es la microscopía de epifluorescencia de ángulo variable (VAEM), que es una adaptación del equipo que se usa habitualmente para la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF). En la microscopía TIRF, la fuente de luz de excitación de fluorescencia es un campo de luz evanescente que se genera cuando el ángulo de entrada del láser es lo suficientemente superficial como para reflejar totalmente la luz internamente en la interfaz vidrio-agua. La profundidad de penetración del campo de luz evanescente es de alrededor de 100 nm. La microscopía TIRF es una herramienta excepcional para la obtención de imágenes de moléculas individuales, como la detección de exocitosis en células animales⁵. Sin embargo, la luz evanescente no puede llegar a las membranas plasmáticas o al citoplasma cortical de las células vegetales, porque tienen paredes celulares gruesas. Recientemente, el equipo de microscopía TIRF ha sido adaptado por biólogos de células vegetales, observando que un láser, si tiene un ángulo ligeramente más profundo que cuando se utiliza para inducir fenómenos de reflexión interna total, podría excitar la superficie de las muestras de células vegetales, lo que resulta en imágenes de células vegetales de alta calidad^6,7. La profundidad de la iluminación de excitación se varía ajustando el ángulo de entrada del láser; por lo tanto, esta técnica se describe como VAEM. Este sistema óptico también se denomina microscopía TIRF de ángulo variable (VA-TIRFM) porque existe la posibilidad de que se produzca una reflexión total en la interfaz pared-periplasma^{celular 7}, sin embargo, el término VAEM se utiliza en este artículo, según el primer informe en plantas⁶.

El objetivo de este protocolo es demostrar procedimientos prácticos para usar VAEM para visualizar la dinámica de proteínas marcadas con fluorescencia en superficies de células vegetales. Además, se describe un protocolo de análisis de imágenes para cuantificar el tiempo de residencia (duración de la presencia) de las moléculas para el análisis de películas VAEM. Se utiliza como ejemplo el parpadeo del punto GFP-PATROL1 en las células del complejo estomático en los cotiledones de Arabidopsis thaliana. PATROL1 fue identificado por aproximaciones genéticas directas como un gen causal de un mutante con defecto de respuesta estomática en A. thaliana⁸. PATROL1 es una planta homóloga de MUNC-13, que es un factor de cebado en la exocitosis 8 de la vesícula^sinapsis. En respuesta a las señales ambientales, como la luz o la humedad, se cree que la PATROL1 regula de forma reversible la entrega de una bomba de protones a las membranas plasmáticas del complejo estomático. Cada uno de los complejos estomatológicos comprende un par de células protectoras⁸ y células subsidiarias⁹, y requieren una bomba de protones para el movimiento de los estomas. En estas células, la PATROL1 marcada con GFP se localiza en estructuras en forma de puntos que permanecen en la membrana plasmática durante menos de 1 minuto⁹.

Protocol

1. Preparación de plántulas

1. Esterilizar las semillas.
   1. Preparar la solución de esterilización mediante la adición de 500 l NaClO (cloro disponible: 5,0%) y 1 l 10% de Triton X-100 a 500 l de agua estéril.
   2. Lugar ca. 10 transgénico A. thaliana semillas que llevan GFP-PATROL1 ⁸ en un tubo de 1,5 ml.
   3. Añadir 1 ml solución de etanol al 70%, y mezclar bien invirtiendo cinco veces. Dejar durante 1 min.
   4. Tenga en cuenta las semillas se hunden hasta el fondo del tubo. En una cabina de flujo laminar limpio, retire suavemente el etanol al 70% utilizando una micropipeta, y añadir 1 ml de solución de esterilización. Mezclar bien por inversión cinco veces y se deja durante 5 min.
   5. Lavar las semillas. Sigue trabajando en condiciones asépticas en un banco limpio, retire con cuidado la solución con una micropipeta, y añadir 1 ml de agua estéril. Repita esto cinco veces. Las semillas esterilizadas se pueden almacenar en agua estéril a 4 ° C durante 2 días.
2. Asi quew las semillas esterilizadas en un gellan 0,5% de goma solidificado media Murashige y Skoog placa de medio (pH 5,8) ^9. Cinta de la tapa sobre la placa usando dos capas de cinta quirúrgica.
3. Incubar la placa en la oscuridad a 4 ° C con una cámara de almacenamiento en frío, O / N.
4. La transferencia de la placa en una cámara de crecimiento fijado en 23,5 ° C, con un ciclo de luz-oscuridad / 12-hr 12 hr utilizando 100 mol m ^{-2 s} -1 luces blancas, y se incuba durante 7 días. Las plántulas con cotiledones de alrededor de 1 mm de largo y luego se pueden cosechar.

2. Sky gota Montaje de Cotiledón Especímenes

NOTA: Un factor importante en la preparación de muestras para la observación VAEM es evitar la inclusión de burbujas de aire entre la muestra y la cubierta de vidrio. Burbujas reducen en gran medida la calidad de imagen de VAEM al causar diferencias en el índice de refracción. Un método simple, lo que hemos llamado "caída del cielo 'de montaje, se puede utilizar para evitar burbujasentre la A. cotiledones thaliana y la cubierta de vidrio. Esto se debe hacer inmediatamente antes de la observación.

1. Coloque 30 l de tampón basal [5 mM 2- (N morfolino) etanosulfónico ácido-Tris (Tris-MES) a pH 6,5, KCl 50 mM, 100 mM CaCl _2] en el centro de un portaobjetos de vidrio (tamaño: 76 × 26 mm, espesor: 1,0 a 1,2 mm).
2. Retirar un cotiledón de una plántula de 7 días de edad, con unas tijeras de disección. Flotador el cotiledón con la cara de observación arriba en la caída de tampón basal (Figura 1, paso 1).
3. Ponga 30 l de tampón basal en el centro de una cubierta de vidrio (tamaño: 18 × 18 mm, espesor: 0,12-0,17 mm) (Figura 1, paso 2). Gire la cubierta de vidrio boca abajo con suavidad. La tensión superficial evitará la caída de tampón de caerse. Sostenga la cubierta de vidrio con pinzas en un borde. Coloque el borde opuesto sobre el portaobjetos de vidrio de modo que la caída de tampón es de aproximadamente por encima del cotiledón.
4. Con el borde de la cubierta de vidrio aún en la diapositiva, y todavía con el borde opuesto con pinzas, ajustar la posición de la caída de amortiguación bajo la cubierta de vidrio para que sea directamente sobre la muestra cotiledones (Figura 1, paso 3). Dejar de lado la cubierta de vidrio. Montar una gota en la muestra resultante en una preparación sin burbujas de aire.
5. Limpie el exceso de buffer usando tejidos sin pelusa. Observar la preparación inmediatamente (ver paso 3).
   NOTA: No hay necesidad de sellar las muestras.

3. VAEM Observación y Movie Adquisición

NOTA: El sistema de microscopio TIRF ⁹ utilizado en el presente estudio se describe como sigue: un microscopio invertido está equipado con una unidad de TIRF y una lente objetivo TIRF con una apertura numérica de 1,49. Para el control informatizado del ángulo de entrada del láser, se utiliza una caja de control. Proteína verde fluorescente (GFP) se excita con un 488 nm láser semiconductor de bombeo óptico, y tque la fluorescencia se detecta a través de un filtro de paso de banda 510 a 550 nm para evitar que la autofluorescencia de los cloroplastos. El valor máximo medido de la potencia de salida de la fibra es 13,0 a 13,5 mW. Para la detección, un electrón multiplicando dispositivo de carga acoplada (EM-CCD) sistema de cabezal de la cámara y una unidad de cambio de magnificación de la cámara de montaje C se utilizan.

1. Calibrar centrar el láser y el enfoque de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   NOTA: Este paso es crucial para las observaciones VAEM precisas. Se recomienda encarecidamente que los controles periódicos de los procedimientos de ajuste de trayectoria láser, apropiado a su microscopio, se llevan a cabo.
   1. Determinar la posición central iluminada con una trayectoria de la luz sin lente objetivo en el techo de la sala de microscopía. Para marcar la posición central, poner un sello de color en el techo (Figura 2, paso 1, 2).
   2. Ilumine el techo con una lente objetivo (Figura 2, paso 3, 4). Mueva el illuminated región a la posición central (Figura 2, paso 5). Enfoque el láser (figura 2, paso 6). Ajustar la posición del láser enfocado hacia el centro (figura 2, paso 7).
2. Establecer un ejemplar en la platina del microscopio y seleccionar celdas de observación utilizando iluminación de campo brillante.
3. Compruebe que la proteína fluorescente se puede observar en las células, y fijó la posición de la z eje x en la superficie celular mediante la iluminación de epifluorescencia (Figura 3A).
4. Realizar observaciones VAEM.
   1. Inclinar el ángulo de entrada del haz de láser gradualmente con la caja del controlador. Al mismo tiempo, controlar la imagen en vivo con cuidado. Inicialmente, la imagen será borrosa (Figura 3B).
   2. A medida que el ángulo aumenta láser, la imagen VAEM será menos borrosa, finalmente producir un imagen clara (Figura 3C y D). En este punto, dejar de Increacantar el ángulo láser. Si se pierde la señal de fluorescencia, disminuya a un ángulo menos profundo.
   3. Ajustar el ángulo de entrada de láser para obtener una mejor imagen. Puesta a punto de la posición del eje x z también puede mejorar la imagen. Si es necesario, ajuste los parámetros ópticos (energía láser, longitud de onda y de conjunto de filtros) y parámetros del sensor de imagen [tamaño de imagen, tiempo de exposición, ganancia, digitalizador y (EM) de ganancia de electrones multiplicando].
      NOTA: En el caso de los equipos microscopio TIRF ha descrito anteriormente, los parámetros representativos son los siguientes. Ampliación de la lente justo en frente de la cámara: 2X; Salida de láser: 1,0 mW; Tamaño de imagen: 512 × 512 píxeles; Tiempo de exposición: 100 ms; Ganancia: 5 ×; Digitalizador: 11 MHz; y EM ganancia: 100.
5. Adquirir una película como una de varias páginas TIFF archivo de imagen utilizando el software microscopio comercial. En este caso, la película es de puntos GFP-etiquetados parpadeantes en la superficie de las células de los estomas.
   NOTA: las condiciones de adquisición de imágenes representativas son como folmínimos. Modo de adquisición: Corriente de RAM; Número de imágenes: 600; y el tamaño de varias páginas TIFF: ~ 302 MB.

4. Análisis quimógrafo para la cuantificación de GFP-etiquetados Dot Residencia Tiempo Usando Fiji Software

1. Instale Fiji ('Fiji es Justo ImageJ') de software ¹⁰ usando las instrucciones de los autores (http://fiji.sc/Fiji).
2. Ejecute Fiji y abra el archivo TIFF de varias páginas adquirida mediante el menú Fiji "Archivo-Abrir".
3. Coloque una línea en el sitio de interés, utilizando la herramienta de menú de la barra de Fiji "Herramienta de selección Línea Recta". Opcionalmente, utilice la "Herramienta de selección de línea segmentada" o "Herramienta de selección Línea a mano alzada". En los resultados presentados aquí, una línea recta de 100 pixeles (correspondientes a 8,0 M) se colocó en una célula subsidiaria (Figura 4A).
4. Hacer una imagen quimógrafo usando el menú de Fiji "Imagen-Pilas-Dynamic Reslice "(http://fiji.sc/Dynamic_Reslice) (Figura 4B). Opcionalmente, "Flip vertical" y "Girar 90 grados" en una ventana de la casilla de verificación también están disponibles (no se utiliza en los resultados presentados aquí). La x y eje y en la imagen quimógrafo indican la posición de la línea (100 píxeles correspondiente a 8,0 micras) y el tiempo de observación (600 píxeles correspondientes a 60 seg), respectivamente. Si la imagen quimógrafo no es satisfactoria, la posición y el tipo (recta, segmentados y mano alzada) de la línea en la imagen de varias páginas se pueden cambiar. Como los cambios en la formación, la imagen quimógrafo cambia dinámicamente. Guarda una imagen de quimógrafo como un archivo TIFF usando el menú de Fiji "Archivo-Guardar como-Tiff".
5. Mida la longitud de la burbuja en la orientación del eje de tiempo.
   1. Para llevar a cabo la reducción de ruido, aplicar un filtro gaussiano a las imágenes quimógrafo utilizando el menú de Fiji "Process-Filtros-Gaussian Blur". El "Sigma (Radius) "parámetro es sintonizable (1 radio de píxeles se utiliza para los resultados presentados).
   2. Segmento de las regiones de señal de umbral, utilizando el menú de Fiji "Imagen-Adjust-Umbral".
      NOTA: Hay varios algoritmos de umbral para elegir. En los resultados presentados, el algoritmo "Yen" fue elegido (Figura 4C).
   3. Prepárese para medir el tiempo (y) eje x longitud de la burbuja con el menú "Analizar-Set Mediciones". Compruebe el "rectángulo delimitador" en la ventana "Medidas Set". Lo ideal sería que el área de juego debe ser lo más pequeño posible, para excluir el ruido. En este caso, el área mínima se fijó en 50 píxeles. Medir el tiempo (y) eje x longitud de la burbuja con el menú "Analizar-Analizar Partículas". Para obtener los valores de los resultados y demostrar la credibilidad de las regiones de medición, compruebe los "Mostrar resultados" y "Añadir a Gerente </ em> "cajas.
   4. Los valores en la columna "Altura" son el tiempo (y) eje x longitudes para la mancha de medición (Figura 4D). Guarde los valores utilizando el menú de la tabla Resultados "Archivo-Guardar como" y calcular y procesar el conjunto de datos de las duraciones imagen blob utilizando un paquete estadístico y / o software de hoja de cálculo (Figura 4E).

Results

En este artículo de vídeo, los protocolos para VAEM observación de GFP-PATROL1 en A. Se proporcionan células complejas thaliana cotiledones estomas. Montaje caída del cielo es un método de preparación simple que puede ayudar a reducir la aparición de burbujas de aire en los preparativos VAEM de A. cotiledones thaliana (Figura 1). Inclinación excesiva del láser de entrada y / o z-posicionamiento de muestras para VAEM proporcionará una imagen clara. Si eso sucede, se re...

Discussion

En este artículo de vídeo, los protocolos se dan para el seguimiento y la medición del comportamiento dinámico de puntos GFP-PATROL1 en el complejo de los estomas de Arabidopsis thaliana. Como se muestra aquí, la observación VAEM es una poderosa herramienta para imágenes en vivo de las superficies celulares de las plantas. Bajo las condiciones experimentales utilizadas aquí para la supervisión GFP-PATROL1, había muy poco photobleaching fluorescencia en la muestra utilizada para 1 min de captura de vídeo, debido...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopio invertido	Olympus	IX-73
TIRF unidad	Olympus	IX3-RFAEVAW
TIRF lente de objetivo	Olympus	UAPON 100 y tiempos; OTIRF	NA = 1,49
Caja de control de ángulo láser	Chuo Seiki	QT-AK
Láser semiconductor bombeado ópticamente		Zafiro coherenteTM LP USB 488-20 CDRH Laser
510– Filtro de paso de banda de 550 nm	Cámara Olympus	U-FBNA
EM CCD	Hamamatsu Photonics	ImagEM C9100-13
de cambio de aumento de la cámara con montura C	Olympus	U-TVCAC
MetaMorph software	Molecular Devices	MetaMorph versión 7.7.11.0
Manual de microscopía TIRF	Olympus	AX7385	Instrucciones: Sistema de iluminación de reflexión interna total (Impreso en Japón el 24 de agosto de 2012)
Aceite de inmersión	Olympus	Aceite de inmersión Typr-F	ne = 1.518 (23 grados)