El seguimiento y cuantificación de los procesos de desarrollo en<em&gt; C. elegans</em&gt; Uso de las herramientas de código abierto

Resumen

Aquí se muestra cómo rastrear y cuantificar los procesos de desarrollo en C. elegans. Los métodos presentados se basan en herramientas de código abierto que se pueden implementar fácilmente. Se demuestra cómo reconstruir modelos 3D de forma de células, cómo rastrear manualmente las estructuras subcelulares y cómo analizar el flujo contráctil cortical.

Resumen

Cuantitativamente capturar los procesos de desarrollo es crucial para derivar modelos mecanicistas y clave para identificar y describir los fenotipos mutantes. Aquí se presentan los protocolos para la preparación de los embriones y de adultos C. elegans animales para microscopía de lapso de tiempo corto y largo plazo y los métodos para el seguimiento y cuantificación de los procesos de desarrollo. Los métodos presentados se basan en C. cepas disponibles desde el Caenorhabditis Centro de Genética y en software de código abierto elegans que se pueden implementar fácilmente en cualquier laboratorio independiente del sistema de microscopía utilizado. Una reconstrucción de un modelo de células en forma de 3D usando el IMOD software de modelado, seguimiento manual de las estructuras subcelulares marcadas con fluorescencia utilizando el polivalente programa de análisis de imágenes Endrov, y un análisis de flujo contráctil cortical usando PIVlab (Resuelta en el Tiempo Digital por imágenes de partículas Velocimetría Herramienta para MATLAB) se muestran. Se discute cómo estos métodos también se pueden implementar to cuantitativamente capturar otros procesos de desarrollo en diferentes modelos, por ejemplo, el seguimiento de la célula y del linaje de rastreo, seguimiento del flujo de vesículas.

Introducción

Con las mejoras constantes de las proteínas fluorescentes, la ingeniería del genoma, microscopía óptica y soft y hardware, ahora es posible grabar el desarrollo de muchos organismos modelo con resolución espacio-temporal sin precedentes. Esto permite a los investigadores hacen preguntas que no podían ser abordadas con anterioridad o para revisitar los procesos de desarrollo conocidos con el fin de buscar los aspectos pasados ​​por alto. Este progreso ha despertado el campo de la biología del desarrollo cuantitativo, cuyo objetivo es la transformación de los modelos cualitativos e informales en los modelos cuantitativos mediante mediciones exhaustivas y análisis estad....

Protocolo

1. Preparación de C. elegans embriones para Microscopía Time-lapse usando Microbeads

1. Transferencia gusanos adultos grávidas mediante el uso de un pick gusano (alambre de platino) en una gota de tampón M9 y limpiar las bacterias por primera agitando vigorosamente y luego transferir cada gusano a una caída adyacente de M9 utilizando un latigazo del ojo montado en un / punta de la pipeta selección del diente o utilizar un capilar de vidrio con punta.
2. Se diluye la dispersión que contiene las 20 micras perlas de poliestireno de diámetro 10 veces en tampón de M9 (1 L de tampón M9 contiene 3 g KH ₂ PO _4, 6 g de Na ₂

Resultados

Mediante el uso de protocolos de 2, 3 y 4, time-lapse de las gónadas de tipo salvaje C. elegans adultos se realiza (OD58 cepa (UNC-119 (ed3) III; ltIs38 [PAA1; pastel-1 :: GFP :: PH (PLC1delta1) + UNC-119 (+)]), que expresa un marcador de membrana de un promotor de la línea germinal ). Centrándose en el turno de la gónada, un modelo 3D de las células germinales se genera a partir de los datos de microscopía (Figura 2). Este modelo permite analizar los cambios en el tamaño celular, mientras que .......

Discusión

A través de seguimiento de objetos en el desarrollo, en particular, de seguimiento nuclear, ha sido posible dilucidar los mecanismos centrales de modelado de C. elegans embriogénesis ^1,23,24. Ampliando esta estrategia para un mayor rendimiento, ha sido recientemente posible descubrir reglas de modelado adicionales y proponer un método de cómo deducir patrones gobierna de novo ^10. Para muchos mutantes, sin embargo, los defectos de modelado precisas son todavía desconocidos. Los mét.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Microscopio estereoscópico	Motic/VWR	OT4005S	Microscopio estereoscópico para disección y montaje
Microesferas de poliestireno Polybeads,	Policiencias	18329	Montaje de embriones
20 µ m
Microesferas de poliestireno de perlas de polietileno,	Polysciences	876	Montaje de animales adultos
0.1 y micro; m
Portaobjetos de microscopio	VWR	631-0902	Montaje para animales adultos
Cubreobjetos 18x18 mm	VWR	631-1331	Montaje para embriones/adultos
Cubreobjetos 24x60 mm	VWR	631-1339	Montaje de embriones
Bisturí	VWR	233-5455	Disección de embriones
Tubos de silicona	VWR	228-1501	Tubo para pipeta bucal
30 mm Filtro de membrana de PTFE	NeoLab	Jul-01	Filtro para pipeta bucal
Tubos capilares	VWR	621-0003 Punta de	pipeta para pipeta bucal
Vaselina		Roth E746.1	Montaje para embriones/adultos
Agar	Roth	5210.5	Montaje para animales adultos
Potasio-di-hidrógenofosfato	Roth	Tampón P018.2	M9
Di-sodio-hidrógenofosfato	Roth	Tampón P030.2	M9
Cloruro de sodio	Roth	3957.1	Tampón M9
VisiScope Disco giratorio Sistema confocal	Sistemas Visitron	n/a	Microscopía confocal