Artículo de método

Leche Colección de la rata utilizando tubos capilares y Estimación del contenido de grasa de la leche por Creamatocrit

DOI:

10.3791/53476

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16 de diciembre de 2015

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1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Cumming School of Medicine, University of Calgary, 2Faculty of Kinesiology, University of Calgary

En este artículo

Resumen

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La leche es una fuente primaria de nutrición para el recién nacido. El análisis de los componentes de la leche puede proporcionar información sobre los factores maternos que afectan la salud de la descendencia. Este protocolo describe un método manual de recolección de muestras de leche de la rata lactante, que luego se pueden utilizar para análisis posteriores.

Resumen

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La leche, como única fuente de nutrición para el mamífero recién nacido, proporciona los nutrientes y la energía necesarios para el crecimiento y desarrollo de la descendencia. También contiene una gran cantidad de compuestos bioactivos que afectan en gran medida el desarrollo del neonato. El análisis de los componentes de la leche ayudará a dilucidar los factores clave que vinculan el metabolismo y la salud materna con el crecimiento y desarrollo de la descendencia. La rata de laboratorio representa un organismo modelo popular para los estudios maternos, y la leche de rata se puede utilizar para examinar el efecto de diversas intervenciones fisiológicas, nutricionales y farmacológicas maternas en los componentes de la leche, que luego pueden afectar la salud de la descendencia. Aquí se describe un método simple de recolección manual de leche de la rata lactante que puede ser realizado por un solo investigador, no requiere equipo especializado de vacío o succión, y proporciona suficiente leche para el análisis posterior. También se presenta un método para estimar el contenido de grasa de la leche midiendo el porcentaje de nata dentro de la muestra de leche, conocido como creamatocrito. En última instancia, estos métodos pueden utilizarse para aumentar la comprensión de la salud maternoinfantil y para dilucidar los factores maternos que intervienen en el crecimiento y el desarrollo adecuados de la descendencia.

Introducción

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La leche es la única fuente de nutrición para los mamíferos recién nacidos, el suministro de energía y nutrientes para el crecimiento infantil y desarrollo 1,2. Mientras que la leche se compone principalmente de células, lípidos, y proteínas 1, también contiene una gran cantidad de compuestos bioactivos que modulan el desarrollo primeros años de vida de la descendencia incluyendo enzimas, carbohidratos, hormonas, anticuerpos, factores de crecimiento, citoquinas, exosomas, microvesículas, y pequeños RNAs tales como microARN 1,2. El papel fundamental de la leche materna en el establecimiento de inmune y la salud intestinal 3 crías, junto con la evidencia de que los lactantes amamantados son menos susceptibles a la enfermedad 2, pone de relieve la importancia de identificar los componentes de la leche asociados a los procesos de enfermedad en la vida temprana y los mecanismos moleculares implicados en sus acciones. La rata en desarrollo es un modelo popular para investigar el efecto de diferentes nutricional, fisiológica, y las intervenciones químicas en principiosdesarrollo -life 4. El análisis de la leche de rata puede, por tanto, proporcionar nuevos visión de la salud materna y la descendencia.

Los avances científicos actuales ofrecen ahora el aumento de oportunidades para investigaciones en profundidad de los efectos de los componentes de la leche específicos sobre la salud y la enfermedad. Por ejemplo, la secuencia de los perfiles de bacterias de la leche ha dilucidado su papel en la colonización intestinal temprana del intestino del bebé 5, el análisis de espectrometría de masas de los oligosacáridos de la leche han proporcionado información sobre la alteración de los perfiles de oligosacáridos de la leche a través de la dieta materna 6, y profundo secuenciación de microARN secretada en los glóbulos de grasa de la leche materna pone de manifiesto posibles funciones en la transcripción de genes, el metabolismo y la función inmune 7.

Modelos de ratas representan uno de los organismos modelo más populares utilizados en los estudios maternos 8,9. Una ventaja es sus períodos de gestación y lactancia cortas, solamente approximat duraderosely 21 días cada uno; Por lo tanto, el tiempo total desde el comienzo del embarazo para la lactancia representa un corto período de tiempo en el que los datos valiosos pueden ser generados. El mayor tamaño de las ratas en comparación con ratones, en el contexto de recogida de leche, puede proporcionar una ventaja significativa con respecto al volumen de leche y la facilidad de recolección de la leche; la producción de leche en el ratón, por ejemplo, parece ser depende del peso corporal total con los ratones más pesados ​​que producen más leche 10.

Aquí, se proporciona una descripción general para la recolección manual de la leche de ratas lactantes. Este protocolo requiere un mínimo de equipo, es no invasivo, de bajo costo, y se puede utilizar para recoger volúmenes adecuados de la leche para análisis posteriores aguas abajo. En resumen, la presa se anestesia con isoflurano, la bajada de leche es estimulada por la oxitocina, y la leche se recoge en tubos capilares a través de la extracción manual de la leche. Por último, como dos componentes principales de la leche son grasas y proteínas, una breve descriptiose presenta n de estimar el contenido de grasa de la leche mediante mediciones creamatocrit 11 y cuantificación de concentración de proteína total utilizando un ensayo de proteína estándar.

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Protocolo

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Este protocolo fue aprobado por la Universidad de Comité de Cuidado de Animales de Calgary y conforme a la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

1. Separe la presa de Offspring

  1. Separar la presa de su descendencia por un mínimo de 5 minutos antes de ordeño 12.
    NOTA: La presa puede ser ordeñada hasta 5-6 horas después de la separación 1,6,13, sin embargo períodos de separación de más de 4 horas pueden alterar la composición de la leche 14. Mientras que el tiempo de separación no parece afectar el volumen de recogida de leche 12, se aconseja que un tiempo de separación consistente mantenerse durante todo el estudio. Composición de la leche pueden cambiar durante la lactancia 15, por lo tanto, se debe hacer intentos para mantener el día de la recogida de leche consistente. Se sugiere la producción máxima de leche que se producen en días de lactancia 14 12.
  2. Utilizando una cámara de calentamiento, asegúrese de que los cachorros son capaces de mantener temperatu de la carrocería adecuadare sin la presencia de su madre durante la duración del procedimiento de ordeño.
    NOTA: En el estudio se presenta a continuación, el ordeño se realizó en el destete, cuando las presas eran aproximadamente 22 semanas de edad y de las crías de 21 días de edad, se utilizó por lo tanto ninguna cámara de calentamiento.

2. Instalación y Preparación

  1. Recoger todos los materiales necesarios para el procedimiento de ordeño.
    NOTA: Todos los materiales se pueden encontrar en la tabla de materiales y equipos.
  2. Coloque una almohadilla térmica en el banco donde ordeño se llevará a cabo y para abarcar la almohadilla con un banco absorbente bajo-pad.
  3. Configurar el sistema anestésico. Asegúrese de que el sistema tiene oxígeno e isoflurano antes de comenzar suficiente. Coloque la máscara de anestesia que se utilizará para la inducción de la anestesia inicial a la máquina. Coloque la máscara que se utilizará para el mantenimiento de la anestesia cercana si es diferente de la máscara de anestesia inicial.
  4. Adjunte una aguja de 25 G a una jeringa de 1 ml de oxitocinainyección utilizando una técnica aséptica.
  5. Encienda la almohadilla térmica de modo que se mantiene la temperatura del cuerpo de la madre durante el procedimiento de ordeño. NOTA: Controle la temperatura de la almohadilla térmica para asegurar la almohadilla no se convierta en demasiado caliente y causar quemaduras. Alternativamente, utilizar una fuente de calor, tal como una mesa quirúrgica calentada, que se puede ajustar a una temperatura específica.

3. Anestesiar la presa de Uso isoflurano

  1. Abra el tanque de oxígeno y gire el flujo a 1 L (1000 cc) por min. Encienda el flujo de isoflurano y se puso a 5%. ATENCIÓN: Evitar la inhalación directa de anestesia y evitar la acumulación de vapores anestésicos.
  2. Anestesiar la presa.
  3. Cambiar a la máscara de mantenimiento, si es necesario, la colocación de la supina presa en la plataforma de banca absorbente. Confirme anestesia por la falta de reflejo de pedal.
  4. Reducir el flujo de isoflurano al 2-3% para el mantenimiento de la anestesia. Monitorear continuamente presa durante todo el procedimiento para asegurarse depression de la respiración no se produce. NOTA: Una vez bajo anestesia, los ojos de la presa deben protegerse utilizando un lubricante ocular estéril para evitar que los ojos se sequen o se raye.

4. La oxitocina Inyección

  1. Asegúrese de que la oxitocina (20 unidades USP / ml) no ha pasado su fecha de caducidad. Desinfectar el vial de oxitocina con un alcohol estéril limpie / almohadilla de limpieza de alcohol.
  2. Utilizando una técnica aséptica, elaborar 2 UI (0,1 ml) de la oxitocina en la jeringa. Use una aguja y una jeringa para cada presa que se ordeñaba.
    NOTA: La oxitocina dosis varían generalmente de inyecciones únicas de 1 a 5 UI 1,6,12,16. Alternativamente, una dosis de 4 UI / kg de peso corporal se puede utilizar 12. Una sola dosis de 2 UI puede repetirse una vez si se encuentra dificultad de ordeño.
  3. Inyectar la oxitocina por vía intraperitoneal. Inserte la aguja en el cuadrante inferior derecho del abdomen con la aguja apuntando hacia la cabeza, en un ángulode 15-30 °, aproximadamente 0,5 cm de profundidad.
  4. Tire hacia atrás el émbolo para asegurarse de presión negativa antes de la inyección. Si cualquier líquido (sangre, orina, contenido intestinal, etc.) se aspira con la jeringa, retire la aguja e intentar la inyección con una aguja y jeringa. Si hay líquido se aspira inyectar la oxitocina y desechar la aguja y jeringa inmediatamente en un contenedor de riesgo biológico.
  5. Espere aproximadamente 5 a 15 minutos para la oxitocina para estimular la bajada de la leche.

5. Preparación de Sitios de ordeño

  1. Elija los sitios / los pezones de la que se obtuvo leche. La leche puede ser recogida desde cualquier tetina 12.
  2. Retire suavemente la piel alrededor de los pezones para ser ordeñadas con los trimmers, como la piel puede causar dificultad en la recolección de la muestra debido a la absorción de la leche. Sea amable - la piel alrededor de los pezones es extremadamente sensible y puede estar seca y, como tal, es susceptible a los rasguños y las lágrimas.
  3. La esterilización de la i tetinas no es necesario, pero opcionalmente, limpiar el pezón con agua tibia después de retirar la piel. Preparar al menos dos sitios como más de un sitio puede ser necesaria para la recogida de leche.
    NOTA: Si el análisis de la leche incluye perfiles microbiana, el área del pezón puede requerir esterilización con yodo 5.

6. Leche Colección

  1. Apriete suavemente la base del pezón, expulsar manualmente la leche para la colección.
    NOTA: Si el análisis de la leche incluye perfiles microbiana, las primeras gotas de leche deben ser desechados.
  2. Recoger las gotas de leche en un tubo capilar, llenando el tubo capilar. Tubos capilares que se adaptan a volúmenes más grandes (por ejemplo, 50 l) facilitar el proceso.
    NOTA: Si se encuentra dificultad en la recogida de la leche, una segunda dosis de oxitocina puede ser administrado. Se recomienda que la dosis sea superior a 4 UI totales.
  3. Prescindir de la leche desde el tubo capilar en un tubo de microcentrífuga estériltocando el extremo del tubo que se utilizó para extraer la leche de la teta a un lado del tubo de microcentrífuga - observar la leche que se extrae del tubo capilar a través de la acción capilar.
    NOTA: 'Blow out' de la leche que no se introduce en el tubo usando una aguja de 18 G unida a una jeringa de 1 ml.
  4. Monitorear continuamente la presa para detectar signos de dolor o depresión respiratoria y ajustar el flujo de isoflurano en consecuencia.
  5. Continuar para recoger la leche como se describe en esta sección hasta suficiente leche se ha recogido para el análisis de la leche elegido. Para la determinación de la concentración creamatocrit y la proteína se describe a continuación, recoger 0,25 ml de leche.
    NOTA: Utilice un sitio de ordeño diferente si bajada de la leche disminuye o el sitio elegido no expulsa la leche suficiente. Un máximo de aproximadamente 2,5 ml de leche por animal puede ser recogida 17, o hasta 0,5 ml por pezón. Los autores recomiendan que el tiempo total bajo anestesia se limitará a aproximadamente 45 a 60 minutos, or 45 min de ordeño.
  6. Recogida de la leche en un tubo microhematocrito para la medición creamatocrit partir de muestras de leche fresca, y sellar el extremo del tubo con sellador de arcilla. Etiquetar el tubo microhematocrito con el ID de presa y almacenar la muestra de leche en posición vertical.
  7. Cuando el ordeño es completa, apague el flujo de isoflurano y oxígeno. Retire la máscara de la presa y continuar monitoreando la presa hasta que despierto. Se recomienda que si no es plenamente consciente, la presa se debe colocar en una almohadilla absorbente banco durante el período de recuperación, en lugar de hacerlo directamente sobre la ropa de cama de la jaula, para evitar que la ropa de cama de ser aspirados o rascarse los ojos de la presa durante la recuperación.
    NOTA: No deje desatendida la presa hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener recumbancy esternal.
  8. Si no se requieren nuevos análisis, congelar la leche a -80 ° C. Otros han sugerido que la leche se puede almacenar durante un máximo de 3 horas a 4 ° C o 5 meses a -20 ° C 18.

7. Medición Creamatocrit

  1. Estimar el contenido de grasa en la leche mediante el cálculo del creamatocrit leche (el porcentaje de la crema en la muestra de leche) 19.
    NOTA: Las mediciones con la leche humana han demostrado que la leche ya sea fresco o congelado puede ser usado para una medición creamatocrit, sin embargo leche fresca es más altamente correlacionado (r = 0.92 r = 0,90 frente) con la concentración de lípidos 11. El uso de leche fresca o congelada para mediciones creamatocrit debe mantenerse coherente en el estudio, como la leche descongelada se asocia con una pequeña disminución en los valores creamatocrit 11.
  2. Para la leche fresca, se recoge una muestra de leche de la teta en un tubo microhematocrito; rellenar al menos ¾ de su capacidad (aproximadamente 15-20 l). Alternativamente, dibujar leche fresca de la muestra recogida en el tubo capilar después de mezclar bien. Selle el extremo con sellador de arcilla.
  3. Coloque el tubo capilar en el spinner hematocrito, con elextremo sellado apuntando hacia el exterior, asegurando la centrífuga es equilibrada.
  4. Comience el spin hematocrito (120 segundos a 13.700 xg).
    NOTA: El tiempo de la vuelta o la velocidad pueden variar dependiendo del modelo de centrífuga utilizada.
  5. Retire el tubo de la centrífuga después de la vuelta es completa y realizar las mediciones para calcular el creamatocrit. Observe la separación de la muestra en una capa de crema y una capa transparente.
  6. Medir y registrar la longitud total de fluido en el tubo y la longitud de la grasa (crema) capa usando pinzas o una regla.
    NOTA: El creamatocrit se expresa como el porcentaje de la capa de crema dentro de la muestra de la leche 19, calculado como (longitud de capa de crema / longitud total de la columna de la leche) x 100 (Figura 1A). Calcular los valores de concentración y la energía de grasa de la medición creamatocrit como sigue: concentración de grasa (g / L) = (creamatocrit (%) - 0.59) /0.146 (Figura 1B) 19; Valor energético (kcAl / L) = 290 + (66,8 * creamatocrit (%) (Figura 1C) 19.

8. Proteína Concentración Determinación

  1. El uso de albúmina de suero bovino como un estándar de proteína, determinar la concentración total de proteína de la leche utilizando un ensayo estándar de la proteína, tal como una proteína ensayo de Lowry 6.
    NOTA: La dilución de la leche puede ser necesario para las mediciones de proteína de leche que caigan dentro de la curva estándar del ensayo.

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Resultados

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La leche se recogió como se describe en el destete de las presas Wistar (aproximadamente 22 semanas de edad, pesando 350 a 400 g) que consumió un control (AIN-93G, n = 5), alta en proteínas (40% de caseína p / p, n = 5) o alto contenido de fibra prebiótica (21,6% peso / peso, 1: 1 relación de oligofructosa e inulina, n = 4) dieta a lo largo embarazo y la lactancia. La dosis de oxitocina fue 2 IU. La leche se recogió usando tubos capilares, y un tubo se centrifugó utilizando una centrifugadora de hematocrito para determi...

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Discusión

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Las investigaciones sobre los componentes de la leche materna han aumentado a medida que aumenta el interés en la investigación del desarrollo de la vida temprana. Como única fuente de nutrición durante el período neonatal, los compuestos bioactivos de la leche son esenciales para el crecimiento y desarrollo ideales, especialmente en el contexto de la salud intestinal e inmunológica3. El método presentado aquí es un método simple y no invasivo para recolectar leche de la rata lactante en cantidades suficientes...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos de intereses a revelar. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con protocolos CCAC aprobado.

Agradecimientos

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Estos trabajos fueron apoyados a través de becas de Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá (RGPIN 238382 a 2.011) y los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (MOP115076). Heather Paul recibió el apoyo de una Beca de Postgrado de Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá y una beca Health Solutions Alberta innova. Megan Hallam fue apoyado por una de Ciencias Naturales e Ingeniería del Consejo de Investigación de Postgrado de Becas, una beca de Frederick Banting y Charles Best Graduate Canadá, y el Premio a la Infancia de Alberta Instituto de Investigación del Hospital de Capacitación en Genética, Desarrollo Infantil y Salud.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Equipment - Ordeño
ml JeringasBD-Canada309602
25 GBD-Canada 305122
Agujas 18 GBD-Canada305196
50 μ l Microdispensador de tubos capilaresFisher Scientific21-169D
Oxitocina (20 unidades USP/ml)Bimeda-MTC1OXY015
PPC Vet Anestésico de inhalación de isoflurano, 250 mlFresenius KabiM60302Utilizado por encargo de un veterinario
Almohadilla de preparación con alcohol estérilDukal853
Almohadilla de banco absorbenteVWR82020-845
Maxi-Therm Manta de hiper/hipotermiaCincinnati Sub-Zero274
Máquina de anestesia para roedores con vaporizadorBenson Medical Industries Inc.Sujeto a las necesidades individuales del laboratorio
Mascarillas para animalesBenson Medical Industries Inc.50100/50102
Tubos de microcentrífugaAxygenMCT-060-C
Recortadora
Equipo - Creamatocrit
StatSpin SafeCrit Tubos de microhematocrito de plástico (sin tratar)Fisher Scientific22-274-914
Critoseal Bandeja de sellador de tubos capilaresVWR470161-478
Centrífuga de microhematocrito StatSpin CritSpinBeckman Coulter, IncX00-004999-001
1 profesional ChroMini

Referencias

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