Se presenta aquí una descripción unificada de las técnicas que se pueden utilizar para desarrollar, transformar, administrar y poner a prueba la expresión de proteínas heterólogas de la levadura probiótica Saccharomyces boulardii.
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Artículo de método
Transformación de la levadura probiótica y su recuperación de tejidos gastrointestinales inmune después de alimentación forzada oral en ratones
En este artículo
Resumen
Resumen
El desarrollo de la terapia oral recombinante permitiría dirigirse más directamente al sistema inmunitario de la mucosa y mejorar la capacidad de combatir los trastornos gastrointestinales. La adaptación de la levadura probiótica en particular para este enfoque conlleva varias ventajas. Estas cepas no solo tienen el potencial de sintetizar una amplia variedad de proteínas heterólogas complejas, sino que también son capaces de sobrevivir y proteger esas proteínas durante el tránsito a través del intestino. Sin embargo, este enfoque requiere experiencia en muchas técnicas de laboratorio diversas que no suelen utilizarse en conjunto. Además, aunque los protocolos individuales para la transformación de la levadura están bien caracterizados para las cepas de laboratorio de uso común, aquí se hace hincapié en los enfoques alternativos y en la importancia de optimizar la transformación para las cepas probióticas menos caracterizadas. Detallar estos métodos ayudará a facilitar el debate sobre los mejores enfoques para probar la levadura probiótica como vehículos de administración de fármacos orales y, de hecho, servirá para avanzar en el desarrollo de esta nueva estrategia para la terapia gastrointestinal.
Introducción
Los microorganismos probióticos son un medio potenciales interesantes de la entrega de manera eficiente y económica proteínas heterólogas en el tracto gastrointestinal. Estos organismos son capaces de sobrevivir el paso a través del tracto gastrointestinal sin embargo no colonizarlo 1, lo que permite la dosificación controlada y limitar la exposición a la droga expresó. Además, la capacidad de diseñar fácilmente estos organismos para producir la proteína heteróloga a gran escala las hace una alternativa económica a las partículas de entrega sintéticos. Sin embargo, el desarrollo de un enfoque de este tipo, como se ha demostrado recientemente el uso de una ....
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Protocolo
1. Mutagénesis UV para generar cepas de levadura auxotroficos
- Generar curvas de supervivencia para determinar las dosis necesarias de la irradiación UV
- Preparar YPD (extracto de levadura de peptona dextrosa) medios de comunicación y otros reactivos enumerados en la Tabla 1 de acuerdo con procedimientos estándar 26 e inocular colonias individuales en 5 a 10 ml de medio YPD. Incubar culturas en un tambor de rodillo a 30 ° CO / N a la saturación por lo menos durante 8 hr.
- Determinar la concentración de células de cultivos O / N utilizando un espectrofotómetro mediante la dilución de las células d....
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Resultados
Generación de una curva de supervivencia después de la irradiación UV requiere placas de células de levadura diluidas de tal manera que unidades formadoras de colonias (CFU) distintos son capaces de formar. Cada muestra de 500 l recogida como se ha descrito anteriormente contiene aproximadamente 5 x 10 6 células; Sin embargo, más de 100 colonias por placa son difíciles de distinguir con precisión. Revestimiento de la muestra sin diluir así como de serie diluciones 1:10 de las .......
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Discusión
Juntos, los protocolos en este documento se describen los pasos esenciales necesarios para el desarrollo y prueba de cepas de levadura auxotróficos probióticos para la entrega de la proteína terapéutica heteróloga al intestino. Esta manipulación y el ensayo de levadura viva recombinante requiere técnicas y recursos con los que cualquier laboratorio individuo puede no estar familiarizado actualmente. Por lo tanto, a pesar de numerosos estudios anteriores han descrito los protocolos anteriores para múltiples cepas de leva.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores reconocen la financiación a través del Centro Infantil de Inmunología y Vacunas y un premio Innovador Nueva NIH (1DP2AI112242-01) adjudicado a Tracey J. Cordero. Los autores también agradecen a Natalya P. Degtyareva por la generosa contribución de rad1 S. cerevisiae.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Espectrofotómetro SmartSpec 3000 | BioRad | 170-2501 | Ejemplo de espectrofotómetro para determinar la concentración celular y el diámetro exterior 600 de cultivos de levadura |
| New Brunswick Tambor de rodillos | Eppendorf | M1053-4004 | Ejemplo de tambor de rodillos para la incubación de cultivos de levadura |
| UV Stratalinker 2400 | Stratagene | 400075-03 | Ejemplo de stratalinker |
| Contador de colonias Stuart SC6PLUS | 11983044 | Fisher | Scientific Plate soporte con registros de aumento recuento de colonias al detectar la presión de la pluma |
| Contador de colonias Scienceware | F378620002 | Bel-Art Scienceware Bolígrafo de | mano para contadores de colonias |
| Réplica de dispositivo de recubrimiento | Fisherbrand | 09-718-1 | Ejemplo de réplica de soporte y almohadillas de recubrimiento |
| Cuadrados de terciopelo | Fisherbrand | 09-718-2 | |
| Esparcidores de células estériles en forma de L | Fisherbrand | 14665230 | |
| Ácido desoxirribonucleico, monocatenario de testículos de salmón | Sigma-Aldrich | D7656-1ML | Ejemplo de ADN portador para levadura Transformación de LiOAc |
| Agujas de sonda nasogástrica | Braintree Scientific | N-PK 002 | Para ratones de 15 a 20 g, la aguja sugerida es una aguja de sonda nasogástrica reutilizable de calibre 22 (1,25 mm), recta y de 1 pulgada de largo. Para ratones que pesen más de 20 g, se pueden usar agujas de sonda nasogástrica rectas o curvas de calibre 20 o más grandes |
| ml estéril de punta deslizante jeringa de tuberculina desechable | Becton Dickinson | BD 309659 | |
| Pinzas romas como Electrónica Microscopy Sciences Punta dentada de 7" (178 mm), pinzas de agarre amplio | Microscopía Electrónica | 77937-28 | Ejemplo de pinzas romas necesarias para la disección |
| Tijeras de disección rectas y curvas | Electrónica Microscopy Sciences | 72966-02 y 72966-03 | Ejemplos de tijeras necesarias para la disección |
| IMDM | Life technologies | 12440053 |
Referencias
- Edwards-Ingram, L., Gitsham, P., et al. Genotypic and physiological characterization of Saccharomyces boulardii, the probiotic strain of Saccharomyces cerevisiae. Applied and environmental microbiology. 73 (8), 2458-2467 (2007).
- Hudson, L. E., Fasken, M. B., et al.
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Reimpresiones y permisos
