Un método simple para la fase sólida automatizada Extracción de muestras de agua para análisis inmunológico de los pequeños contaminantes

Resumen

Se presenta un protocolo para la extracción y preconcentración de estradiol de muestras de agua mediante el uso de un sistema automatizado y miniaturizado.

Resumen

Se propone un nuevo método para la extracción en fase sólida (SPE) de muestras de agua del medio ambiente. El prototipo desarrollado es rentable y fácil de usar, y permite realizar SPE rápida, automatizada y sencilla. La solución de pre-concentrada es compatible con el análisis por inmunoensayo, con un contenido de disolvente orgánico de bajo. Se describe un método para la extracción y pre-concentración de hormona natural 17β-estradiol en muestras de 100 ml de agua. SPE en fase inversa se realiza con sorbente octadecil-sílice y la elución se realiza con 200 l de metanol 50% v / v. Eluyente se diluye mediante la adición de agua DI para reducir la cantidad de metanol. Después de preparar manualmente la columna de la SPE, el procedimiento general se realiza automáticamente dentro de 1 hora. Al final del proceso, la concentración de estradiol se mide mediante el uso de un ensayo de inmuno-sorbente ligado a enzima comercial (ELISA). 100 veces pre-concentración se consigue y el contenido de metanol en sólo el 10% v / v. Recuperaciones completas de la moléculase consiguen con 1 ng / L claveteado muestras desionizada y sintéticos de agua de mar.

Introducción

Preparación de la muestra es un paso importante en cualquier proceso analítico. En particular, la eliminación de los efectos de matriz, disminución de interferencias, y el enriquecimiento de la sustancia analizada son necesarios para obtener resultados precisos y llegar a los límites de detección bajos. Compuestos disruptores endocrinos (EDC) son de particular interés debido a su acción sobre los organismos vivos, incluso cuando están presentes en niveles muy bajos en el medio ambiente. La hormona natural 17β-estradiol está presente en la contaminación de las aguas de la UE Lista de Vigilancia y propenso a ser añadido a la lista de sustancias prioritarias reguladas por la Directiva Marco del Agua. Extracción en fase sólida (SPE) se aplica comúnmente para el análisis de pequeños contaminantes en el agua, con tanto químicos ^{1-5 (cromatografía,} espectrometría de masas) y ^6-9 métodos de detección inmunológicos. Este último ganó interés en el campo de la vigilancia del medio ambiente, como los inmunoensayos están disponibles en gran variedad de formatos, son específicos de la target analito, y alcanzar límites de detección bajos. ^{6, 7, 10, 11 Varios} ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA) están disponibles comercialmente y permiten analizar múltiples muestras a la vez en una placa de múltiples pocillos. El procedimiento consiste en las etapas de reacción sucesivas que pueden tardar un par de horas. El producto final de la reacción se puede detectar ópticamente para determinar la concentración de la molécula diana sobre la base de una curva de calibración.

Procedimientos clásicos SPE incluyen sorbente pre-acondicionado, extracción de la muestra, lavado, elución, y la concentración por evaporación del eluyente. El disolvente utilizado para la dilución de este extracto se elige en función del método de detección. Para los métodos inmunológicos, la cantidad de influencias disolventes orgánicos fuertemente la sensibilidad del método. ¹²

Además de la recuperación y las actuaciones pre-concentración, el método también debe ser sencilla y rentable. Automatización del procedure ayuda a reducir los errores relacionados con humanos. En nuestro trabajo ^anterior 13 introdujimos nuestro prototipo para SPE automatizado, y nuestro método se aplicó al análisis de la hormona natural 17β-estradiol en muestras de agua de mar. Con el presente vídeo nos gustaría resaltar las ventajas técnicas de aplicación de este método en comparación con los tradicionales off-line y on-line SPE, y su compatibilidad especial con detección por inmuno-reacciones. Se describe el protocolo aplicado a muestras de agua para la detección de 17β-estradiol. SPE se realiza con octadecil-sílice (C18) fase sorbente y la elución se realiza con metanol diluido.

Protocolo

Nota: El siguiente protocolo describe la SPE realiza en muestra de 100 ml de agua con sorbente C18 y elución con 50% v / v de metanol. La muestra enriquecida se diluye hasta alcanzar el 10% v / v de metanol antes del análisis con un ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA) kit.

1. Preparación de los Reactivos

1. Preparar las muestras de agua
   1. Antes de cualquier otra medida, filtrar cada muestra de 100 ml de agua con filtros de tamaño de 0,2 micras de poro.
   2. Pico de la muestra con concentración deseada mediante la dilución de volumen apropiado de solución de referencia en un volumen de agua. Por ejemplo, preparar 100 ml de muestra de agua con 100 ng / L de E2 mediante la dilución de 3,3 l de solución de referencia E2 a una concentración de 300 g / L. Diluir esta solución diez veces para obtener una muestra enriquecida con 10 ng / L de E2. Diluir este último otros diez veces para obtener una muestra de 100 ml con 1 ng / L E2.
   3. Coloque la muestra filtrada (no modificada o pinchos) en una botella de vidrio con GHilo L45. Utilice la muestra en el mismo día. Tomar una pequeña fracción a ser analizada con el ELISA para estimar la concentración inicial.
2. Preparar 300 l de eluyente mediante la dilución de metanol en (di-) agua desionizada a 50% v / v en un tubo apretado.

2. Preparación de la columna SPE

1. Preparar una 20 mg / ml de suspensión de partículas de sorbente octadecil-sílice mediante la adición de primeros 1.600 l de metanol y luego 400 l de agua-di a 40 mg de sorbente de fase inversa. Cierre bien la tapa y agitar con un vórtice.
2. Instalación de la membrana inferior en la columna
   1. Seleccione una membrana de nylon con tamaño de poro de 11 micras y colocarlo en una doble capa de tejido anti-polvo. Con un punzón de diámetro de 3 mm, cortar dos piezas pequeñas en la membrana.
   2. Coge una de las pequeñas membranas con un filtro de gama plana pinzas y colocarlo en un lado de la columna.
   3. Atornille el conector de fondo plano con el tubo y apriete. La membrana es now en su lugar y el sorbente se puede añadir de forma segura. Dibuja una flecha en el cuerpo de la que señala la columna hacia el final, donde se colocó la membrana.
3. Preparación de la columna empaquetada sorbente
   1. Asegure la columna sobre el soporte con la flecha apuntando hacia la parte inferior. La columna se debe establecer lo más verticalmente posible.
   2. Adjuntar un vacío de 10 ml jeringa desechable hasta el final del tubo de la columna, mediante el uso de los conectores Luer-Lock.
   3. Preparar un micro-pipeta con una punta de 20 a 200 l, ajuste el volumen a 100 l. Este formato punta de pipeta está adaptado al tamaño de la columna de sorbente que estar preparado. El procedimiento sería más difícil con puntas de pipeta más grandes tales como las que se usan con 1 ml pipetas.
   4. Agite la suspensión absorbente con un vórtice, y pipetear rápidamente 100 l en el centro de la columna. Mientras que la inyección, aspirado suavemente toda la solución de pipeteado artesa la membrana mediante el uso de la jeringa con la otra mano. En este ptla edad, la solución de llenado de la jeringa debe estar libre de partículas y un lecho de partículas con el tiempo puede ser observado en la columna.
   5. Repita este proceso 2 veces más agitando la suspensión de acciones entre todos los pasos de pipeteo para asegurar suspensión homogénea de las partículas en la solución. La columna resultante contiene 6 mg de sorbente.
   6. Cuando los 300 l de suspensión se han cargado y se secó por aspiración con la jeringa, mantener la jeringa en posición y colocar la segunda membrana de nylon en la parte superior mediante el uso de las pinzas con la otra mano.
   7. Atornille el segundo conector con el tubo y desechar la jeringa. La columna SPE está listo para su uso.

3. Preparación del sistema

1. Apriete la columna de la SPE en el dispositivo mediante el uso de los conectores Luer-Lock. La flecha debe estar apuntando a la misma dirección que la que se muestra en el dispositivo.
2. Conectar la botella que contiene la muestra al dispositivo atornillando elproporcionado tapón de seguridad GL45 en él.
3. Cargue 200 l de eluyente en el depósito 'Eluent'.
4. Carga 800 l de agua di en el embalse 'dilución'.
5. Coloque una botella en la salida de desechos para recoger el agua procesada durante el paso de extracción. El formato no es importante, pero el volumen debe ser lo suficientemente grande con respecto al volumen de la muestra.
6. Coloque un pequeño frasco en la salida del sensor con la capacidad de volumen mínimo de 1,5 ml. Un volumen máximo de 1 ml será demasiado pequeño como se formarán burbujas en esta salida en la recogida de eluyente enriquecido y tampón de dilución.
7. Compruebe el regulador de presión está en posición cerrada girando manualmente, revertir las agujas del reloj hasta que el movimiento adicional no es posible.

4. SPE con el Prototipo

1. Encienda el prototipo pulsando el botón en la espalda.
2. Preparación de la interfaz de usuario y la selección del programa
   1. Abra la interfaz de usuario. Seleccionarel puerto de comunicación del ordenador al que está conectado el dispositivo de la lista y haga clic en el botón "Siguiente".
   2. Introduzca los valores para el conjunto de procesadores 580 y 30 para dpset. La bomba se ajustará para mantener la presión en el sistema de presión y depósitos a 580 ± 30 mbar cuando se ejecuta.
   3. Seleccione el modo automático.
   4. En la esquina modo automatizado, cargue el archivo de programa en la "ruta del archivo de configuración 'caja.
3. Ajuste del regulador de presión
   1. Encienda la bomba.
   2. Gire manualmente el regulador de presión hasta que el valor leído por preg es inferior, pero cerca de 320 mbar.
   3. Parar la bomba.
4. Inicio del procedimiento de SPE
   1. Pulse 'inicio' en la esquina automatizado modo. La bomba se encenderá y las etapas de extracción, elución y dilución seguirá automáticamente entre sí. Todo el procedimiento para una muestra de 100 ml se lleva a cabo en 50 min.
   2. Verifique el valor de preg. Debe estar en el rango de 320 hasta 350 mbar durante la etapa de extracción para asegurar un caudal óptimo.
   3. Cierre el pequeño vial y almacenar a 4-5 ° C en la oscuridad hasta su análisis. Realizar análisis en la siguiente 30 hr para evitar la degradación del analito.
   4. Deseche el agua procesada.
5. Limpieza del sistema
   Nota: Después de cada procedimiento de extracción del sistema necesita ser limpiado para evitar la contaminación cruzada.
   1. Preparar una solución de 10 ml de metanol 70% v / v en una botella de vidrio GL 45.
   2. Desenchufe la columna de la SPE y conecte el tubo con conectores.
   3. En el modo automático, seleccione el archivo de 'limpieza' y empezar con la misma configuración de presión.

5. La detección de la concentración de estradiol con ELISA

1. Preparar las muestras de calibración con concentraciones como se indica en el protocolo proporcionado con el kit de ELISA que se utiliza. Preparar un solo calibración de conjunto con la misma matriz que la muestra, y uno conjunto de calibración con metanol 10% v / v.
2. Dispense la cantidad necesaria de muestra en los pocillos de la placa, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Utilice muestras de calibración, muestras no modificadas y pinchos de agua que se filtraron, pero no procesados ​​con SPE y enriquecieron muestras en metanol al 10% v / v. Utilice 3 pocillos por muestra para reducir el error asociado con el ensayo.
3. Siga las indicaciones del protocolo que se proporciona con el kit para la adición de reactivos, tiempo de incubación, el lavado y la posterior reacción con la enzima.
4. Leer la señal óptica en cada pocillo de acuerdo con las instrucciones del fabricante kit con un instrumento lector de placas y recoger los datos.
5. Utilice el software del instrumento lector de placas para adaptarse a las curvas de calibración y determinar la concentración de E2 en la muestra inicial con misma matriz, y en las muestras enriquecidas con metanol 10% v / v.

Resultados

Reproducibilidad de embalaje sorbente se evaluó mediante el secado y la ponderación de la sorbente pipeteado en viales de vidrio y el resultado se muestra en la Figura 1. Reproducibilidad del momento de la inyección fue probado para muestras de 100 ml, como se muestra en la Figura 2. Concentración en inicial y pre concentrada claveteado muestras se determinaron mediante el uso de un kit comercial de ELISA para 17β-estrad...

Discusión

Se propuso un nuevo método para la preparación de muestras de agua, seguido de análisis mediante inmunoensayo. El instrumento permite realizar extracción en fase sólida en una forma automatizada y fácil de usar.

La filtración de la muestra de agua antes de su inyección en el sistema es crítico. Cualquier partículas aún presentes en la solución sería potencialmente causar la obstrucción de la red fluídica y obstruir la columna de la SPE. Otro paso importante es la preparación de la columna de...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Membrana filtrante 0,2 μ m tamaño de poro	Merck Millipore	GNWP04700	Para la filtración de muestras
Membrana de nailon 11 μ m tamaño de poro	Merck Millipore	NY1104700	Para columna SPE
Punzón de biopsia desechable 5 mm	Presupuesto médico	39302439
Nucleodur C18 ec	Macherey Nagel	713550.01	50 μ m diámetro de partícula
Agua de mar sintética	Sigma Aldrich	SSWS500-500ML
Metanol	VWR
17beta-estradiol estándar	Enzo Life Science		300 ng/ml
17beta-estradiol Kit ELISA	Enzo Life Science	ADI-900-008	96 pocillos, rango 30 - 3.000 ng/L