Impulsada por la luz enzimática descarboxilación

Summary

Se describe un protocolo para la generación de luz catalizada de peróxido de hidrógeno - un cofactor para las transformaciones oxidativas.

Abstract

Oxidorreductasas pertenecen a las enzimas industriales más aplicados. Sin embargo, necesitan electrones externos cuyo suministro es a menudo costoso y difícil. Reciclaje del NADH o NADPH donantes de electrones requiere el uso de enzimas adicionales y sustratos de sacrificio. Curiosamente, varios oxidorreductasas aceptan peróxido de hidrógeno como donante de electrones. A pesar de ser de bajo costo, este reactivo a menudo reduce la estabilidad de las enzimas. Una solución a este problema es la generación in situ del cofactor. El suministro continuo de la cofactor a baja concentración conduce la reacción sin deteriorar la estabilidad de la enzima. Este documento muestra un método para la luz catalizada por la generación in situ de peróxido de hidrógeno con el ejemplo de la descarboxilasa del ácido graso hemo-dependiente OLET _JE. La decarboxilasa del ácido graso OLET _JE fue descubierto debido a su capacidad única de producir de cadena larga 1-alquenos a partir de ácidos grasos, un enzimática hasta ahora desconocidoreacción. 1-alquenos son ampliamente utilizados para aditivos plastificantes y lubricantes. OLET _JE se ha demostrado que aceptar electrones de peróxido de hidrógeno para la descarboxilación oxidativa. Mientras que la adición de peróxido de hidrógeno, la enzima daños y resulta en bajos rendimientos, la generación in situ del cofactor evita este problema. El sistema photobiocatalytic muestra claras ventajas con respecto a la actividad enzimática y el rendimiento, lo que resulta en un sistema simple y eficiente para la descarboxilación de ácidos grasos.

Introduction

El cambio climático y el previsible agotamiento de los recursos renovables supone una seria amenaza para nuestra sociedad. En este contexto, la catálisis enzimática representa un potencial todavía no está completamente explotado para el desarrollo de la química sostenible y "verde" ^1. Oxidorreductasas tienen la capacidad de catalizar la introducción y modificación de grupos funcionales bajo condiciones de reacción suaves y pertenecen a los biocatalizadores más importantes ^2. La mayoría de las transformaciones redox requieren el suministro de externo de cofactores tales como NAD (P) H. Los métodos para la regeneración de cofactor se han aplicado en escala industrial. Sin embargo, todavía resultan en altos costos del proceso, lo que limita su aplicación sobre todo a los productos de alto valor. Curiosamente, varios peroxidasas ^3,4 y monooxigenasas P450 ⁵ aceptan electrones de peróxido de hidrógeno a través de la denominada shunt peróxido. Mientras que _el H ₂ O ₂ es un co-reactivo barato, se informa harmful para muchas enzimas. Una constante en la formación in situ de bajas concentraciones de peróxido de hidrógeno es un enfoque viable para conducir la reacción sin deteriorar la estabilidad operativa de la enzima.

Figura 1. Estructura de ensayo de la descarboxilación de los ácidos grasos photobiocatalytic por OLET _JE. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El uso de la luz como fuente de energía para los procesos químicos y biológicos ha estado recibiendo una atención creciente en los últimos años ^6. Generación de luz impulsada de peróxido de hidrógeno se ha convertido en un método fácil y robusto para suministrar peróxido de hidrógeno para las transformaciones redox (Figura 1). Un fotocatalizador tal como flavina adenina lunonucleotide (FMN) permite la reducción de oxígeno molecular a peróxido de hidrógeno, que se utiliza entonces como cofactor para la reacción enzimática oxyfunctionalization. donantes de electrones posibles son ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ascorbato o el formiato de bajo costo. El método es aplicable en general para el H ₂ O ₂ enzimas dependientes, incluyendo las peroxidasas ^3,4 y monooxigenasas P450 ^5.

Hemos investigado recientemente la aplicación de una novela descarboxilasa bacteriana ⁷ para la transformación de las grasas naturales en olefinas ^8. Esto sería una vía sostenible para la síntesis de productos químicos plataforma ampliamente usadas de una fuente de base biológica. La descarboxilasa OLET _JE de la bacteria Jeotgalicoccus sp gram-positiva. cataliza la descarboxilación oxidativa de los ácidos grasos y forma 1-alquenos como productos. OLET _JE está estrechamente relacionado con monooxigenasas P450 bacterianas y necesita electrones fperóxido de hidrógeno rom para la reacción.

Desafortunadamente, la adición de H ₂ O ₂ a una solución de sustrato y la enzima resultó en conversiones bajas y una mala reproducibilidad de los resultados, debido presumiblemente a un efecto perjudicial de peróxido de hidrógeno en la estabilidad de OLET _JE. Generación de una proteína de fusión con la NADPH-reductasa RhFred realizó una descarboxilación dependiente de NADPH posible. ⁹ Sin embargo, el alto precio de NADPH y las limitadas posibilidades actuales para una regeneración rentable nos llevó a investigar donantes de electrones más baratos. Inspirado por la similitud de OLET _JE con monooxigenasas P450, se utilizó la generación de luz catalizada por H ₂ O _2. Tuvimos el placer de obtener altas conversiones (hasta> 95%) utilizando extractos libres de células o soluciones de enzimas purificadas.

Con el ejemplo de descarboxilación de ácidos grasos, se presenta un protocolo general para la enzima de la luz impulsadaATIC transformaciones redox utilizando FMN como el peróxido de hidrógeno como fotocatalizador y cofactor. Los métodos presentados incluyen la producción de la enzima en células recombinantes de E. coli, la purificación de la enzima, la aplicación para la síntesis de 1-alquenos y el análisis de los productos de reacción.

Protocol

Precaución: Por favor, consulte a todas las hojas de datos de seguridad de materiales pertinentes (MSDS) antes de usar. Varios de los productos químicos utilizados en estas síntesis son muy tóxico y cancerígeno. Todas las etapas que implican disolventes orgánicos nocivos, en particular la extracción de los productos de reacción y la derivatización de los ácidos grasos deben llevarse a cabo bajo una campana de extracción usando el equipo de protección personal (gafas de seguridad, guantes, bata de laboratorio, pantalones largos, zapatos cerrados ). Todas las operaciones que implican organismos modificados genéticamente en este trabajo requieren instalaciones que están aprobados para el manejo de organismos modificados genéticamente del nivel de seguridad S1.

1. Expresión de la descarboxilasa recombinante en E. OLET _JE coli

1. Preparación de la cepa de producción
   1. Preparar un gen sintético de OLET _JE de Jeotgalicoccus y se clonó en el vector de expresión pASK-IBA37plus como se describe. ⁸ NOTA: Para evitar la degradación de los ácidos grasos por las enzimas del metabolismo bacteriano, E. se utilizó coli cepa JW5020 de la colección de Keio con una vía disfuncional para la degradación de ácidos grasos.
2. El cultivo y la inducción de la expresión de la enzima
   1. Preparar un precultivo inoculando la E. coli JW5020 OLET mutante de una placa de LB-(que contiene 100 mg ml ^-1 ampicilina) en dos de 3 ml de medio LB en tubos de ensayo. Ampicilina pipeta (100 mg ml ^-1) de una solución madre en el medio de selección y se incuba a 37 ° C durante 15 horas en una incubadora de agitación a 180 rpm.
   2. Añadir 2 ml de las culturas pre-dos 200 ml de medio LB, que contenía ampicilina (100 mg ml ^-1), en 1 L de frascos de agitación. La incubación tiene lugar a 37 ° C y 180 rpm.
   3. Monitorear el cambio en OD _600nm después de la inoculación. Cuando el OD ₆₀₀ alcanza un valor entre 0.6 unad 0,8 inducir la expresión mediante la adición de tetraciclina (0,2 mg ml ^-1). Incubar los cultivos durante 15 horas a 20 ° C y 180 rpm.
      NOTA: Como OLET _JE contiene un cofactor hemo, es necesaria la adición de ácido levulínico δ-amino (0,5 mM) antes de la inducción para proporcionar el cultivo con un precursor para la síntesis de cofactor.
3. La lisis celular
   1. Llevar a cabo los siguientes pasos en el hielo. La transferencia de las culturas por decantación o pipeteo en tubos de centrífuga y el uso de una escala para garantizar la igualdad de distribución. Centrifugar los cultivos durante 20 minutos a 12.000 xga 4 ° C.
   2. desechar con cuidado el sobrenadante y volver a suspender los pelets en 50 ml de tampón (Tris 50 mM, NaCl 200 mM, pH 7,5) mediante pipeteo y la transferencia de la suspensión en un tubo de centrífuga cónico.
   3. Después de la centrifugación durante 15 minutos a 4000 xga 4 ° C descartar el sobrenadante, resuspender cada sedimento en 3 ml de tampón por pipeteado.
   4. Realizar la lisis celular por lonicating las soluciones en hielo (tres ciclos x 30 seg), dejando una pausa de 1 minuto entre los ciclos. Centrifugar las soluciones durante 20 min a 15.000 xg a 4 ° C para eliminar los desechos de células y transferir el sobrenadante a un tubo de centrifugación cónico sin perturbar el sedimento por pipeteado. Se desecha el precipitado.
      NOTA: Una fracción de disolvente se puede utilizar directamente para la biocatálisis después de moléculas pequeñas se eliminan. La segunda fracción será utilizado para la purificación de la Su-etiquetados OLET _JE.
4. La eliminación de pequeñas moléculas de celulares extractos
   1. Antes de usar el extracto crudo en la biocatálisis eliminar pequeñas moléculas que podrían interferir con la formación de peróxido de hidrógeno o de transferencia de electrones con la pipeta 3 ml de extracto libre de células en una unidad de filtro de centrífuga con una membrana y se centrifuga 10 kDa a 4000 xga 4 ° C. Resuspender la proteína restante en 3 ml de Tris-HCl-buffer.
5. La purificación del OLET
6. Aplicar 3 ml de la segunda extracto celular a sus columnas de centrifugación Pur Ni-NTA, que han sido equilibrada con tampón de equilibrio antes de (Tris 20 mM, NaCl 300 mM, imidazol 10 mM).
7. Sellar las columnas con los tapones inferiores y superiores tapones de rosca y agitar ligeramente hasta que la resina se distribuye por igual con el extracto libre de células. Incubar las columnas cargadas de 30 min en un agitador de cabeza a 4 ° C.
8. Lavar las columnas con 1 ml de tampón de lavado (Tris 20 mM, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM, pH 7,4) por centrifugación a 700 xg durante 2 min. Repita este paso dos veces.
9. Colocar las columnas en un tubo de centrifugación cónico fresco y añadir 1 ml de tampón de elución (Tris 20 mM, NaCl 300 mM, imidazol 250 mM, pH 7,4) OLET _JE. Centrifugar a 700 xg durante 2 minutos y repetir este paso dos veces.
   NOTA: El imidazol se unirá a níquel y por lo tanto eliminar OLET _JE de la columna.
10. La transferencia de la elución de una unidad de filtro de centrífuga (10 kDa membrana) y centrifugar a 4000 xg a 4 ° C para eliminar el imidazol.
11. Comprobar la pureza de la enzima por una SDS-PAGE (15%). ⁹ Mix 3 l de la elución con un tampón de SDS-(1x concentración final) e incubar la solución a 95 ° C durante 5 min para la desnaturalización. Posteriormente aplicar la cantidad total en una SDS-PAGE. Correr el gel a 35 mA usando un patrón de proteína comercial. Detectar la proteína a 50 kDa.
12. Para determinar la concentración de proteína disponible utilizar un BSA-kit comercial. Pipeta de 50 l de proteína de las muestras diluidas (1: 100, 1: 200, 1: 500) y patrón de BSA (0, 20, 30, 40,50, 60, 80, 100 mg ml ^-1) en una placa de 96 pocillos . Añadir 200 l de reactivo de Bradford, medir la absorbancia a 595 nm después de 15 min con un fluorímetro y calcular las concentraciones usando la curva estándar.

2. Biotransformación-Light catalizada

1. Reacciones biocatalíticas sin adición de peróxido de hidrógeno
   1. Preparar una solución de 10 ml de stock de 10 mM de ácido esteárico (M _r 284,5 g mol ^-1) mediante la adición de 10% (v / v) Tergitol y 0,0284 g de ácido esteárico a agua destilada. Calentar la solución en una cámara de calentamiento a 60 ° C hasta que el ácido graso está completamente disuelto.
   2. Biocatálisis y toma de muestras
      1. Preparar dos 2 ml de mezclas de reacción que contienen mM EDTA 50, FMN 0,01 mM, ácido esteárico 0,5 en Tris-HCl-buffer. Añadir una barra de agitación magnética para el suministro de oxígeno suficiente y colocar los tubos de vidrio en un baño de agua, se calentó a 25 ° C.
      2. Añadir 200 g ^ml-1 de enzima purificada o 10% (v / v) de extracto libre de células a cada uno de las mezclas de reacción y iluminarlos con una bombilla de vidrio transparente (120 W) en 15 cm de distancia de los tubos de reacción.
      3. Tomar muestras de 200 l en puntos de tiempo específicos (0, 10, 30, 60 y 120 min y durante la noche) detener la reacción con HCl 20 l 37%. Añadir 5 l de ácido mirístico (10 mM de modolución) como estándar interno.
2. Análisis de productos de la reacción
   1. Para la extracción de añadir 500 l de acetato de etilo a las muestras dos veces, invertir los tubos y centrifugar durante 1 min a 13.000 x g.
   2. Despegue 400 l del sobrenadante y dejar que el disolvente se evapore por completo.
   3. Derivatizar los ácidos carboxílicos en ácido trimethylsilylcarboxylic mediante la adición de 200 l N -metil- N - (trimetilsilil) trifluoro acetamida (MSTFA). Incubar la solución a 60 ° C durante 30 min con el fin de convertir los grupos hidroxilo para trimetilsilil éteres.
   4. Determinación de la conversión mediante GC / FID
      NOTA: Determinar la formación de 1-heptadeceno (RT: 8,34 min), ácido esteárico α- y β-hidroxi (RT: 12,05 y 12,1 min) y la disminución del sustrato (RT: 11,15 min) utilizando GC / FID.
      1. Establecer el perfil de temperatura se describe a continuación Configurar la temperatura de inyección de 340 ° C. Sostenerla temperatura inicial de la estufa es a 90 ° C durante 3,5 min y posteriormente se incrementa con 45 ° C ^min-1. A 220 ° C, mantener la temperatura durante 2 minutos. Después de un aumento repetido de 45 ° C ^min-1, mantenga la temperatura a 280 ° C durante 2 minutos y luego aumentar con 60 ° C ^min-1.
         NOTA: La temperatura máxima de 330 ° C se mantuvo durante 1,44 minutos.
      2. Inyectar 4 l de la muestra, con una relación de división de 5 para obtener la volatilización rápida y mezcla homogénea con el helio gas portador.
         NOTA: En función de la temperatura creciente del sustrato y los productos entrarán en la fase de gas. Las sustancias son detectadas por el detector / FID GC después de pasar a la columna en tiempos de retención específicos y se muestran como los picos en la pantalla. Observar la formación de pico en el monitor.
      3. Calcular la concentración de producto formado por la siguiente fórmula:
         NOTA: El factor de calibración se ha determinado específicamente para este columna para cada sustrato y el producto mediante el cálculo de la curva estándar de cantidades conocidas de las sustancias derivatizadas y su área del pico correspondiente.
   5. Identificar los picos de ácido de olefinas y beta-hidroxi por GC / MS.
      1. Identificar los picos de ácido de olefinas y beta-hidroxi por GC / MS. Establecer el perfil de temperatura. Ajuste la temperatura de inyección de 250 ° C. Mantenga la temperatura del horno a 100 ° C durante 5 minutos y posteriormente se incrementará con 20 ° C ^min-1.
         NOTA: La temperatura máxima se mantiene durante 7,5 min.
      2. Ajuste la temperatura del detector espectrómetro de masas a 250 ° C y escanear de 50 a 500 m / z en el modo de impacto electrónico.
         NOTA: Electron ionización de impacto elimina un solo electrón como resultado la formación de un catión radical que se hace pasar hacia adelante para el análisis de masas. Debido a los altos enlaces covalentes de energía dentro de la intramolarruptura molécula de la creación de fragmentos de menor m / z. Estos fragmentos forman una huella digital específica para una sustancia.
      3. Se inyecta 1 l de la muestra. Detectar 1-heptadeceno después de 11,4 min Tiempo de retención por la huella digital correspondiente (Figura 2).

Results

Mientras que la adición de peróxido de hidrógeno a la mezcla de reacción produjo bajo las conversiones (<10%) a moderada, la generación in situ de peróxido de hidrógeno aumentado la conversión hasta una conversión del 80%. El análisis por GC / MS muestra la formación de olefinas a partir de ácidos grasos (Figura 2).

Figura 2. (A) Perfil de temperatura para las mediciones de GC / MS. (B) de la huella digital de la elución 1-heptadeceno después de 11,4 minutos. (C) característica secundaria iones _CnH2n-1 fragmento de olefinas terminales ejemplar mostrada por 1-heptadeceno. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

E. coli. Una solución de enzima purificada mostró una clara correlación entre la concentración de enzima y la conversión. El aumento de la concentración del captador de luz de plomo molécula de FMN a conversiones más altas. Sin embargo, el aumento de la concentración por encima de 10 mM no acelerar aún más las reacciones, lo que indica que la cantidad de peróxido de hidrógeno es suficientemente disponibles y ya no el factor limitante.

Además de la descarboxilación de los ácidos grasos, OLET _JE también cataliza una hidroxilación en β-posición. En la conversión de ácido esteárico, la descarboxilación es de aproximadamente tres veces más rápido que la hidroxilación. En un experimento típico utilizando una solución de ácido esteárico 0,5 mM y 10 mM FMN, 99% del sustrato se convierte en una mezcla de 1-heptadeceno y ácido 2-hidroxiesteárico con una relación de3.3: 1 (Figura 3) ^8. Una investigación del espectro de sustrato de la biocatálisis impulsada por la luz mostró que para los ácidos grasos con cadenas de acilo más largos, OLET _JE cataliza preferentemente la descarboxilación, mientras que la cantidad relativa de los ácidos grasos hidroxilo en la mezcla del producto aumentó con la menor longitud de cadena. Los ácidos grasos más cortos que el ácido mirístico (C14) no fueron sometidos a la descarboxilación.

Figura 3. Gas análisis cromatográfico de OLET _JE mediada por descarboxilación de ácido esteárico (11,15 min) en 1-heptadeceno (8,4 min), ácido esteárico (12,04 min) ácido esteárico β-hidroxi α-hidroxi (12,1 min). Se muestra el cambio de las áreas de los picos de las muestras tomadas durante un transcurso de tiempo de 2 horas. Por favor, haga clic aquí para competirwa versión más grande de esta figura.

Sorprendentemente, el ácido ácidos insaturados oleico (C18: 1D9 cis) y ácido linoleico (C18: 2d9d12) no fueron aceptados como sustratos, lo que indica que la configuración de trenzado de dobles enlaces cis no pueden alojarse en un modo de unión productiva en la enzima. La adición de ácido oleico (10%) también impidió que la conversión de ácido esteárico. Curiosamente, el ácido esteárico (C18: 1D9 trans) fue convertido por OLET _JE, sin embargo, con actividad ligeramente inferior a continuación, el ácido esteárico.

Discussion

La generación impulsada por la luz de peróxido de hidrógeno se puede aplicar para un rango de transformaciones redox, incluyendo peroxygenases ^3, chloroperoxidases ¹⁰ y P450 monooxigenasas ^5. Es un enfoque sencillo y factible. A largo plazo, el uso de la luz visible se abre la perspectiva de utilizar la luz solar para las transformaciones químicas, que es una alternativa sostenible para las reacciones ricos en energía.

El método es aplicable con la enzima purificada o con extracto libre de células. Mientras que este último requiere menos coste y el trabajo, hay que señalar que las pequeñas moléculas en el extracto crudo pueden interferir con la conversión de la luz catalizada. Un enfoque posible es eliminar estos componentes pequeños con una micromembrana (es decir, por centrifugación en una unidad de filtro centrífugo o por diálisis). La concentración de la molécula captador de luz FMN determina la concentración del peróxido de hidrógeno. Dependiendo de la Affinity de la oxidorreductasa, esta concentración es determinante para la actividad enzimática. Otro factor importante es la concentración del EDTA sacrificial donante de electrones. El parámetro más importante, sin embargo, es la estabilidad de funcionamiento y la actividad de la enzima.

El olefinization de ácidos grasos es una reacción elegante para la conversión de ácidos grasos de origen biológico en olefinas que pertenecen a las principales materias primas para la industria química. La descarboxilación biocatalıtica luz impulsada se puede llevar a cabo a temperatura ambiente y a pH neutro, que ofrece claras ventajas en términos de sostenibilidad.

Nuestros resultados muestran que la generación in situ de peróxido de hidrógeno es una estrategia para suministrar el cofactor sin perjudicar la estabilidad de la enzima, lo que lleva a una conversión alta. Los métodos actuales para la regeneración del cofactor utilizan productos agrícolas o productos químicos derivados del petróleo. reacciones impulsada por la luz están surgiendo como alternativa renovable. Futurola investigación estará dedicada a los métodos para la sustitución del reactivo EDTA sacrificio por moléculas más baratos y para reducir la cantidad de la molécula de FMN captador de luz.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
ampicilina	Sigma Aldrich	69-52-3
Bradford reactivo	Roth	K015.1
BSA	Sigma Aldrich	90604-29-8
DMSO	Sigma Aldrich	67-68-5
Acetato de etilo	Fisher Chemical	141-78-6
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)	Roth	8043.1
Riboflavina 5-monofosfato sodio sal hidrato	Sigma Aldrich	130-40-5
Ácido clorhídrico 37%	Sigma Aldrich	7647-01-0
Peróxido de hidrógeno 30%	Sigma Aldrich	7722-84-1
δ-Ácido aminolevulínico	Sigma Aldrich	5451-09-2
N-Metil-N-(Trimetilsilil)trifluoro acetamida (MSTFA)	Sigma Aldrich	24589-78-4
Ácido mirístico >99%	Sigma	Aldrich 208-875-2
Imidazol	Sigma Aldrich	288-32-4
Cloruro de sodio	Fisher Chemical	7647-14-5
Ácido esteárico >99%	Sigma Aldrich	57-11-4
Tetraciclina	Sigma Aldrich	60-54-8
Tergitol	Sigma Aldrich	MFCD01779855
Tris(hidroximetil)-aminometano	Sigma Aldrich	77-86-1
Dispositivo
Incubadora agitador	G-25CK	New Brunswick Scientific
	Ecotron	Infors HT
Centrifugación	Labofuge 400R	Heraeus
	RC 5B Plus	Sorvall
	Fresco 17	Thermo Scientific
Rotores de centrifugación	SS34	Sorvall
	SLA	Sorvall
Clean bench	Envirco	Ceag Schirp Reinraum technik
Column GC-FID	CP-Sil 5CB (30 m x 0,25  mm x 0,25 y micro; m)	Agilent Technologies
Column GC-MS	FactorFour Columna Capilar (VF-5 ms + 5 m EZ Guard)	Varian
GC-FID	GC-2010 plus	Shimadzu
GC-MS	IST-40	Varian
Agitador magnético	RCT clásico	IKA
Medidor de pH	SevenEasy	Mettler toledo
Sonicator	Branson Sonifier 250	Branson
Fotómetro espectral	FLUOstar Omega	BMG Labtech
Equipment
cromatografía	His Pur Ni-NTA	Thermo Scientific
Centricon	Vivaspin turbo 15	VWR International
Placas de microtitulación	96 Well Multiply® Placas PCR	Sarstedt