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Artículo de método

Transformación de la levadura probiótica y su recuperación de tejidos gastrointestinales inmune después de alimentación forzada oral en ratones

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DOI:

10.3791/53453

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8 de febrero de 2016

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1Department of Pediatrics, Emory University School of Medicine, 2Department of Biochemistry, Emory University School of Medicine

En este artículo

Resumen

Se presenta aquí una descripción unificada de las técnicas que se pueden utilizar para desarrollar, transformar, administrar y poner a prueba la expresión de proteínas heterólogas de la levadura probiótica Saccharomyces boulardii.

Resumen

El desarrollo de la terapia oral recombinante permitiría dirigirse más directamente al sistema inmunitario de la mucosa y mejorar la capacidad de combatir los trastornos gastrointestinales. La adaptación de la levadura probiótica en particular para este enfoque conlleva varias ventajas. Estas cepas no solo tienen el potencial de sintetizar una amplia variedad de proteínas heterólogas complejas, sino que también son capaces de sobrevivir y proteger esas proteínas durante el tránsito a través del intestino. Sin embargo, este enfoque requiere experiencia en muchas técnicas de laboratorio diversas que no suelen utilizarse en conjunto. Además, aunque los protocolos individuales para la transformación de la levadura están bien caracterizados para las cepas de laboratorio de uso común, aquí se hace hincapié en los enfoques alternativos y en la importancia de optimizar la transformación para las cepas probióticas menos caracterizadas. Detallar estos métodos ayudará a facilitar el debate sobre los mejores enfoques para probar la levadura probiótica como vehículos de administración de fármacos orales y, de hecho, servirá para avanzar en el desarrollo de esta nueva estrategia para la terapia gastrointestinal.

Introducción

Los microorganismos probióticos son un medio potenciales interesantes de la entrega de manera eficiente y económica proteínas heterólogas en el tracto gastrointestinal. Estos organismos son capaces de sobrevivir el paso a través del tracto gastrointestinal sin embargo no colonizarlo 1, lo que permite la dosificación controlada y limitar la exposición a la droga expresó. Además, la capacidad de diseñar fácilmente estos organismos para producir la proteína heteróloga a gran escala las hace una alternativa económica a las partículas de entrega sintéticos. Sin embargo, el desarrollo de un enfoque de este tipo, como se ha demostrado recientemente el uso de una cepa auxotrófica de la levadura Saccharomyces probióticas boulardii 2, requiere el conocimiento de las técnicas de laboratorio sin combinar tradicionalmente en un estudio dado, que van desde la levadura y la biología molecular de las técnicas de manipulación de los animales y métodos inmunológicos. Así, aunque los procedimientos individuales descritos en este documento no son en sí mismos novelaprotocolos de laboratorio, el objetivo de este manuscrito es presentar una introducción a las técnicas unificada necesarios para las pruebas experimentales de la levadura probiótica como vehículos de administración de fármacos en el tracto gastrointestinal murino. Proporcionada es una compilación de los protocolos esenciales para: 1) la generación de cepas mutantes auxotróficos de levadura que pueden ser fácilmente manipulados genéticamente; 2) la transformación de cultivos de levaduras para expresar la proteína heteróloga; 3) la administración de levadura recombinante al intestino a través de una sonda nasogástrica; y 4) la recuperación de la levadura recombinante probiótico viable desde el intestino murino y evaluación de su expresión de la proteína heteróloga.

En primer lugar, si bien existen numerosos métodos de selección positivos y negativos para la manipulación de especies de levadura, selección negativa tal como mediante el uso de marcadores auxotróficos aumenta tanto la eficiencia y la facilidad con la que la levadura puede ser transformada y seleccionado. La selección positiva de los transformantes usando antibióticos, en contrast, aumenta significativamente el coste de la manipulación de la levadura. Por otra parte, la selección de la levadura en medio sólido que contiene los antibióticos puede permitir un mayor crecimiento de las colonias transformadas fondo relativos a la selección de la levadura auxotrófico en caída sintética a cabo los medios sólidos (observaciones no publicadas). levadura auxotrófico es cepas que carecen de enzimas críticas para la síntesis de los aminoácidos esenciales o uracilo. Tal levadura puede crecer solamente si se complementa con el metabolito falta o genes metabólicos, lo que permite que la selección negativa cuando la levadura se cultivó en placas sobre gota sintética a cabo los medios de comunicación que carece del metabolito esencial. Muchos Saccharomyces comúnmente usados ​​son cepas de laboratorio cerevisiae, de hecho, ya mutantes auxotróficos 3. Industrial, clínica, y las cepas de levadura probióticas, sin embargo, son típicamente prototrophic con la capacidad de sintetizar todos los nutrientes requeridos. Para permitir la manipulación genética más eficiente de tal levadura, genes auxotróficos pueden ser dirigidos selectivamentepara generar cepas que se pueden seleccionar sin antibióticos. La orientación específica de los genes marcadores auxotróficos se puede lograr a través de la interrupción de genes mediada por PCR basándose en la recombinación homóloga o más recientemente a través de CRISPR / Cas9 orientación 4-6. Como alternativa, la mutagénesis UV puede generar rápidamente los mutantes auxotróficos incluso en cepas de levadura para las que la transformación con múltiples plásmidos es técnicamente difícil 7. Si bien la orientación CRISPR PCR y / Cas9 han sido ampliamente descritos en otras partes, presentado en la primera parte de este manuscrito es un protocolo detallado que describe un enfoque de mutagénesis UV para crear cepas auxotróficas que permitan la selección negativa en lugar de los antibióticos de selección positiva de los transformantes de levadura.

El siguiente paso necesario en el uso de tales cepas auxotróficas para la administración oral de la proteína heteróloga es la transformación de levadura con ADN de plásmido. Desde la primera transformación con éxito de síest esferoplastos reportados para Saccharomyces cerevisiae en 1978 8, numerosas modificaciones se han caracterizado para aumentar la eficiencia y la facilidad con la que las especies de levadura se pueden modificar genéticamente. El uso de electroporación para la transformación exitosa de ADN en S. cerevisiae fue descrita por primera vez en 1985 9 y desde entonces ha sido mejorada mediante la adición de incubación de 1 M de sorbitol al 10 osmóticamente células de apoyo. Eficiencia electroporación Además, se ha demostrado que dependen de la especie de levadura y cepa, el número de células y la fase de crecimiento, el volumen de la electroporación, la intensidad de campo, y tampones específicos 11. La transformación de litio de etilo (LiOAc), originalmente descrita por Ito et al. 12, es uno de los protocolos de transformación más comúnmente utilizados, ya que no requiere ningún equipo especial. Análisis adicionales mostraron que la eficiencia de transformación de levadura LiOAc aumenta en gran medida cuando las células se recogen en fase semilogarítmicade crecimiento y se sorprendió de calor en presencia de polietilenglicol (PEG) y el ADN a 42 ° C 12. La incubación de la levadura intacta entera con PEG es esencial para la transformación eficiente, posiblemente a través de la mejora de la unión de ADN a la membrana celular, así como a través de otros efectos sobre la membrana 13. Sí litio también aumenta la permeabilidad de las células intactas 14. Aunque la mayor parte de laboratorio S. cepas cerevisiae pueden ser fácilmente transformado mediante LiOAc transformación 3, otras especies de levaduras pueden ser transformadas de manera más eficiente a través de protocolos alternativos. Pichia pastoris, por ejemplo, es más eficiente transformado a través de la electroporación en lugar de transformación LiOAc 13. Es crucial, por lo tanto, para probar múltiples métodos de transformación y para optimizar los periodos de incubación y las concentraciones de reactivos cuando se trata de modificar genéticamente una cepa de levadura sin caracterizar. Por tanto, este manuscrito describe tanto LiOAc transformation y electroporación como técnicas para la transformación del mutante auxotrófico y de tipo salvaje S. boulardii. Los lectores interesados ​​pueden dirigirse a las recientes revisiones para descripciones exhaustivas de la evolución de la transformación de levadura, protocolos alternativos, y más discusiones de posibles mecanismos de acción 13,15. Transformación de levadura con el plásmido que codifica una proteína fácilmente detectable es, además, esencial para las pruebas de aguas abajo con el fin de asegurar la expresión y función de la proteína heteróloga adecuada. proteínas Myriad diferentes pueden seleccionarse en función del objetivo final del estudio terapéutico y los anticuerpos disponibles para la detección de proteínas por inmunotransferencia, ELISA, y otras técnicas. Los protocolos para estas técnicas se han descrito a fondo en otra parte 16,17, y se pueden utilizar para determinar los niveles de producción de proteínas heterólogas a partir de levadura transformada por comparación con las curvas de calibración. Para los propósitos de demostración y para mostrarproducción exitosa de una proteína muy utilizado comúnmente en la biología de la levadura, este manuscrito presenta transformación con plásmido que codifica la proteína verde fluorescente (GFP), que permite la posterior detección mediante microscopía de fluorescencia.

Igualmente importante para la producción de organismos probióticos que expresan la proteína heteróloga es la adecuada administración y detección de estos microorganismos dentro de los tejidos gastrointestinales, como se describe en partes tres y cuatro. La administración de levadura recombinante a través de una sonda oral permite la entrega de cantidades controladas de levadura directamente en el estómago, de la que C57BL / 6 ratones son naturalmente incapaz de vómitos 18. Sin embargo, el manejo de animales inadecuada y alimentación forzada puede conducir a daño esofágico y perforación, perforación gástrica, administración traqueal, y neumonía por aspiración 19,20. Una técnica deficiente y la falta de experiencia, además, pueden aumentar la variabilidad en la respuesta inmune murina experimental y results, que han sido atribuidos a estrés de los animales sobre una sonda oral 21,22. La práctica en la técnica apropiada de este modo no sólo puede atenuar las molestias animal, pero también puede aumentar la precisión de los resultados experimentales. Este manuscrito describe y demuestra la manipulación de animales y una sonda nasogástrica para la administración de dosis controladas de levadura recombinante.

Por último, es vital para confirmar la entrega exitosa de levadura recombinante mediante el análisis de tejidos linfoides para la presencia de la levadura y la proteína heteróloga. Los tejidos inmunes gastrointestinales que pueden más fácilmente y de manera previsible ser examinados para la presencia de la levadura son las placas de Peyer. Placas de Peyer son órganos linfoides secundarios a lo largo del intestino delgado que son sitios clave de la mucosa inducción respuesta inmune 23. Antígenos de los lumen se transfieren transcelular a través de micropliegues células (M) en el epitelio y se liberan en las placas de Peyer, exponiendo así encerrard antígeno de células presentadoras de contenido luminal intestinal. Aunque la absorción de partículas a través del epitelio intestinal también se puede lograr por las células caliciformes, estas células se ha demostrado que sólo ocupan partículas de menos de 0,02 m de diámetro 24. Dendritas transepiteliales extendieron a partir de células dendríticas CD103 + (DC) también ocupan pequeñas partículas desde el lumen intestinal 25; Sin embargo, actualmente no existen informes que demuestran que CD103 + DC ocupan las partículas más grandes que las bacterias. Por lo tanto, la levadura probiótica intacto, de tamaño medio de entre 3 a 6 m de diámetro, son más propensos a ser absorbidos por las células M y se transfirió a las placas de Peyer. Descrito aquí es un protocolo de recogida y selección de las placas de Peyer para levadura recombinante viable, aunque este procedimiento también se puede adaptar fácilmente para la evaluación de la absorción de bacterias probióticas.

En resumen, la evaluación de la levadura recombinante probiótico para la entrega de larapeutic proteínas en el intestino requiere el dominio de las técnicas de laboratorio que abarcan la biología molecular para el manejo de animales e inmunología. Aquí se presentan son los protocolos para 1) la generación y selección de cepas de levadura auxotróficos que puede ser fácilmente seleccionado negativamente sin antibióticos, 2) protocolos alternativos para transformar la levadura y permiten la expresión de la proteína heteróloga, 3) demostraciones de técnicas de manejo de animales adecuados y sonda oral durante intragástrico la entrega de la levadura recombinante, y 4) protocolos para la disección de las placas de Peyer y la detección de levadura recombinante viable y funcional proteína heteróloga. Combinados, estos protocolos permitirán la generación y prueba de una cepa de levadura probiótico capaz de entregar proteína terapéutica heterólogo en el tracto gastrointestinal.

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Protocolo

1. Mutagénesis UV para generar cepas de levadura auxotroficos

  1. Generar curvas de supervivencia para determinar las dosis necesarias de la irradiación UV
    1. Preparar YPD (extracto de levadura de peptona dextrosa) medios de comunicación y otros reactivos enumerados en la Tabla 1 de acuerdo con procedimientos estándar 26 e inocular colonias individuales en 5 a 10 ml de medio YPD. Incubar culturas en un tambor de rodillo a 30 ° CO / N a la saturación por lo menos durante 8 hr.
    2. Determinar la concentración de células de cultivos O / N utilizando un espectrofotómetro mediante la dilución de las células de 01:10 en agua en una cubeta de plástico. Diluir las células hasta una concentración de 10 7 células / ml en 20 ml de agua destilada estéril.
    3. Verter células diluidas en una placa de Petri de plástico estéril y, con la tapa quitada, coloque la placa de 14 cm por debajo de una lámpara de UV.
    4. Exponer las células a 5.000 mu J serie y 10.000 dosis de irradiación UV mu J, extrayendo 500 l de células después de cada incremento de tal manera que las célulasse muestrean después de la exposición a 0 mu J, 5.000 mu J, 10.000 mu J, 15.000 mu J, 20.000 mu J, 25.000 mu J, 30.000 mu J, 40.000 mu J y 50.000 mu J de la irradiación UV. muestras de células de transferencia estéril extraído para tubos de 1,5 ml y se diluyen en serie a las 1:10 incrementos en agua estéril.
    5. Precipitar las células en cada dilución por centrifugación en una microcentrífuga a 16.000 xg durante 1 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender en un volumen de 100 l de agua estéril apropiada para el recubrimiento de las células de levadura. Pipetear el volumen completo de células resuspendidas sobre placas que contienen medio sólido YPD y utilizar un esparcidor estéril para distribuir uniformemente las células a través de cada placa.
    6. Envolver bordes de la placa en Parafilm para evitar la desecación de los medios de comunicación y las placas de cubierta en papel de aluminio para evitar la foto-reactivación y la reparación de las mutaciones inducidas por UV. Incubar las placas al revés a 30 ° C durante 2-4 días para permitir el crecimiento de colonias de levadura viables (Figura 1).
    7. Contar el number de colonias, opcionalmente con la ayuda de un bolígrafo para marcar de colonias contadas, una pluma contador electrónico de mano, o un contador de pie con la ampliación. Parcela como un porcentaje del total de células chapados en cada dosis mu J de la irradiación UV para generar una curva de supervivencia para la levadura irradiado (Figura 2).
      NOTA: haploide cepas de levadura se puede esperar que requieren dosis más bajas de UV irradiación con relación a las cepas diploides para alcanzar el mismo porcentaje de supervivencia. Una cepa de levadura que carece de las enzimas de reparación del ADN funcionales, tales como la rad1 S. cerevisiae mutante, se puede utilizar como un control positivo para indicar la presencia de la irradiación UV a dosis muy bajas.
    8. Determinar la dosis de mutagénesis UV que se utiliza para la detección por referencia a la curva de supervivencia establecida en 1.1.7. El valor x del punto a lo largo de la curva de supervivencia en la que y es igual a 50 es la dosis de irradiación UV a la que 50% de levadura de sobrevivir. La detección de mutantes en esta baja supervivencia por ciento puede resultar en unamayor rendimiento de cepas mutadas con éxito, en particular para la levadura diploide. La dosis de supervivencia de 50% para WT S. boulardii, como se muestra en la Figura 2, es de aproximadamente 18.000 mu J.
      NOTA: A pesar de que tales dosis de rayos UV puede aumentar el riesgo de mutaciones en los genes de las vías celulares distintos del gen marcador auxotrófico de interés, este inconveniente debe ser equilibrada con la necesidad de inducir mutaciones en ambas copias del gen marcador auxotrófico. Para las cepas haploides en la que debe mutarse solamente una copia del gen, la detección en un porcentaje de supervivencia más alta, tal como al 90%, disminuye el riesgo de mutaciones adicionales y todavía permite la generación suficiente de mutantes auxotróficos.
  2. mutagénesis UV y la detección de cepas de levadura auxotróficos
    1. Preparar la levadura como se describe en los pasos 1.1.1-1.1.3.
    2. Exponer a la levadura a la dosis de irradiación UV correspondiente a la supervivencia del 50%, como se determina en 1.1.8. Para WT S. boulardii, esta dosis was se determinó que aproximadamente 18.000 mu J (Figura 2).
    3. Recoger volúmenes de 1 ml de UV irradiados levadura y pellet por centrifugación en una microcentrífuga a 16.000 xg durante 1 min. células sobrenadante y resuspender aspirado en 100 l de agua estéril.
      1. La selección de mutantes
        1. Si se utiliza la selección tal como con ura3 - mutantes auxotróficos, la placa se irradió la levadura en medios que contiene ácido 5-fluoroorótico (5-FOA) para seleccionar las células que carecen de una enzima funcional URA3.
          NOTA: Cualquier levadura que contiene copias funcionales de Ura3 convertirá 5-FOA a la toxina 5-fluorouracilo, lo que lleva a la muerte celular y que permite una fácil selección de ura3 - colonias que carecen de un funcional URA3 27. Análogos criterios de selección son posibles para los LYS2 y LYS5; marcadores y MET2 y MET15 utilizando medios que contienen ácido α-aminoadıpico 28; TRP1; 5-fluoroácido antranílico 29; y 30,31 metil mercurio, respectivamente.
        2. Pipetear los 100 l de células resuspendidas en medio mínimo que contenían 5-FOA y utilizar un esparcidor estéril para cubrir uniformemente la placa. Envolver las placas en Parafilm y se incuba boca abajo a 30 ° C durante 2-4 días para permitir el crecimiento de las colonias de levaduras viables.
        3. Para confirmar el ura3 - fenotipo de cualquier colonia que aparece en 5-FOA placas por restreaking en YPD, uracilo - y las placas 5-FOA (Figura 3). Use la punta de un palillo estéril para recoger parte de una sola colonia y arrastrar suavemente las células a través de YPD fresco, uracilo -, y las placas 5-FOA. Una vez más incubar las placas envueltas boca abajo a 30 ° C durante 2-4 días.
          NOTA: aparecerá colonias viables, como se plantea, unos crecimientos circulares mientras que las células no viables aparecerán sólo como un frotis opaca sin ningún tipo de crecimientos elevados (Figura 3).
      2. screening de mutantes
        1. Si la generación de un mutante auxotrófico para los que los métodos de selección no están disponibles, se preparan diluciones seriadas 1:10 de UV irradiaron células de levadura en agua estéril y una pipeta de las diluciones a un medio YPD, usando un esparcidor estéril para cubrir uniformemente la placa.
        2. Envolver las placas en Parafilm y se incuba boca abajo a 30 ° C durante 2-4 días. Determinar lo que permitió el crecimiento de las colonias individuales que se puedan distinguir fácilmente entre sí, por lo general no más de aproximadamente 100 colonias por placa de dilución.
        3. mutagénesis UV de repetición de las muestras de levadura como se describe en 1.2.1-1.2.3 y la placa de células en este determinado dilución. Pipetear la levadura diluido en medios YPD, utilizar un esparcidor estéril para distribuir las células, y se incuban las placas envueltas al revés a 30 ° C durante 2-4 días.
        4. Pantalla para auxótrofos mediante siembra de réplica en medios selectivos que carecen del metabolito de interés. En primer lugar, asegurar un cojín de terciopelo estéril sobre una placa de soportee invertir la placa con colonias irradiados con UV en el terciopelo, que marca la orientación de la placa.
        5. A continuación, invertir un plato fresco que carece del metabolito de interés sobre el terciopelo y presione ligeramente para transferir células de la terciopelo a la placa. Guarde la placa original a 4 ° C. Envolver e incubar la nueva plancha boca abajo a 30 ° C durante 2-4 días.
        6. Como alternativa al cultivo en placas replicadas, los mutantes de pantalla por colonias re-formación de vetas de YPD en medios selectivos. Utilice la punta de un palillo de dientes estéril para recoger parte de una sola colonia y suavemente arrastrar las células a través de una placa de YPD fresco y una placa que carece del metabolito de interés. Una vez más incubar las placas envueltas boca abajo a 30 ° C durante 2-4 días.
          NOTA: Se debe tener cuidado para seleccionar colonias individuales y consecutivas a cabo colonias múltiples veces para confirmar una población homogénea de células auxotróficas verdaderos.
    4. confirmar aún más el fenotipo de las células irradiadas por inoculadosing colonias individuales en 5 a 10 ml de YPD y tanto los medios que carecen de la metabolito apropiado (por ejemplo, en uracilo - medios de comunicación para una ura3 - mutante). Incubar en un tambor de rodillo a 30 ° CO / N para confirmar el crecimiento de las células en medios YPD pero no en la ausencia del metabolito.
      NOTA: A pesar de que los patrones de crecimiento en medios sólidos deben indicar claramente el estado de levadura auxotrófico, es posible que algunos de levadura para tolerar el estrés y la forma, colonias pequeñas de crecimiento lento en medios sólidos, pero aún no tolera las mismas condiciones en medios líquidos (observaciones no publicadas). Inoculación en cultivos líquidos por lo tanto se debe realizar para confirmar a fondo los patrones de crecimiento de los mutantes UV irradiada.
    5. Para el almacenamiento a largo plazo de los mutantes auxotróficos confirmados, preparar las células madre de glicerol por inoculación en 10 ml de YPD y se incubaron en un tambor de rodillos O / N a 30 ° C. Precipitar las células por centrifugación durante 3 min a 2.500 xg y medios de aspirado. Resuspender las células en un 50%glicerol, filtrada y estéril, transferir a un criovial, y se almacena a -80 ° C.
      NOTA: levaduras mutagenizado UV contiene potencialmente mutaciones en múltiples genes distintos en el marcador auxotrófico de interés. Antes de continuar con el uso de mutantes auxotróficos verificadas, estas cepas deben ser analizados a través de la secuenciación de genes y la evaluación de la resistencia a pH, las tensiones de ácidos biliares, y otras características relevantes de cepas probióticas, como se describe en otro lugar 2. Además, el uso de homología PCR o CRISPR / Cas9 la orientación de mutar de forma más selectiva marcadores auxotróficos deben ser considerados como una alternativa a la mutagénesis UV 4 - 6.

2. Transformación de la levadura

  1. LiOAc Transformación de levadura
    1. Se inoculan colonias de levadura individuales en 5-10 ml de medio YPD y se incuba en un tambor de rodillos a 30 ° CO / N.
    2. Para inducir la fase logarítmica de crecimiento y aumentar la eficiencia de la captación de plásmido, deconcentración celular Termine utilizando un espectrofotómetro para medir una dilución 1:10 de las células en agua estéril en una cubeta de plástico. Diluir O / N culturas a un OD 600 de 0,16 a 0,2 (aproximadamente 2 x 10 6 - 2,5 x 10 6 células / ml) en 50 ml de YPD caliente fresco y se incuban las células en un agitador de plataforma orbital ajustado a 200 rpm hasta que el cultivo llega a aproximadamente 1 x 10 7 células / ml, generalmente alrededor de 4 horas.
      NOTA: Eficacia de la transformación se puede medir como una función del número de unidades formadoras de colonias de levadura transformadas con éxito (UFC) por g de ADN plásmido. El aumento de la eficiencia en las colonias más transformadas por g de ADN plásmido. Subcultivo de células de levadura y recogida durante la fase logarítmica de crecimiento es un factor que aumenta la eficiencia de transformación 12.
    3. Precipitar las células por centrifugación a 2500 xg durante 3 min.
    4. Aspirar las células sobrenadante y transferir a un tubo de 1.5 ml por resuspensión del pelly en 1 ml de agua estéril.
    5. Precipitar las células por centrifugación a 16.000 xg durante 1 min en una microcentrífuga, aspirar el sobrenadante y se lavan las células mediante resuspensión en 1 ml de TE / LiOAc (Tris EDTA LiOAc) buffer.
    6. Repita células de centrifugación y resuspender en tampón TE / LiOAc a una concentración de 2 x 10 9 células / ml.
    7. Preparar las mezclas de transformación con cada uno de los siguientes: 50 l de levadura preparado en tampón TE / LiOAc, 5 l de ADN portador (10 g / l), y 1 l de ADN plásmido (1 mg). Microgramos de plásmido de ADN puede ser titulada como el aumento de cantidades de ADN pueden o no pueden conducir a una mayor eficiencia de transformación 32
      NOTA: Para obtener una cepa de levadura mutante que carece de un marcador auxótrofo, un solo plásmido que codifica el marcador puede ser transformado por muestra. Además, el uso de un plásmido que codifica una proteína fácilmente detectable, tal como GFP, permitirá la determinación eficiente de plegado y la expresión de PR heteróloga adecuadaOtein por la cepa de levadura después de la transformación.
    8. Para cada preparación, añadir 300 l de PEG / LiOAc / TE y mezclar bien. La incubación de células intactas con PEG es esencial para la transformación eficiente 13.
    9. Incubar los preparativos a 30 ° C durante 30 minutos con agitación mediante la colocación de tubos de microcentrífuga en un vaso de precipitados se coloca sobre un agitador de plataforma orbital a 200 rpm.
    10. Añadir 35 l de DMSO a cada célula de reacción y de choque térmico durante 15 minutos en un baño de agua 42 ° C. Aunque hay informes contradictorios de la ventaja añadida de DMSO 33, de choque térmico de células de levadura intactas se ha demostrado que aumenta en gran medida la eficiencia de transformación 12.
    11. Lavar las células mediante sedimentación a través de centrifugación como en 2.1.5, aspiración o pipeteado el sobrenadante, y resuspender en 1 ml de agua estéril. pipeta suavemente hacia arriba y hacia abajo para romper el sedimento celular.
      NOTA: Es fundamental para eliminar completamente el sobrenadante debido a que el uso de los mediosd en la generación de células competentes puede inhibir el crecimiento de la levadura y la formación de colonias.
    12. Repita la granulación celular como en 2.1.5, aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 100 l de agua estéril. Pipetear el volumen completo sobre una placa selectiva y utilizar un esparcidor estéril para cubrir uniformemente la placa con levadura transformada.
    13. Envolver bordes de las placas revestidas en Parafilm para evitar el secado de los medios de comunicación e incubar al revés a 30 ° C durante 2 días para permitir el crecimiento de células de levadura transformadas. El éxito, la transformación eficiente y selección auxotrófico de Saccharomyces cerevisiae produce un alto número de colonias por preparación transformación, aunque el rendimiento puede ser mucho menor para otras cepas (Figura 4).
    14. placas de levadura tienda para el corto plazo (generalmente 1-3 semanas) en posición invertida y cubierta a 4 ° C. Preparar las existencias de glicerol de levadura transformada como se describe en 1.2.5 para el almacenamiento a largo plazo.
      NOTA: Nuevos estudios de pruebas transformado CFT son necesarios para determinar la estabilidad del plásmido y evaluar la expresión apropiada de la proteína heteróloga. Descripciones exhaustivas de la estabilidad del plásmido 34, el uso de inmunotransferencia para la detección de proteínas desnaturalizadas recuperados de muestras de células 17, enzimoinmunoensayo (ELISA) para detectar correctamente plegada tres proteínas dimensionales 16, y el uso de GFP en los estudios de levadura 35 están disponibles en otros lugares. Figura la figura 6 muestra una imagen representativa de la expresión de GFP éxito en S. transformado cerevisiae relación con las células no transformadas. El uso de una proteína tal fluorescente es un medio para determinar de manera eficiente la producción de proteína heteróloga éxito.
  2. Electroporación de levadura
    1. Se inoculan colonias de levadura individuales en 5-10 ml de medio YPD y se incuba en un tambor de rodillos a 30 ° CO / N.
    2. Determinar la concentración de células utilizando un espectrofotómetro para medir una dilución 1:10 de las células en agua estéril. dilaúd O / N en cultivos de 100 ml calientes frescos de los medios YPD a un OD 600 equivalente a aproximadamente 0,3. Incubar las subculturas a 30 ° C en un juego de plataforma de agitación a 200 rpm hasta alcanzar una DO600 de aproximadamente 1,6, por lo general 4-5 hr. Cada subcultura 100 ml generará suficientes células condicionadas por dos reacciones de transformación.
    3. Precipitar las células por centrifugación a 2500 xg durante 3 min. Aspirar el sobrenadante y lavar las células mediante resuspensión en 50 ml de hielo agua estéril fría. Repetir el lavado sedimentando las células, aspirando el sobrenadante y resuspender en 50 ml de hielo fresca agua estéril fría.
    4. Sedimentar las células de nuevo y volver a suspender en 50 ml de hielo frío tampón de electroporación (1 M sorbitol, 1 mM CaCl 2).
    5. Repita el giro como en 2.2.3, se aspira el sobrenadante y volver a suspender las células en 20 ml de H LiOAc / 10 mM de DTT 0,1. Incubar suspensión de células en un tambor de rodillo a 30 ° C durante 30 min. La preincubación de las células en LiOAc y DTT aumenta sinérgicamente laeficiencia de la electroporación 36.
    6. Sedimentar las células como en el punto 2.2.3, eliminar el sobrenadante y lavar por resuspensión en 50 ml de hielo frío tampón de electroporación. Repita células de centrifugación y resuspender en tampón de electroporación de hielo frío a un volumen final de 1 ml.
    7. Preparar en el hielo: acondicionado, células de levadura, cubetas de electroporación estériles, y el ADN plásmido. Inmediatamente después de la resuspensión final de células acondicionado en tampón de electroporación de 1 ml, se combinan 400 l de células de levadura acondicionado con aproximadamente 1 g de ADN plásmido y añadir a un hielo frío de 0,2 micras electroporación cubeta. El uso de mayores cantidades de DNA puede aumentar ligeramente la eficiencia de transformación 11. Incubar la reacción en hielo durante 5 minutos, después se electroporate con el conjunto electroporador a 2,5 kV y 25 mF.
      NOTA: Como se describe en 2.1.7, una cepa de levadura mutante que carece de un marcador auxotrófico puede ser transformada con un único plásmido que codifica el marcador mutado por muestra. Además, el usoun plásmido que codifica una proteína fácilmente detectable tal como GFP permite la determinación eficiente de plegado y la expresión de proteína heteróloga después de la transformación apropiada.
    8. Transferencia de las células a electroporación en 8 ml de una mezcla 1: 1 de YPD: 1 M sorbitol y permitir que las células se incuban en un tambor de rodillo a 30 ° C durante 60 min.
    9. Precipitar las células como en los puntos 2.2.3 y resuspender en 100 l 1: 1: 1 YPD M sorbitol. Placa de todo el volumen en medios selectivos que contienen 1 M sorbitol, envolver bordes de las placas en Parafilm, y se incuban las placas al revés a 30 ° C durante 2-5 días para permitir el crecimiento de células de levadura transformadas.
      NOTA: Es muy importante levadura transformada prueba para evaluar la expresión adecuada de proteína heteróloga, tal como se describe en 2.1.14 y 2.2.7.

3. sonda oral de ratones con levadura transformada

  1. Realizar todos los procedimientos de cuidado de los animales y de manipulación de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Laboratorio Unimals y Animal Care institucional y la aprobación del Comité de Uso.
  2. Preparar cultivos O / N de la levadura mediante la inoculación de colonias individuales de levadura auxótrofo transformado en 5-10 ml de medio selectivo. Incubar cultivos O / N para al menos 8 horas en un tambor de rodillo a 30 ° C hasta que se satura.
    NOTA: El uso de proteínas de prueba plásmido que codifica tales como GFP permitirá la facilidad de las pruebas de la expresión de proteínas en la levadura alimentado a la fuerza, como se describe en 4.7.
  3. Para la inducción máxima de la expresión de proteínas y para inducir el crecimiento de fase log, preparar subcultivos de la O / N cultivos por dilución a un OD 600 de aproximadamente 0,16 a 0,2 equivalentes en 50 ml de medio de comunicación adecuado como se describe en 2.1.2.
  4. Determinar la concentración de las células subcultivadas como en 1.1.2 y ajustar a 10 9 células / ml. Preparar una dosis de 100 l para cada ratón, con unos pocos cientos volumen l extra por grupo para mejorar la precisión y la facilidad de carga de la muestra.
  5. Precipitar las células por centrifugación a 2.500 xg durante3 min o en una microcentrífuga a 16.000 xg durante 1 min. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender las células mediante la adición de un volumen igual de agua estéril y suavemente pipeteando arriba y abajo.
  6. Fijar una aguja de calibre por sonda adecuada (22 G para los ratones 15-20 g) en una jeringa y la levadura de carga muestra de 1 ml estéril, asegurándose de eliminar las burbujas y establecer émbolo a un incremento de 100 l. Cargar una jeringa adicional con agua estéril para los ratones de control de alimentación por sonda y verificar la presencia de cualquier contaminante de levadura.
  7. Recoger el ratón para ser alimentado a la fuerza con la mano no dominante, con el dedo índice y el pulgar firmemente agarrando la piel alrededor del cuello (Figura 6A). Meter la cola bajo el dedo pequeño para evitar el movimiento de la parte inferior del cuerpo. Asegúrese de que el agarre es seguro y prohíbe el ratón se mueva la cabeza con el fin de evitar daños en los tejidos internos durante la alimentación por sonda.
    NOTA: estimar hasta qué punto se debe insertar la aguja de sonda mediante la celebración de la aguja contra el ratón de tal manera quela bombilla es incluso con el apéndice xifoides del esternón. Inserción de esta longitud de la aguja típicamente permitirá que el bulbo aguja de sonda entre en el estómago.
  8. El uso de la mano dominante, introduzca suavemente la aguja de sonda en el esófago del ratón inclinando la aguja a lo largo del techo de la boca y de la garganta, manteniendo ligeramente a la izquierda del centro. Espere a que el ratón para tragar la bombilla de la aguja y permita que la aguja desciende un poco más hasta el punto estimado en 3,7 (Figura 6B). Si cualquier siente resistencia durante la inserción de la aguja de sonda o si el ratón en cualquier momento empieza a jadear, eliminar suavemente la aguja y de nuevo tratar de encontrar el esófago.
  9. Después de que el ratón se ha tragado el bulbo de la aguja de sonda, presione suavemente el émbolo de la jeringa para administrar 100 l (10 8 CFU) de levadura directamente en el estómago de ratón.
    NOTA: Aunque los ratones son incapaces de vomitar cualquiera de la solución alimentado a la fuerza después de la administración 18,19 , es posible para el reflujo que se produzca durante la alimentación forzada 21,37. La inserción adecuada de la aguja de sonda, así como el ajuste del volumen y la viscosidad de la solución, puede ayudar a limitar el reflujo y asegurar una dosificación precisa.
  10. Retire cuidadosamente la aguja de sonda en el estómago y el esófago del ratón y devolver el ratón a la jaula. Compruebe que el ratón está respirando y moviéndose normalmente después de alimentación forzada para asegurar que la aguja de sonda se inserta adecuadamente durante todo el procedimiento y que ninguna solución se aspiró.

4. Cosecha de las placas de Peyer murinas y aislamiento de colonias de levaduras viables

  1. En el momento apropiado punto de post alimentación forzada, por lo general de 4 horas, los ratones sacrificio utilizando métodos aprobados IACUC. Compruebe si hay falta de capacidad de respuesta tras una pizca dedo del pie, y el uso de una medida secundaria como dislocación cervical a sacrificar el ratón. puntos de tiempo adicionales también pueden ser probados, ya que numerosos estudios han demostrado que la eficiencia y la sincronización de hastatomar a través del epitelio depende 38,39 partícula.
  2. Coloque el ratón con el abdomen totalmente expuesto y esterilizar la zona abdominal por pulverización con EtOH al 70%. Hacer una incisión transversal a través de la piel y cuero con tijeras, con cuidado de no dañar los tejidos internos. palanca manual de la incisión abierta para exponer aún más el peritoneo, el revestimiento serosa delgada que cubre los órganos abdominales. levante suavemente el peritoneo y hacer una incisión transversal para exponer los intestinos.
  3. Con cuidado, usar fórceps romos para provocar el intestino delgado de las arterias mesentéricas, la grasa y otros tejidos. Exponer el intestino delgado desde el estómago, en el cuadrante superior izquierdo del abdomen del ratón, hasta el ciego, el bolsillo grande de tejido intestinal en el inicio del intestino grueso.
  4. Aislar las placas de Peyer mediante la búsqueda de 1-3 mm parches aproximadamente circulares de tejido opaco a lo largo del intestino delgado (Figura 7). El uso de los LIC de disección curvassores, cortar la cúpula de la placa de Peyer, dejando márgenes para asegurar que se recoge ninguna de la lámina propia de los alrededores.
    NOTA: La mayoría de los ratones tienen entre 4-8 parches fácilmente visibles de Peyer. Realizar el procedimiento en un área con iluminación cenital directa aumentará la facilidad con la que las placas de Peyer se pueden visualizar.
  5. Recoger el diseccionado las placas de Peyer en completo Iscove modificado medios (IMDM) de Dulbecco.
    NOTA: Es importante utilizar una técnica estéril e incluyen antibióticos en los medios de recogida con el fin de evitar la contaminación bacteriana gastrointestinal de placas de levadura.
  6. parches de Peyer cepa a través de un filtro de células de 40 micras para eliminar los medios de recogida. parches de Peyer de lavado con IMDM completo fresco sobre un tubo de 50 ml y utilizar un émbolo de una jeringa de 1 ml para romper suavemente hacia arriba las placas de Peyer. Precipitar las células por centrifugación tensas a 1.800 rpm durante 7 min. células sobrenadante y resuspender en Aspirarun volumen final de aproximadamente 100 l.
  7. Aplicar las células de levadura tensas en medios selectivos y utilizar un difusor de placa para distribuir uniformemente las células. Envolver bordes de la placa en Parafilm y se incuban las placas al revés a 30 ° C durante 2 días para permitir el crecimiento de cualquier levadura viable recuperado de las placas de Peyer murino.
    NOTA: Estudios adicionales después de la recuperación de la levadura de las placas de Peyer son necesarios para confirmar que las cepas son capaces de entregar proteína heteróloga correctamente plegada a estos tejidos inmunes. Como se describe en 2.1.14, tales métodos pueden incluir inmunotransferencia, ELISA, o microscopía de fluorescencia para detectar las proteínas fluorescentes, tales como GFP 2,40.

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Resultados

Generación de una curva de supervivencia después de la irradiación UV requiere placas de células de levadura diluidas de tal manera que unidades formadoras de colonias (CFU) distintos son capaces de formar. Cada muestra de 500 l recogida como se ha descrito anteriormente contiene aproximadamente 5 x 10 6 células; Sin embargo, más de 100 colonias por placa son difíciles de distinguir con precisión. Revestimiento de la muestra sin diluir así como de serie diluciones 1:10 de las ...

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Discusión

Juntos, los protocolos en este documento se describen los pasos esenciales necesarios para el desarrollo y prueba de cepas de levadura auxotróficos probióticos para la entrega de la proteína terapéutica heteróloga al intestino. Esta manipulación y el ensayo de levadura viva recombinante requiere técnicas y recursos con los que cualquier laboratorio individuo puede no estar familiarizado actualmente. Por lo tanto, a pesar de numerosos estudios anteriores han descrito los protocolos anteriores para múltiples cepas de leva...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores reconocen la financiación a través del Centro Infantil de Inmunología y Vacunas y un premio Innovador Nueva NIH (1DP2AI112242-01) adjudicado a Tracey J. Cordero. Los autores también agradecen a Natalya P. Degtyareva por la generosa contribución de rad1 S. cerevisiae.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Espectrofotómetro SmartSpec 3000BioRad170-2501Ejemplo de espectrofotómetro para determinar la concentración celular y el diámetro exterior 600 de cultivos de levadura
New Brunswick Tambor de rodillosEppendorfM1053-4004Ejemplo de tambor de rodillos para la incubación de cultivos de levadura
UV Stratalinker 2400Stratagene400075-03Ejemplo de stratalinker
Contador de colonias Stuart SC6PLUS11983044FisherScientific Plate soporte con registros de aumento recuento de colonias al detectar la presión de la pluma
Contador de colonias Scienceware F378620002Bel-Art Scienceware Bolígrafo demano para contadores de colonias
Réplica de dispositivo de recubrimientoFisherbrand09-718-1Ejemplo de réplica de soporte y almohadillas de recubrimiento 
Cuadrados de terciopeloFisherbrand09-718-2
Esparcidores de células estériles en forma de L Fisherbrand14665230
Ácido desoxirribonucleico, monocatenario de testículos de salmónSigma-AldrichD7656-1MLEjemplo de ADN portador para levadura Transformación de LiOAc
Agujas de sonda nasogástricaBraintree ScientificN-PK  002Para ratones de 15 a 20 g, la aguja sugerida es una aguja de sonda nasogástrica reutilizable de calibre 22 (1,25 mm), recta y de 1 pulgada de largo. Para ratones que pesen más de 20   g, se pueden usar agujas de sonda nasogástrica rectas o curvas de calibre 20 o más grandes
ml estéril de punta deslizante jeringa de tuberculina desechableBecton DickinsonBD 309659
Pinzas romas como Electrónica Microscopy Sciences Punta dentada de 7" (178 mm), pinzas de agarre amplioMicroscopía Electrónica77937-28Ejemplo de pinzas romas necesarias para la disección 
Tijeras de disección rectas y curvasElectrónica Microscopy Sciences72966-02 y 72966-03Ejemplos de tijeras necesarias para la disección
IMDMLife technologies12440053
1 Ciencias de la

Referencias

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