Artículo de método

Análisis del filtro de aire en la muestra de endotoxinas y contenido de ADN

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DOI:

10.3791/53444

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7 de marzo de 2016

 ,  ,  , 
1Department of Earth and Planetary Sciences, Weizmann Institute of Science, 2Multiphase Chemistry Department, Max Planck Institute

En este artículo

Resumen

En este trabajo se describen dos análisis complementarios de partículas biológicas atmosféricas a partir de filtros muestreados en aire: la extracción y detección de endotoxinas y de ADN.

Resumen

la investigación de aerosol al aire libre comúnmente utiliza partículas muestreada en los filtros. Este procedimiento permite diversas caracterizaciones de las partículas recogidas que se realizan en paralelo. El propósito del método presentado aquí es obtener un análisis muy preciso y fiable del contenido de endotoxina y ADN de bio-aerosoles extraídos de filtros. La extracción de las moléculas de alto peso molecular orgánicos, tales como lipopolisacáridos, de los filtros de la muestra implica agitando la muestra en un medio a base de agua libre de pirógenos. El posterior análisis se basa en una reacción enzimática que puede detectarse utilizando una medición turbidimétrico. Como resultado de la alto contenido orgánico en los filtros en la muestra, la extracción de ADN de las muestras se realiza usando un kit de extracción de ADN comercial que fue diseñado originalmente para suelos y modificado para mejorar el rendimiento de ADN. La detección y cuantificación de especies microbianas específicas utilizando Reacti cadena de la polimerasa cuantitativaen el análisis (q-PCR) se describen y se comparan con otros métodos disponibles.

Introducción

El muestreo del aire en los filtros es una herramienta básica en la investigación de los aerosoles atmosféricos. 1 Los filtros de la muestra son el punto de partida para diversos productos químicos, físicos y caracterizaciones biológicas de las partículas ambientales recogidos. 2-11 La ventaja de este enfoque es que varios análisis pueden ser realizado fuera de línea en la misma muestra. La compilación de los datos de todos los diferentes análisis permite al investigador para obtener una buena comprensión de las características de las partículas y las ayudas recogidas en la resolución de cuestiones complejas en las ciencias de la atmósfera 12,13. Por ejemplo, los acondicionadores de muestras marinas y continentales tomadas durante el mismo período puede compararse con respecto a la toxicidad de las partículas en la muestra y la composición biológica. 14 para este estudio, los lipopolisacáridos (LPS), componentes de paredes celulares bacterianas gram-negativas, también conocidos como endotoxinas, se extrajeron de los filtros en la muestra en tierra y en un sitio en el interior, y se evaluaron utilizando elamebocitos de Limulus lisado (LAL). En paralelo, una evaluación genómica del contenido bacteriano (total de bacterias, gram negativo, y cianobacterias) se realizó en la misma muestra usando la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (Q-PCR). La prueba de LAL se basa en mediciones de turbidez formados después de la adición de un extracto acuoso de amebocitos del cangrejo de herradura, Limulus polyphemus, a una solución acuosa que contiene las endotoxinas. Cuanto mayor sea la concentración de endotoxina en la muestra, la turbidez más rápido se desarrolla. 15 El análisis q-PCR se basa en una señal de fluorescencia emitida como un fragmento de ADN específico se amplifica. 16 Por la monitorización en tiempo real de la señal durante la fase exponencial de la PCR reacción y de calibración con una curva estándar, la cantidad inicial de ADN se pueden cuantificar. La combinación de estos dos análisis junto con otros, como se detalla en otro lugar, 14 puede proporcionar una buena estimación de los niveles de endotoxina y de lacantidad de las bacterias de origen en las muestras.

El propósito del método presentado aquí es obtener un análisis muy preciso y fiable del contenido de endotoxina y ADN de bio-aerosoles extraídos de filtros. Si bien los métodos de muestreo de las características físicas y químicas inorgánicas de aerosoles son bien conocidos y, más recientemente, se han desarrollado métodos para investigar su componente de materia orgánica, 17 no ha sido escasa la investigación sobre el componente biológico de aerosoles. 18 La razón de la corriente método consiste en llenar este vacío mediante la presentación en detalle un método robusto para la extracción, el análisis y la identificación de la fracción biológica de los aerosoles en el aire. 14

Se espera que el método detallado aquí para encontrar amplio uso en proyectos de investigación en aerosol interiores y exteriores biológicos que implican análisis de filtro. 20-24

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Protocolo

Nota: Se muestra una lista detallada de todos los materiales e instrumentos utilizados en este protocolo en la sección de Materiales.

1. Toma de muestras de aire en los filtros

  1. Preparación de los filtros
    1. Para el muestreo de alto volumen, utilice 20.3 x 25.4 cm 2 filtros. Elegir el tipo específico de filtro que mejor se adapte a las necesidades de investigación, así como el tamaño de corte del filtro, si es aplicable. 1 A continuación, filtros de microfibras de cuarzo uso.
    2. filtros pre-horneado utilizadas para la extracción de compuestos orgánicos y biológicos para destruir los residuos orgánicos. Para pre-hornear los filtros, se envuelven individualmente en papel de aluminio y luego hornear en un horno de laboratorio a 450 ° C durante al menos 5 horas.
    3. Almacenar los filtros horneados a -20 ° C hasta el momento de muestreo.
  2. Manejo de instrumentos y muestreo de aire
    1. polvo residual limpia de la cabeza de la alta de muestras de volumen. Limpiar las piezas con toallitas de papel limpias y permitirles ant-aire secovolver a conectarlos a la toma de muestras.
    2. Desinfectar el marco del filtro con etanol, y trabajar con guantes y una bata de laboratorio en todo momento.
    3. Colocar un filtro de pre-cocida al horno dentro del marco del filtro limpio, y proceder de acuerdo con el manual del muestreador de alto volumen.
    4. Marque la fecha y anormal el clima, en su caso (por ejemplo, lluvia, tormenta de polvo) en la envoltura de aluminio, y guardarlo en un lugar limpio hasta la finalización del muestreo.
    5. Recoger el filtro muestreado y doblar por la mitad, con el lado que mira hacia dentro muestreada.
    6. Envolver el filtro en el papel de aluminio original y se almacena a -20 ° C hasta su análisis.
      Nota: Si el intervalo de tiempo entre el muestreo y el análisis es más de 2 meses, almacenar la muestra a -80 ° C para evitar la degradación de la materia orgánica y biológica.

Análisis 2. La endotoxina

Nota: Desinfectar la superficie de trabajo con 70% de una mezcla de etanold trabajo con tubos libres de pirógenos, consejos y reactivos solamente. Si se utiliza material de vidrio, se requiere pre-calentamiento a 250 ° C durante 30 minutos, o 200 ° C durante 60 min. 25 Preparar todos los reactivos en una cabina de bioseguridad de clase II y trabajar con guantes y una bata de laboratorio en todo momento.

  1. Preparación de los reactivos
    1. Siga el protocolo del fabricante kit LAL para rehidratar el lisado poco antes del uso. 26 golpee suavemente en el vial para desalojar LAL restante en las paredes de la botella. Levantar el tapón con cuidado para romper el vacío. Utilizando una jeringa con aguja, añadir 5 ml de agua libre de pirógenos (PFW) al vial para rehidratar todo el contenido lisado y mezclar suavemente para evitar la formación de espuma.
    2. Sellar el vial con la película de parafina plástico cuando no esté en uso y se almacena a 4 ° C durante un máximo de dos días. Almacenar cualquier lisado restante a -20 ° C durante un máximo de tres meses.
      Nota: Este reactivo se puede congelar una vez.
    3. Rehidratar el control de endotoxina estándar (CSE), que contiene 0,5 μ; g E. coli, de acuerdo con el protocolo del fabricante. 27 Determine la cantidad específica de agua que se añade al vial CSE desde la web del fabricante 28 introduciendo el número de lote del kit, cuando se indican en el sitio web. La concentración final de E. coli en el vial, se mide en unidades de endotoxina (UE; donde 10 EU = 1 ng). Etiqueta este vial ed0.
    4. Sellar el vial CSE con película de parafina plástico cuando no esté en uso y se almacena a 4 ° C durante un máximo de 4 semanas.
  2. La curva estándar y la Preparación-filtro con pinchos
    1. En una cabina de bioseguridad de clase II, se preparan 22 2 ml tubos de centrífuga libres de pirógenos que contienen cantidades decrecientes de CSE (tubos Ed1-ED11) o no CSE (el tubo en blanco que contiene sólo PFW) para producir una serie de diluciones de endotoxina duplicado, como se muestra en la Tabla 1.
    2. En un gabinete biológica con flujo circular, cortar 22 piezas circulares de filtro limpio, pre-cocida al horno utilizando un desinfectada 1.1 2 cm de diámetro perforador de corcho.
    3. Coloque los pares de filtros en placas de Petri estériles.
    4. Pico 50 l de cada miembro de la serie de dilución de endotoxina Ed2-ED11 y desde el tubo en blanco en un par correspondiente de filtros.
    5. Deje las placas de Petri que contienen los filtros de puntas abiertas bajo el capó secar durante 30 min.
    6. Coloque cada pieza de filtro en un tubo de 2 ml libre de pirógenos.
Tubo Concentración de endotoxina final (UE ml -1) Volumen endotoxina estándar (ml) Volumen de agua libre de pirógenos (ml) volumen total (ml)
ed0 2,500 solución de reserva* 5
ed1 1000 80 (de ed0) 120 200
Ed2 100 20 (de Ed1) 180 200
ed3 50 10 (de Ed1) 190 200
ed4 25 5 (de Ed1) 195 200
ED5 12.5 2.5 (de Ed1) 197.5 200
ed6 6.25 1.25 (de Ed1) 198.75 200
ed7 3,125 6.25 (de Ed2) 193.75 200
ed8 1.563 6.25 (de Ed3) 193.75 200
ED9 0,781 6.25 (de ED4) 193.75 200
ED10 0,391 6.25 (de ED5) 193.75 200
ED11 0,195 6.25 (de ED6) 193.75 200
Blanco 0 0 200 200
* Preparar la solución de reserva de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
">

Tabla 1:. La endotoxina curva estándar de concentración de endotoxinas, volumen de endotoxina estándar y de agua libre de pirógenos que se añade, y el volumen total obtenido se detallan para cada tubo de dilución de la curva de calibración.

  1. La extracción de endotoxina de la Experimental y filtros fortificados
    1. En un armario biológico con el flujo circular, corte los filtros de muestra (de la etapa 1.2) en piezas circulares con un 1,12 cm desinfectado perforador de corcho de diámetro, y colocarlos, junto con los filtros estándar de puntas (de la etapa 2.2), en libre de pirógenos 2 tubos ml (es decir, los tubos de muestra).
    2. Añadir 1 ml PFW a los tubos y sacudirlos para 60 min a temperatura ambiente, usando un agitador de laboratorio.
    3. Centrifugar los tubos de muestra en una microcentrífuga a 375 xg durante 10 min. 29
    4. º de transferenciae sobrenadante, que contiene las endotoxinas, en un nuevo tubo 2 ml libre de pirógenos.
  2. Limulus lisado de amebocitos (LAL) Prueba
    1. Determinar la concentración de endotoxina en las muestras mediante la realización de la prueba de LAL en una microplaca de 96 pocillos libre de pirógenos con un fondo plano y una tapa.
    2. Planificar el conjunto de placa de antemano, como se muestra en la Figura 1. Incluir una curva patrón preparada directamente de las soluciones estándar de endotoxina Ed2-ED11 (y por lo tanto, que cubren el rango de concentración de 100-0.195 UE / ml (ver sección 2.2)) en cada placa de correr . La curva estándar debe ocupar los pozos 1-10 de filas A y B de la placa. Ponga a un lado pozos 11-12 en estas filas para muestras en blanco (haciendo un total de cuatro espacios en blanco).
    3. Encender el lector de microplacas y programarlo para una reacción cinética que implica la incubación de la microplaca a 37 ° C y agitando cada 5 min, seguido por mediciones de absorción a 405 nm. Repetir 18 veces durante 1,5 horas.
    4. Determinar la efficiencia con la que las endotoxinas se extraen de los filtros de muestreo (es decir., las muestras obtenidas de los filtros estándar con púas) a través de la división de la cantidad de endotoxina calculada por la cantidad original se dispararon.
    5. Iniciar el ensayo mediante la colocación de 50 l de las soluciones estándar de endotoxina (de la etapa 2.4.2), o del extracto filtro de púas y sus espacios en blanco (de la Sección 2.3), o de las muestras experimentales y sus espacios en blanco (también de la sección 2.3), según el planificada placa matriz (Figura 1) y cierre la cubierta.
    6. A cada pocillo, añadir rápidamente 50 l de solución de LAL, y agitar suavemente la placa horizontalmente mientras se coloca sobre la mesa antes de levantar en el lector.
    7. Colocar la placa en el lector de placas e inicio de la experimentación.

figure-protocol-1
Figura 1:. La endotoxina placa de matriz Un examplio de una matriz de análisis de endotoxina en una microplaca de 96 pocillos.

3. Análisis Genómico

Nota: Para la extracción de ADN, la desinfección de la superficie de trabajo con un 70% de etanol y trabajar con tubos estériles, consejos y reactivos solamente. Para el análisis Q-PCR de ADN, la desinfección de la superficie de trabajo con superficie ADN-descontaminante. Preparar todos los reactivos en una cabina de bioseguridad de clase II y trabajar con guantes y una bata de laboratorio en todo momento.

  1. Preparación de los cebadores de ADN y sondas
    1. Antes de la extracción de ADN, ya sea para un conjunto comercialmente disponible de cebadores y una sonda (si se aplica el método de hidrólisis de la sonda), o diseñar un nuevo conjunto de cebadores y una sonda utilizando el cebador diseño de herramientas computacionales. 30
    2. Rehidratar los cebadores de acuerdo con el protocolo del fabricante usando ácido o bien 10 mM de Tris-0,1 etilendiaminotetraacético mM (EDTA) (tampón TE) o agua de calidad para PCR.
      Nota: Se recomienda disolver el cebador de PCR inicial stock en tampón TE con baja EDTA (0,1%), ya que evita la degradación del cebador cuando se mantienen durante tiempos más largos. Use agua de calidad para PCR para las diluciones posteriores destinadas a reducir las cantidades de EDTA que podrían inhibir las reacciones de PCR.
    3. Preparar alícuotas de 50 l o 100 l del cebador y la sonda en estériles tubos de 0,5 ml y se almacena a -20 ° C hasta su análisis.
  2. Patrón de evaluación Concentración celular antes de la extracción de ADN
    1. En un tubo de centrífuga de tamaño adecuado, preparar una solución de células estándar de las especies microbianas de interés (tubo Od0, Tabla 2A). Mezclar la suspensión celular pipeteando arriba y abajo en el tubo de 7-10 veces con una pipeta con un pequeño orificio.
    2. Si las células son de color (por ejemplo, ciertas esporas de hongos), no realice un procedimiento de tinción. Si se requiere la tinción de células, se diluye la suspensión celular en un colorante adecuado para la detección microscópica de las células de interés. 31
    3. Limpiar la hoja de la cubierta y hemocytometernos con etanol. Humedecer y colocar el cubreobjetos con el hemocitómetro.
    4. Cargar unos 8 l de la suspensión celular en ambas cámaras del hemocitómetro tocando cuidadosamente el borde de la hoja de la cubierta con la punta de la pipeta y el llenado de la cámara por acción capilar. No más / menos llenar la cámara.
    5. Determinar el número de células mediante la visualización de ellos bajo un microscopio a 400 aumentos (40X en el objetivo y 10X en ocular). Nueve cuadrados de 1 x 1 mm 2 y dispuestas en una cuadrícula de 3 x 3 deben ser vistos. Enfocar el microscopio en una de las cuatro esquinas de la rejilla (un aumento mayor se puede utilizar). El 1 x 1 mm 2 cuadrado debe contener 16 cuadrados más pequeños.
    6. Contar todas las células de los cuadrados de las esquinas de cuatro 1 x 1 mm 2, así como en la plaza medio de la red de 3 x 3. Si hay demasiadas o demasiado pocas células para contar, repetir el procedimiento, ya sea concentrar o diluir la suspensión celular original como apropiado (15-50 células deben superponer un singularizar área de 1 mm 2).
    7. Calcular la concentración de las células (células ml-1) en la suspensión celular estándar Od0 de la celda de conteo promedio a través de los cinco cuadrados contados a partir de la siguiente manera: la célula conteo de células ml-1 = media cuadrada recuento -1 Factor de dilución 10 4.
  3. Evaluación de la eficiencia de extracción de ADN
    1. Preparar nueve estériles de 0,5 ml tubos de acuerdo con la Tabla 2A.
    2. Diluir la solución de células estándar (Od0) para contener aproximadamente 10 7 células ml-1 en un volumen total de 20 l (OD1).
    3. Añadir 18 l de agua de calidad para PCR libre de nucleasa estéril (NFW) a los tubos OD2-OD8 y 20 l al tubo en blanco, OD9.
    4. Transferencia de 2 l de la solución de células de øD1 en OD2. Pipeta suavemente para mezclar y transferir 2 l de tubo de OD2 a OD3. Continuar diluyendo las células de la misma manera a lo largo de los tubos hasta e incluyendo el tubo OD8 a obtain una dilución en serie de 10 7 -10 0 células ml -1.
    5. En un armario biológico con el flujo circular, corte 18 piezas circulares de filtro limpio, pre-cocido al horno, utilizando un desinfectada 1,12 cm perforador de corcho diámetro. Colocar los filtros en pares en placas de Petri estériles.
    6. Pico 10 l de diluciones OD1 a OD8 y desde el tubo en blanco OD9 en cada uno de los filtros emparejados, de tal manera que hay un par de filtros que corresponden a cada concentración de células estándar.
    7. Deje las placas de Petri abiertas bajo el capó y dejarlos secar durante 30 minutos.
    8. Coloque cada pieza de filtro en un tubo ml con tapa de rosca 2 estéril y extraer el ADN de acuerdo con el procedimiento detallado en el apartado 3.4.
  4. Extracción de ADN a partir de la experimentación y filtros fortificados
    Nota: Para la extracción de ADN de los filtros, utilizar kits comerciales diseñados para la extracción de ADN de suelo de acuerdo con el protocolo del fabricante con las siguientes modificaciones.
    1. Para cada filmuestra ter (OD1-OD8), preparar una mezcla de perlas de vidrio lavados con ácido en un tubo estéril de 0,5 ml. Use 0,1 g perlas que tienen un diámetro de perlas de 425 a 600 micras y 0,3 g con un diámetro de ≤106 m.
    2. En un gabinete biológica con flujo circular, cortar tres piezas circulares de lugares seleccionados al azar en cada muestra utilizando un filtro de 1,12 cm desinfectada barrena de diámetro, y colocarlos en tapa de rosca tubos de 2 ml.
    3. Añadir la mezcla de perlas de vidrio de los tubos.
    4. Añadir el tampón de lisis celular suministrado con el kit de extracción a cada tubo en el armario biológica, con la cantidad indicada en el protocolo del fabricante.
    5. Preparar un cubo de hielo y romper las células mecánicamente usando un batidor de bolas.
    6. Batir las perlas durante 1 min y luego colocarlos en hielo durante 1 min. Repita cinco veces.
    7. Proceder con el protocolo del proveedor kit de la etapa posterior a la lisis.
    8. Después de la elución con el tampón de elución suministrado (contiene 10 mM Tris bUffer) o NFW, volver a cargar la muestra eluida través de la columna de nuevo para mejorar el rendimiento de ADN.
      Nota: Si no se analizaron en el mismo día de la extracción de ADN, las muestras se pueden almacenar a -20 ° C hasta su análisis.
A- Preparación de series de dilución estándar de la célula
Tubo La concentración final de células (células ml-1) volumen de células estándar (ml) volumen de agua libre de nucleasa (ml) Volumen total (ml)
Od0 determinar con Hemocytometer cámara de recuento
øD1 debe ser eluida a la gama de 10 7 células ml -1 20
OD2 10 -1 øD1 2 de OD1 18 20
OD3 10 -2 øD1 2 de OD2 18 20
OD4 10 -3 øD1 2 de OD3 18 20
OD5 10 -4 øD1 2 de OD4 18 20
OD6 10 -5 øD1 2 de OD5 18 20
OD7 10 -6 øD1 2 de OD6 18 20
OD8 10 -7 øD1 2 de OD7 18 20
Blanco 0 0 20 20
B- Preparación de ADN Curva Estándar
Tubo Concentración final de ADN (mg ml -1) volumen de ADN estándar (ml) volumen de agua libre de nucleasa (ml) Volumen total (ml)
determinar con NanoDrop
DD1 debe ser eluida a la gama de 10 1 mg ml -1 20
DD2 10 -1 Dd1 2 de Dd1 18 20
DD3 10 -2 Dd1 2 de Dd2 18 20
DD4 10 -3 Dd1 2 de DD3 18 20
dd5 10 -4 Dd1 2 de DD4 18 20
Dd6 10 -5 Dd1 2 de DD5 18 20
DD7 10 -6 Dd1 2 de Dd6 18 20
DD8 10 -7 Dd1 2 de DD7 18 20
Blanco 0 0 20 20
1 "style =" height: 21px; "> DD0

Tabla 2:. DNA curva estándar serie de dilución de células microorganismo Standard (A) detallada para el volumen estándar de células, el volumen NFW, y el volumen total en cada tubo de dilución. Preparación de ADN estándar curva (B) y detallado para el volumen estándar de ADN, el volumen NFW, y el volumen total en cada tubo de dilución.

  1. ADN Standard Curve Preparación
    1. Extraer el ADN directamente a partir de una muestra estándar del microorganismo de interés (DD0) usando el mismo procedimiento como se describe para los filtros experimentales en el paso 3.4.
    2. Use un espectrofotómetro para determinar la concentración de ADN de la muestra de ADN estándar (DD0) a 260 nm.
    3. Preparar nueve estériles tubos de 0,5 ml de partida para preparar una curva estándar de ADN, tal como se muestra en la Tabla 2B.
    4. Si es necesario, diluir la solución de ADN estándar DD0 a dentro de un intervalo de concentración de 1-10 mg ml -1 en el primer tubo (Dd1) en un volumen total de 20 l.
    5. Añadir 18 l de NFW a los tubos Dd2-DD8 y 20 l al tubo en blanco.
    6. Transferencia de 2 l de la solución estándar de ADN a partir Dd1 en Dd2. Pipetear suavemente para mezclar y luego transferir 2 l de Dd2 a DD3. Continuar diluyendo el ADN de la misma manera a lo largo de los tubos para lograr una serie de dilución de 10 0 -10 -7 en tubos Dd2-DD8 junto con un tubo en blanco containing única NFW.
      Nota: Si no se analizaron en el mismo día de la extracción, las muestras almacenar a -20 ° C hasta su análisis.
  2. Análisis cuantitativo-PCR
    1. Encienda el instrumento q-PCR con antelación para calentarse.
    2. En un nuevo archivo de programa, introduzca los detalles de la q-PCR se ejecute en el software del instrumento operacional como se detalla en la Tabla 3.
      Nota: Los diferentes instrumentos tienen diferente momento óptimo para cada etapa del ciclo térmico. Esta entrada se especifica en el manual del instrumento.
    3. Desinfectar la superficie de trabajo con superficie ADN-descontaminante y trabajar sólo con tubos estériles, consejos y reactivos.
    4. Preparar un cubo de hielo junto a la mesa de trabajo. Tienda de mezcla de Taq-polimerasa en hielo.
    5. Calcular el número total de pocillos de reacción que serán ocupadas en el plato. Hacer asignación teórica para reacciones adicionales (5%) y multiplicar el número ampliado de reacciones por el volumen por reacción para calcular el total de Reaction volumen.
    6. Preparar la piscina de reacción se mezcla, a partir de NFW, cebadores, sondas, y por último la mezcla de polimerasa Taq. Ver el ejemplo de los cálculos de volumen de la piscina mixta en la Tabla 4.
    7. Almacenar la mezcla de reacción en la oscuridad y en hielo hasta su uso.
    8. Coloque 1 l de ADN estándar, el ADN de la muestra, o NFW (como control negativo) en el interior de los pozos en la microplaca q-PCR por triplicado.
    9. Asegúrese de que la placa está en un soporte de la placa para evitar que entre en contacto con la superficie de trabajo y para mantenerlo limpio.
    10. Añadir 9 l de la piscina mixta (Tabla 4) en cada pocillo de reacción.
    11. Cubrir la placa con película adhesiva óptica y sellarlo herméticamente desde todos los lados.
    12. Centrifugar la placa en una centrífuga con cubos de placas durante 1 min a 1.000 xg antes de colocarlo en el dispositivo q-PCR.
    13. Colocar la placa en el instrumento y activar el programa en ejecución.
Parámetro detalles comentarios
método de detección sonda de hidrólisis cuantitativa
condiciones de ciclos térmicos
La desnaturalización inicial y activación enzimática 95 ° C durante 10 min
La desnaturalización 95 ° C durante 15 seg repetir 45 veces
El recocido y extensión 60 ° C durante 60 seg
placa array
Curva estándar DD1 - DD8 3 repeticiones por cada dilución de 1-8 pozos en las 3 primeras filas
control sin plantilla (NTC) agua libre de nucleasa (NFW) 3 repeticiones en el 9º así en la parte superior3 filas.
Las muestras analizadas ADN extraído de filtros 3 repeticiones por muestra en los pocillos restantes.
conjunto de cebadores por cada pocillo
volumen de la muestra 10 ml

Tabla 3:. Los detalles de software operativo q-PCR Los detalles de los parámetros de análisis que se introducirán en el archivo de programa q-PCR.

Reactivo Volumen por reacción (ml) Número de reacciones Subsidio para el error(5%) Mezcla Volumen total (ml)
Taq polimerasa mezcla 5 50 52.5 262.5
F imprimación (10 mM) 0,5 50 52.5 26.25
R imprimación (10 mM) 0,5 50 52.5 26.25
agua libre de nucleasa 3 50 52.5 157,5
DNA - 1 ml se añade directamente en los pocillos de destino en la placa 96.

Tabla 4:.-cuantitativa de la mezcla de reacción de PCR Cálculo del volumen por reacción, número de reacciones, el subsidio para el error, y el volumen total calculado que se añaden a la mezcla de reacción por reactivo son detallada.

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Resultados

Es común para estudiar los aerosoles atmosféricos utilizando "off-line" los análisis de los filtros incluidos en la muestra (véase la Figura 2). Analiza 32 Química de la incluirá orgánica (por ejemplo, proteínas, moléculas de hidrocarburos, sacáridos) e inorgánicos (por ejemplo, metales, sales) contenido en la muestra cuestión . análisis biológicos incluyen contenido viable y no viable de microorganismos, la identificación de especi...

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Discusión

Este trabajo describe los métodos de extracción y detección para cuantificar tanto las endotoxinas y ADN presente en las muestras recogidas en los filtros de aerosol. Los métodos requieren rutinas precisos y se pueden realizar fácilmente, siempre que el experimentador se adhiere a algunos puntos esenciales e importantes discutidos aquí.

Para la etapa de detección de endotoxinas, tenga en cuenta que la solución de lisado es bastante viscoso y tiende a producir burbujas en la pipeta. Es difíci...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores agradecen al Dr. Yoav Barak de la Facultad de Química del Instituto Weizmann, por su apoyo y consejo. Este estudio fue apoyado por la Fundación de Ciencias de Israel (subvención # 913/12), y por la Fundación Minerva con fondos del Ministerio Federal de Educación e Investigación de Alemania.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Filter sampling
HiVol 3000 - Muestreador de Aire de Alto VolumenEcotech
Filtros de Microfibra de CuarzoWhatman1851-865203 mm x 254 mm
ELF - Hornos de Cámara de LaboratorioCarboliteELF 11series
Papel de aluminioOpal
< strong>NameCompanyNúmero de catálogo>Comentarios
Endotoxina
EthanolSigma Aldrich16368 Reactivo de laboratorio, 96%
Cabina de seguridad biológica Airstream Clase II AC-4E1ESCO10011712
Pyrotell -TAssociates de Cape Cod, Inc.T0051
Estándar de Control de Endotoxinas Asociadosde Cape Cod, Inc.E0005-1Escherichia coli  O113: H10, 0.5 y micro; g/vial 1 paquete de
reactivo LAL WaterAssociates de Cape Cod, Inc.W0051
Jeringa estéril de 10 ml con punta Luer-LokBecton-Dickinson & Co.
Aguja de jeringa BD PrecisionglideBecton-Dickinson & Co.305129Estéril 
Cinta de sellado Parafilm-MParafilmP7543Sigma Número de catálogo
MicrotubosAxigenMCT-200-C2 ml, sin pirógenos
1,12 cm de diámetro Barrenador de corchoBoekel Scientific1601 BD Series - AceroParte de un juego de barrenadores de corcho que contiene barrenadores de varios diámetros.
Placa de Petri de 50 mmMiniplast Ein-Shemer72050-01Aséptico
Vortex Genie 2 Industrias Científicas, Inc.SI-0297
Microcentrífuga 5415D Eppendorf22621408
TC MicroWell 96 F SI con tapaNunc167008Pocillos de fondo plano (con tapa (envueltos individualmente)), estéril, libre de pirógenos
Synergy HT Lector de Microplacas Multi-DetecciónBiotek7091000
NameCompanyNúmero de catálogoComments
>ADN
DNA de distanciaSigma Aldrich7010
ADN estándar de las especies microbianas de interésATCC u otra colecciónYa sea la cepa microbiana adecuada para la extracción de ADN o el ADN
extraídoTampónTE de hemocitómetro Marienfeld640030
Neubauer, Low EDTALife Technologies12090-01510 mM Tris-HCl (pH 8.0)  0,1 mM EDTA 
Agua de grado PCR libre de nucleasas Sigma Aldrich3315959001
cebadores de PCRSigma AldrichSe dirige a las especies microbianas de interés
SigmaAldrichdirige a las especies microbianas de interés
Tubos con tapón de roscaAxigenST-200-SS2 ml 
Kit de extracción de ADN PowerSoil Mo Bio Laboratories12888-100
Perlas de vidrio, lavadas con ácido 425-600 y micro; mSigma AldrichG8772-100G
Perlas de vidrio, lavadas con ácido < 106 y micro; mSigma AldrichG4649-100G
PowerSoil Solution C1Mo Bio Laboratories12888-100-1Tampón de lisis celular , Power soil Kit
Cubitera Magic TouchBel-Art18848-4001
Mini-Beadbeater-16BioSpec607EUR
StepOnePlus Sistema de PCR en tiempo realApplied Biosystems4376600
Fast SYBR Green Master MixApplied Biosystems 4385612
TaqMan Mezcla Maestra de Expresión Génica AppliedBiosystems4370048
MicroAmp Placa de reacción óptica rápida de 96 pocillos con código de barras, 0,1 mlApplied Biosystems4346906
MicroAmp Base de 96 pocillos sin salpicaduras MicroAmpApplied Biosystems4312063
Películaadhesiva óptica MicroAmpCentrífuga4311971
5810 REppendorf5811 000.010Rotor A-4-62 con cucharas MTP 
309605 de cultivo mejorado por se Base Applied Biosystems

Referencias

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