Efficient Expresión células de mamíferos y Single-step La purificación de glicoproteínas extracelular para la cristalización

Summary

Este es un protocolo rápido y rentable para la producción de proteínas de mamíferos secretadas y glicosiladas y su posterior purificación en un solo paso con rendimientos suficientes de proteína homogénea para la cristalografía de rayos X y otros estudios biofísicos.

Abstract

La producción de proteínas de mamíferos secretadas para estudios estructurales y biofísicos puede ser desafiante, lenta y costosa. Aquí se describe un protocolo eficiente en tiempo y costo para la expresión de proteínas secretadas en células de mamíferos y la purificación en un solo paso mediante cromatografía de afinidad de níquel. El sistema se basa en la transfección transitoria a gran escala de células de mamíferos en suspensión, lo que disminuye en gran medida el tiempo de producción de proteínas, ya que elimina pasos, como el desarrollo de virus de expresión o la generación de líneas celulares de expresión estables. Este protocolo utiliza agentes de transfección baratos, que se pueden producir fácilmente mediante una simple modificación química, o agentes de transfección de precio moderado, que aumentan el rendimiento a través de una mayor eficiencia de transfección y una disminución de la citotoxicidad. El monitoreo cuidadoso y el mantenimiento de los niveles de glucosa de los medios aumentan el rendimiento de proteínas. El control de la maduración de los glicanos nativos en la etapa de expresión aumenta el rendimiento final de las proteínas de mamíferos correctamente plegadas y funcionales, que son propiedades ideales para realizar la cristalografía de rayos X. En algunos casos, la purificación en un solo paso produce proteínas de suficiente pureza para la cristalización, lo que se demuestra aquí como caso de ejemplo.

Introduction

La comprensión de la estructura de proteínas a nivel atómico es clave para descubrir las bases moleculares de las vías biológicas y enfermedades. Cristalografía de rayos X de proteínas es más utilizado el método / aplicable para la determinación de estructuras macromoleculares. El principal reto de este método es la obtención de cantidades suficientes de correctamente plegada, proteína pura. Esto se convierte en un problema particular cuando se trabaja con proteínas de mamífero secretada, que experimentan modificaciones post-traduccionales específicas.

Las proteínas expresadas en bacterias son la principal fuente de proteínas cristalizada....

Protocol

1. Producción de cantidades de miligramos de ADN de plásmido para la transfección transitoria a gran escala

1. Clonar la proteína de interés en un vector de expresión mamífero número elevado de copias usando la clonación sitio de restricción, u otra técnica apropiada.
   1. Para obtener resultados óptimos, utilice pHLsec ⁷ vector, que tiene incorporado un C-terminal 6His-tag, una fuerte secuencia Kozak promotor y una señal de secreción optimizado.
2. Transformar el plásmido en las células competentes.
   1. Añadir 20 l de células competentes de E. coli en 1 g de ADN plásmido y se incuba en hielo durante 30 min.
   2. Célu....

Results

Aquí sigue los resultados de este sistema de expresión se aplica a un dominio de inmunoglobulina secretada 13 kDa (Ig) de la proteína de activación de receptor humano expresado en las células mieloides (2 hTREM2, residuos 19-132). TREM2 es una proteína transmembrana de tipo I que contiene un único dominio de Ig extracelular que tiene dos enlaces disulfuro y dos sitios de glicosilación unidos a N. A diferencia de muchas otras proteínas de dominio Ig ^8, TREM2 no era susceptible de replegado de cuerpos de inclus.......

Discussion

Células HEK 293F ofrecen la producción de robusta de las proteínas que requieren modificaciones posteriores a la traducción. Este sistema permite la expresión rápida y escalable de las proteínas plegadas de forma nativa que contienen disulfuros, glicosilación, fosforilación y que de otra manera estaría ausente el uso de herramientas de expresión más rutinarias. Además, este sistema puede ser utilizado para la expresión y purificación de varios complejos de proteínas simplemente mediante la co-transfección de múltiples p.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Matraces de cultivo	GeneMate	F-5909B
293 Freestyle Media	Gibco/Life Technologies	12338-018
GlutaMAX	Gibco/Life Technologies	35050-061	Uso en lugar de Glutamine
Hype 5 reactivo de transfección	Oz Biosciences	HY01500
293reactivo de transfección de fectina	Life Technologies
reactivo de transfección de PEI	Sigma-Aldrich	408727
Maxiprep Kit	Qiagen	12162
Ni-NTA Superflow	Qiagen	30430
Endo Hf	NEB	P0703L
Resina de amilosa	NEB	E8021S
Cell Boost R05.2	HyClone	SH30584.02	Suplemento de cultivo celular
GlucCell	CESCO Bioengineering	DG2032	Sistema de monitoreo
de glucosa Opti-MEM	Life Technologies	519850.91	Medio libre de suero para la transfección de ADN
Luria Broth (LB Media)	Life Technologies	10855-001
GC10 Células competentes	Sigma-Aldrich	G2919