Columna posterior derivatización usando la reacción en columnas de flujo Cromatografía Líquida de Alta

Resumen

Se presenta un protocolo para el uso de columnas de cromatografía líquida de alto rendimiento de flujo de reacción para métodos que emplean derivatización posterior a la columna (PCD).

Resumen

Se presenta un protocolo para el uso de columnas de cromatografía líquida de alta resolución de flujo de reacción para métodos que emplean derivatización posterior a la columna (PCD). Una dificultad importante en la adaptación de PCD a los sistemas y columnas modernos de HPLC es la necesidad de bobinas de reacción de gran volumen que permitan la mezcla de reactivos y luego la reacción de derivatización. Este gran volumen muerto posterior a la columna conduce a un ensanchamiento de la banda, lo que resulta en una pérdida de la eficiencia de separación observada y, de hecho, en la detección de la sensibilidad. En la derivatización posterior a la columna de flujo de reacción (RF-PCD), los reactivos de derivatización se bombean contra el flujo de la fase móvil a uno o dos de los puertos exteriores de la columna de flujo de reacción, donde se mezclan con el efluente de la columna dentro de una frita alojada dentro del accesorio del extremo de la columna. Esta técnica permite una mezcla más eficiente del efluente de la columna y los reactivos de derivatización, lo que significa que el volumen de los bucles de reacción se puede minimizar o incluso eliminar por completo. Se ha encontrado que los métodos RF-PCD funcionan mejor que los métodos convencionales de PCD en términos de eficiencia de separación observada y relación señal-ruido. Otra ventaja de las técnicas de RF-PCD es la capacidad de monitorear el efluente proveniente del puerto central en su estado no derivatizado. RF-PCD se ha probado actualmente en un rango relativamente pequeño de reacciones posteriores a la columna, sin embargo, actualmente no hay razón para sugerir que RF-PCD no pueda adaptarse a cualquier reacción de derivatización posterior a la columna de uno o dos componentes existentes (siempre que se agreguen ambos reactivos al mismo tiempo).

Introducción

cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) acoplada con la columna posterior derivatización (DCP) es una poderosa herramienta que es útil para resolver una serie de problemas en el laboratorio de análisis. Se puede utilizar para detectar compuestos que son de otro modo indetectable con la suite de detectores disponibles ^1,2, aumentar la señal del analito diana, lo que permite límites inferiores de detección y cuantificación ^3-5 o selectivamente derivatizar un analito diana a fin de evitar ⁶ efectos de la matriz. Reacciones de PCD comúnmente usados ​​incluyen la reacción de aminas, tales como aminoácidos, con orto-phthaladehyde

Protocolo

Precaución: Por favor, consulte las hojas de datos de seguridad del material (MSDS) para todos los materiales y reactivos antes de su uso (es decir, Pedidos de metanol). Asegurar el uso de todas las prácticas apropiadas de seguridad al manipular disolventes y cromatografía líquida de eluyente alta resolución (HPLC). Asegurar el uso apropiado de los controles de ingeniería de HPLC, balanza analítica y un detector de instrumentación, y asegurar el uso de equipo de protección personal (gafas de seguridad, guantes, bata de laboratorio, pantalones largos y zapatos cerrados).

Nota: Este protocolo describe 3 métodos de flujo de reacción de derivatización post-columna (RF-PCD) t....

Resultados

El primer método PCD que fue adaptado para su uso por RF-PCD fue la derivación de antioxidantes utilizando el radical 2,2-difenil-1-picrylhydrazil (DPPH ^{•) 24.} Esta reacción se introdujo por Koleva et al. ²⁵ y se ha utilizado ampliamente desde entonces. La detección se basa en la decoloración del DPPH ^• radical en presencia de especies reactivas del oxígeno, por lo tanto, la presencia de los resultados de los antioxidantes en una caída en la absorbancia observado. El .......

Discusión

RF-PCD permite la mezcla eficiente del reactivo de derivatización con el efluente después de la columna de HPLC sin el uso de bobinas de reacción, reduciendo al mínimo los efectos de ensanchamiento de las bandas y la mejora de rendimiento de la separación. métodos RF-PCD también han demostrado mejoras en la respuesta de la señal con respecto al método de detección. Camenzuli et al. ²⁸ fue el primero en reportar el uso de columnas de flujo de reacción con DPPH ^• para la detección de ROS en .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Instrumento de HPLC	Agilent	serie 1290 Bomba
para el sistema de derivatización	Shimadzu	LC-20A
Columna			Tubo de
PEEK	Sigma Aldrich	Z227307
Tapones de			Provistos de cortador
tubo de PEEK	de columna Sigma Balanza
Balanza			analítica de 4 puntos
Cronómetro			Equipo no científico
Viales de recolección de			Cualquier vial pequeño con un fondo plano servirá, p. ej., viales de HPLC Viales
de			Dependerá del instrumento utilizado
Recipientes para fase móvil y solución(es) de derivatizaciónSigma	Aldrich Z232211
Cristalería			Matraces volumétricos, pipetas, etc. La cantidad y los volúmenes dependerán del método de preparación de la muestra.
Metanol	Sigma Aldrich	34860
DPPH	Sigma Aldrich	D9132
Acetato de amonio	Sigma Aldrich	17836
Amoníaco	Sigma Aldrich		320145 Acetonitrilo corrosivo
	Sigma Aldrich	34998
Fluorescamina	Sigma Aldrich	F9015
4- aminoantipireno	Acros Organics BVBA AC103151000
Ferricianuro de potasio	AnalaR	B10204-30

(s) adicional(es) de HPLC RF no comercial columna de de báscula analítica Z290882 Aldrich eluyentes HPLC de laboratorio general