Imágenes en tiempo real de la Planta Dinámica superficie celular con Variable de ángulo epifluorescencia Microscopía

Resumen

El objetivo de este protocolo es demostrar cómo monitorear la dinámica de proteínas con fluorescencia de etiquetado en las superficies celulares de las plantas con la microscopía de epifluorescencia de ángulo variable, mostrando parpadear puntos de PATROL1 GFP-etiquetados, una proteína tráfico de membrana, en la corteza celular del complejo estomático en Arabidopsis thaliana.

Resumen

La superficie celular de una planta es su interfaz para percibir las señales ambientales; responde con cambios biológicos celulares como el tráfico de membranas y el reordenamiento del citoesqueleto. El análisis de imágenes en tiempo real y de alta resolución de tales eventos intracelulares aumentará la comprensión de la biología de las células vegetales a nivel molecular. La microscopía de epifluorescencia de ángulo variable (VAEM) es una técnica emergente que proporciona imágenes de alta calidad en intervalos de tiempo de proteínas marcadas con fluorescencia en la superficie de las células vegetales. En este artículo, se describen los procedimientos prácticos para la preparación de muestras VAEM, el ajuste del sistema óptico VAEM, la captura de películas y el análisis de imágenes. Como ejemplo de observación del VAEM, se presentan resultados representativos sobre la dinámica de PATROL1. Se trata de una proteína esencial para el movimiento de los estomas, que se cree que está implicada en la entrega de la bomba de protones a las membranas plasmáticas del complejo estomático de Arabidopsis thaliana. La observación en tiempo real del VAEM de las células protectoras y las células subsidiarias en los cotiledones de A. thaliana mostró que los PATROL1 marcados con fluorescencia aparecieron como estructuras en forma de puntos en las membranas plasmáticas durante varios segundos y luego desaparecieron. El análisis del cimograma de los datos de la película VAEM determinó la distribución temporal de la presencia (denominada "tiempo de residencia") de las estructuras en forma de puntos. El uso de VAEM se analiza en el contexto de este ejemplo.

Introducción

La superficie de la célula vegetal, incluyendo la membrana plasmática y su citoplasma inmediatamente adyacente, es la región principal de la percepción e integración de una célula vegetal de las señales bióticas y abióticas del entorno extracelular. En respuesta a estas señales, los componentes de la superficie celular, incluidas las proteínas de la membrana plasmática y el citoesqueleto cortical, experimentan cambios dinámicos, en una escala de tiempo de segundos a minutos^1-4. Por lo tanto, las imágenes en tiempo real y de alta resolución de proteínas fluorescentes en la superficie celular pueden iluminar las respuestas de una planta a las señales ambienta....

Protocolo

1. Preparación de plántulas

1. Esterilizar las semillas.
   1. Preparar la solución de esterilización mediante la adición de 500 l NaClO (cloro disponible: 5,0%) y 1 l 10% de Triton X-100 a 500 l de agua estéril.
   2. Lugar ca. 10 transgénico A. thaliana semillas que llevan GFP-PATROL1 ⁸ en un tubo de 1,5 ml.
   3. Añadir 1 ml solución de etanol al 70%, y mezclar bien invirtiendo cinco veces. Dejar durante 1 min.
   4. Tenga en cuenta las semillas se hunden hasta el fondo del tubo. En una cabina de flujo laminar limpio, retire suavemente el etanol al 70% utilizando una micropipeta, y añadir 1 ml de solución de este....

Resultados

En este artículo de vídeo, los protocolos para VAEM observación de GFP-PATROL1 en A. Se proporcionan células complejas thaliana cotiledones estomas. Montaje caída del cielo es un método de preparación simple que puede ayudar a reducir la aparición de burbujas de aire en los preparativos VAEM de A. cotiledones thaliana (Figura 1). Inclinación excesiva del láser de entrada y / o z-posicionamiento de muestras para VAEM proporcionará una imagen clara. Si eso sucede, se re.......

Discusión

En este artículo de vídeo, los protocolos se dan para el seguimiento y la medición del comportamiento dinámico de puntos GFP-PATROL1 en el complejo de los estomas de Arabidopsis thaliana. Como se muestra aquí, la observación VAEM es una poderosa herramienta para imágenes en vivo de las superficies celulares de las plantas. Bajo las condiciones experimentales utilizadas aquí para la supervisión GFP-PATROL1, había muy poco photobleaching fluorescencia en la muestra utilizada para 1 min de captura de vídeo, debido.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Microscopio invertido	Olympus	IX-73
TIRF unidad	Olympus	IX3-RFAEVAW
TIRF lente de objetivo	Olympus	UAPON 100 y tiempos; OTIRF	NA = 1,49
Caja de control de ángulo láser	Chuo Seiki	QT-AK
Láser semiconductor bombeado ópticamente		Zafiro coherenteTM LP USB 488-20 CDRH Laser
510– Filtro de paso de banda de 550 nm	Cámara Olympus	U-FBNA
EM CCD	Hamamatsu Photonics	ImagEM C9100-13
de cambio de aumento de la cámara con montura C	Olympus	U-TVCAC
MetaMorph software	Molecular Devices	MetaMorph versión 7.7.11.0
Manual de microscopía TIRF	Olympus	AX7385	Instrucciones: Sistema de iluminación de reflexión interna total (Impreso en Japón el 24 de agosto de 2012)
Aceite de inmersión	Olympus	Aceite de inmersión Typr-F	ne = 1.518 (23 grados)

Unidad