La cuantificación de Natación de peces comportamiento en respuesta a la exposición aguda acuosa de cobre usando asistida por ordenador y vídeo digital Análisis de Imágenes

Resumen

La medición de los impactos de los contaminantes ambientales en el comportamiento de los peces es a menudo subjetiva y desafiando particularmente cuando se trata de efectos sub-letales. Se describen métodos que incluyen la tecnología de video para cuantificar el comportamiento natatorio de la vida temprana etapa de esturión blanco (Acipenser transmontanus) durante y después de 96 horas la exposición aguda a varias concentraciones de cobre.

Resumen

Las respuestas conductuales de los organismos acuáticos a los contaminantes ambientales pueden ser precursoras de otros efectos como la supervivencia, el crecimiento o la reproducción. Sin embargo, estas respuestas pueden ser sutiles y la medición puede ser un desafío. Utilizando esturión blanco juvenil (Acipenser transmontanus) con exposiciones al cobre, este artículo ilustra las técnicas utilizadas para cuantificar las respuestas conductuales mediante el análisis de imágenes digitales y video asistido por computadora. En estudios previos, se observaron graves deficiencias en el comportamiento de natación entre el esturión blanco en las primeras etapas de su vida durante exposiciones agudas y crónicas al cobre. El comportamiento del esturión se deterioró rápidamente y hasta el punto de que la supervivencia en el campo se vería comprometida, ya que los peces serían arrastrados río abajo o fácilmente capturados por los depredadores. Los objetivos de esta investigación fueron ilustrar los protocolos para cuantificar la actividad de natación durante una serie de exposiciones agudas al cobre para determinar el tiempo de efecto durante el desarrollo de las primeras etapas de la vida, y comprender la importancia de estas respuestas en relación con la supervivencia de estos peces vulnerables en las primeras etapas de la vida. Dado que la mortalidad se encuentra en un continuo de tiempo, determinar cuándo el cobre afecta por primera vez a la capacidad de natación nos ayuda a comprender las implicaciones de los efectos a nivel poblacional. Las técnicas utilizadas son fácilmente adaptables a diseños experimentales con otros organismos y estresores.

Introducción

La comprensión de cómo la exposición a contaminantes puede afectar el comportamiento es a veces muy difícil y subjetiva. El comportamiento se define normalmente como una serie de actividades abiertas y observables, de todo el cuerpo que operan a través del sistema nervioso central y permiten a un organismo para sobrevivir, crecer y reproducirse. Los cambios en el comportamiento debido a la exposición a un tóxico son algunos de los indicadores más sensibles de estrés ambiental frecuencia entre 10-100 veces más sensible en comparación con la supervivencia ^1. La mayoría de estos estudios examinaron la actividad de la natación, la ventilación y el comportamiento de alimentación de los peces ^2,3,4. Natación actividad es el punto final subletal más utilizado en la determinación de un cambio de comportamiento en respuesta a un contaminante en las pruebas de toxicidad ^5. las variables de natación incluyen la frecuencia y duración del movimiento, la velocidad y la distancia recorrida, la frecuencia y el ángulo de vueltas, posición en la columna de agua y el patrón de natación. La natación es la actividaduna medida eficaz de comportamiento natatorio la hora de evaluar la sensibilidad a un agente tóxico en base a los criterios propuestos en el capítulo 9 por Rand ⁶ en el libro Fundamentos de Aquatic Toxicology.

En este trabajo se presenta un estudio toxicológico como un ejemplo de cómo la toxicidad de cobre a primeras fases de vida del esturión blanco (Acipenser transmontanus) en diversas etapas de desarrollo temprano en el agua de sólo exposición relativa de esturión se evaluó el comportamiento de natación e ilustra métodos para cuantificar la natación comportamiento.

En estudios anteriores, las respuestas de comportamiento adversos fueron evidentes con aparición temprana durante los primeros días de la exposición aguda y crónica al cobre y se hicieron progresivamente más severos con el tiempo de exposición y la concentración ^7.8.9. La magnitud y el momento de la aparición de estas respuestas de comportamiento es probable suficiente para limitar la supervivencia a largo plazo y por lo tanto son de interés dadas las implicaciones para recruiinsuficiencia tamento ^10. Con el fin de interpretar con precisión la importancia de esta sensibilidad a los métodos y los procedimientos de exposición de metal se han desarrollado para la cuantificación de la evolución en el tiempo y el grado de alteraciones del comportamiento en relación con las concentraciones de cobre.

protocolos de ensayo para la función y el desarrollo del comportamiento se establecieron mediante el análisis de muestras de vídeo de arriba de esturión en cámaras de exposición. Las muestras de vídeo proporcionan una evaluación cualitativa del desarrollo y la función de los tratamientos de cobre a lo largo del período de exposición. Se evaluó la actividad de la conducta y la búsqueda de refugio durante las exposiciones a concentraciones de cobre acuosas para determinar el momento de efectuar y caracterizar la secuencia temporal de deterioro que afecta a la búsqueda de refugio, letargo, nadando la coordinación, el equilibrio y la respiración. Además, las grabaciones de vídeo fueron hechas de esturión submuestras de cada réplica con el propósito de documentar cuantitativamente natación acti espontáneavidad. Estos puntos finales incluyeron medidas de la duración o de tiempo en movimiento, nadando velocidad y la distancia recorrida ^5,11 usando un paquete de software de análisis de imágenes digitales disponibles en el mercado. Este software define el contorno de cada imagen dentro de un campo de visión y de esto, se define el centro de gravedad para cada imagen. El software se puede realizar un seguimiento de la posición de cada centroide en un marco por sucesión marco para determinar las trayectorias de movimiento.

Este estudio cumplió con todas las secciones aplicables de las Reglas Finales de los reglamentos de la Ley de Bienestar Animal (9 CFR), y con todas las directrices institucionales para el tratamiento humano de los organismos de prueba durante el cultivo y la experimentación. A la finalización del estudio, todos los peces fueron sacrificados según las directrices adecuados con la aprobación por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional para el US Geological Survey, Columbia Centro de Investigación del Medio Ambiente.

Protocolo

1. Diluter de instalación para las larvas de esturión La exposición a concentraciones acuosas de cobre

1. Exposiciones creados utilizando un sistema de flujo continuo, como un sistema de ¹² diluter Monte y Brungs modificado siguientes directrices por parte de ASTM International ^13,14,15.
2. Seleccionar 25 mg / L como la alta concentración de cobre en base a los resultados de pruebas anteriores en los que se observaron efectos en torno a 4-6 mg / L. Use el grado reactivo de cobre II pentahidratado sulfato (> 98% de pureza) y mezclar hasta una solución de prueba de valores.
   NOTA: Ejemplo serie de concentración de las exposiciones son de 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,0625 y 0 mg / L. El uso de diluciones en serie 50% comenzando con 25 mg / L como la alta concentración se dirigirá a un rango de concentraciones observadas para provocar un deterioro del comportamiento.
3. Preparar la solución de ensayo stock en un matraz aforado de 48 horas antes del inicio de la exposición y ajuste de entregar a vaciar en la cámara de mezcla usando un diluyentedispensador de jeringa automatizada.
4. Utilice una plantilla de hoja de cálculo para determinar el peso de la sustancia que se añade a 1 l de agua desionizada que se traducirá en 25 g / L concentración de cobre, cuando la cámara de mezcla diluyente se enriquece con 1 ml de la solución de ensayo stock.
   NOTA: La figura 1 representa un ejemplo de una plantilla de hoja de cálculo para la preparación de la química para ensayos de toxicidad diluidor.
5. Pesar 195 mg de cobre de calidad reactivo II pentahidrato de sulfato utilizando una balanza analítica y se vierte en un matraz aforado de 1 L y se mezcla con 1 L de agua desionizada, para una concentración de stock de 48,65 mg / L.
6. Coloque el tubo de admisión del dispensador de jeringa automatizada en la solución de ensayo stock y ajustar el volumen pico de 1 ml y gire el diluyente en moviendo el interruptor de encendido y dejar ciclo durante 48 horas deje que se equilibre a la concentración de cobre correspondiente antes de la siembra esturión.
7. Coloque una línea en 4 vías divisor de flujo 16 a cada línea de distribución para dividir el flujo de agua a cada una de las cuatro cámaras de exposición se replican en el baño de agua diluyente. Ejecución de flujo del agua. Ciclo del agua a través del diluyente cuando la alimentación del diluyente se enciende y se abre una válvula de solenoide permitiendo que fluya agua a los tanques de dilución. Permite establecer la unidad enfriadora de 15 ° C y encienda la bomba de agua para hacer circular el agua en el baño de agua diluyente.
   NOTA: Este proceso es regulado por el uso de un temporizador automático.
8. Ajuste el diluidor para ciclo cada 30 minutos utilizando el temporizador automático y para entregar 250 ml de agua de ensayo con cada ciclo, lo que resulta en 12 adiciones de volumen por día a cada replicar cámara de prueba.
9. Seleccione cámaras de ensayo de exposición en función del tamaño del esturión para mantener la tasa aceptable de carga que es <10 g de peso húmedo de pescado / L en cualquier cámara en cualquier momento dado. Por ejemplo, para llevar a cabo las exposiciones con un 30 día después de la eclosión (DPH) esturión blanco (peso medio en gramos 0,17 g) utilizar 12 x21,5 cm ² frascos de vidrio con un agujero de 4 cm en el lado. Cubrir este lado con un tamiz de acero inoxidable de malla de 30 micras para permitir el flujo a través del agua de ensayo. El volumen de agua de ensayo en los tarros de exposición es de 1 L.
10. Usando una jeringa de plástico de 50 ml tomar dos replicados de 50 ml de muestras de agua en cada concentración para un total de 12 muestras y dispensar agua de ensayo en 100 vasos de precipitados de vidrio ml y medir el oxígeno disuelto (DO), temperatura, conductividad, pH, alcalinidad, dureza, el total de amoniaco, los principales cationes, aniones y carbono orgánico disuelto utilizando un equipo comercial estándar y siga las instrucciones del fabricante.
    NOTA: Las muestras deben ser tomadas al inicio y al final de la exposición.
11. Para recoger submuestras para el análisis químico, usar una jeringa de plástico de 25 ml, elaborar aproximadamente 24 ml de agua de ensayo de las cámaras de exposición utilizando una pajita para sorber unido a la jeringa en lugar de una aguja.
12. Retire la paja de sorber de la SYringe y coloque un alojamiento del cartucho de filtro de polipropileno a 0,45 micras de tamaño de poro, membrana de polietersulfona de la jeringa de plástico.
13. Empuje 4 ml de agua de ensayo a través del filtro y desechar.
14. Prescindir de los restantes 20 ml de agua de ensayo a través del filtro en una botella de polietileno-ácido limpiado y se acidifica a un 1% en volumen / volumen con alta pureza, ácido nítrico 16 M para el almacenamiento de hasta 3 meses.
    NOTA: Las muestras para el análisis químico se deben tomar al inicio, mitad y final de la exposición a confirmar las concentraciones de cobre.
15. Realizar análisis químicos mediante espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente siguiente Protección Ambiental de Estados Unidos Método Agencia 6020a ¹⁷
16. Después de tomar todas las muestras de agua y el diluyente es el ciclismo, almacén 10 de esturión (al azar, sin orden ni concierto) en cada replicar cámara de prueba. Recoger el esturión del tanque de cultivo donde se alojan utilizando una malla de red pequeña no abrasivo. Coloque el esturión en un pequeño bucket con agua de cultivo. Se necesita un total de 240 peces para comenzar la exposición.
17. No alimentar a los peces durante la exposición.
    NOTA: Por favor refiérase a la Figura 1 para una configuración visual de la disposición diluyente.
18. Leer la prueba todos los días durante la duración de la exposición y el registro de los peces mortalidad y monitorear el comportamiento de natación.
    NOTA: Otros criterios de valoración para buscar incluyen letargo, pérdida de equilibrio, cambios en la respiración, cambios en la pigmentación, la posición de los peces se encuentran en la columna de agua, la actividad y cualquier otra anomalía que se pueden identificar visualmente oculta.
    NOTA: Lea la prueba a la misma hora todos los días para mantener la coherencia.
19. Medir y cuantificar la actividad de la natación (peces de tiempo en movimiento, la velocidad y la distancia recorrida) usando un programa de software de seguimiento digital disponible comercialmente.

2. Observaciones y los recuentos de mortalidad durante la exposición

1. inspeccionar visualmente cada prueba chámbar y la mortalidad de notas y observaciones de comportamiento anormal usando una lista de control de comportamiento (Tabla 1) en las hojas de datos, aproximadamente al mismo tiempo, todos los días durante la exposición de 96 horas, preferiblemente por la mañana.
   NOTA: Los comportamientos que son sorprendentemente, atípicamente, subjetivamente, cualitativamente diferente de los controles se consideran anormales. De manera óptima el observador no tiene conocimiento de los tratamientos.
   NOTA: La pérdida de equilibrio se define como la incapacidad de los peces para mantener una posición vertical dentro de la columna de agua y la inmovilidad se define como la incapacidad de los peces para mover o nadar a menos pinchado. Otras anormalidades tales como letargia, hiperactividad, los aumentos o disminuciones en la respiración, cambios de color, temblores, espasmos, abdomen hinchado, posición en la columna de agua y cualesquiera otros patrones inusuales de natación también se deben registrar en la hoja de datos.
   NOTA: Consulte Video 1 para ejemplos de anormalcomportamiento.
2. Registro y quitar esturiones muertos todos los días.
3. El uso de una mano de oxígeno disuelto (OD) medidor portátil con sonda de medir el oxígeno disuelto in situ y registro de la temperatura del agua en dos repeticiones de cada concentración de la exposición y el registro en la hoja de datos.

3. Grabar en video Natación Actividad

1. muestras de datos de captura de vídeo utilizando una cámara de vídeo portátil montado en un trípode colocado directamente sobre la cabeza de la cámara de pruebas para documentar las anomalías de comportamiento.
2. Para cuantificar la actividad de natación, cortar un trozo de tubería de PVC de 13 cm de diámetro y 13 cm de altura para utilizar como el campo de prueba (Figura 1). Coloque el tubo de PVC en el diluyente dentro de cada exposición tanques de concentración de cobre correspondientes. Utilice el área dentro de la tubería de PVC como la arena de la prueba, ya que es lo suficientemente grande para el esturión a nadar libremente.
3. Al final de la exposición 96 hr, submuestra aleatoria 5 supervivientes de esturión de cada concentratio cobren para medir la actividad de natación y colocarlos en la arena a prueba con una pequeña red de malla.
   NOTA: En las concentraciones de ensayo más altas donde la mortalidad esturión era prevalente, cualquier esturión sobrevivir restante debe utilizarse para medir la actividad de la natación y en algunos casos podría ser inferior a 5.
4. Después de colocar el pescado en la arena a prueba, permite a los peces a aclimatarse durante un período de 30 min.
   NOTA: El éxito, error de análisis libre del vídeo requiere una imagen de alto contraste de los peces contra un fondo con un mínimo de estructura que podría oscurecer u ocultar la imagen de los peces. La imagen de los peces debe estar en buen enfoque y debe estar libre de deslumbramiento superficie o libre de distorsiones debidas a agua en movimiento por lo que el sistema de diluyente debe estar apagado.
5. Después de 30 minutos, apague la cámara de vídeo y configurada en REC para grabar la actividad de natación por un período de 2 min.
6. La eutanasia a los peces después de tomar las grabaciones de vídeo para serconducta.
7. Coloque esturión en una solución concentrada de agua tricaína metanosulfonato (MS222) durante al menos 10 min para permitir el cese del movimiento opercular.
   NOTA: Se recomienda una concentración de al menos 250 mg / L y puede ser mucho más alta para ciertas especies.
8. Coloque el esturión sacrificados en una bolsa de plástico con cierre hermético y colocar en el congelador para su eliminación en un momento posterior. Apague la cámara de vídeo y transferir todos los archivos de vídeo a un ordenador para su procesamiento posterior usando el software de seguimiento digital.

4. Medidas de Natación Actividad de reproducción de vídeo

1. Localizar los archivos de datos de la hoja de datos y video para que se analizó el experimento. Convertir archivos de vídeo a un formato compatible con el software de análisis digital puede manejar.
2. Cargar todos los archivos que deben procesarse en el software. software de seguimiento abierto haciendo clic en el icono. Haga clic en el "experimento Nueva predeterminado" en el "Crear un nuevo experimento" opción en la pantalla principal.
3. Introduce el nombre de experimento en el cuadro de diálogo "Nuevo Experimento" que aparece en la pantalla. Elegir archivo experimento ubicación se va a guardar. Haga clic en Aceptar". Seleccione la opción "configuración de la prueba" bajo "Configuración" .choose "Desde archivo de vídeo" en "fuente de vídeo".
4. Seleccione "1" para "Número de arenas". Seleccione "3" para "Número de sujetos por arena". Seleccionar "La detección del punto central" en "Características de oruga". Seleccione las unidades deseadas.
5. Seleccionar la opción "Lista de prueba" en "Configuración". Haga clic en "Añadir" en la parte superior de la pantalla. Elige "orden alfabético" en la opción "Ordenar" en la ventana de diálogo "Añadir" que aparece en la pantalla. Haga clic en "Examinar". Navegue a la carpeta donde se encuentran los archivos de vídeo.
6. Resalta todos los archivos de vídeo. Haga clic en "Abrir". Haga clic en "Agregar variable" en la parte superior de la pantalla. Enter "Concentración" en "Etiqueta "caja. Enter" La concentración de cobre en microgramos / L "en" Descripción del cuadro ".
7. Elija "numérico" de la lista desplegable de "Tipo". Haga clic en la casilla de "valores predefinidos". Seleccione la opción "Definir valores individuales" opción en el cuadro de diálogo "Predefina valores numéricos" que aparece.
8. Introduzca "0", "3", "6", "13", "25" y "50" en el espacio "predefinidas Valor". Haga clic en "Añadir >>" entre cada adición número. Desactive la opción "Permitir otros valores" opción. Haga clic en Aceptar".
9. Elija "prueba" de menú desplegable en el cuadro de "Ámbito de aplicación". Introduzca concentración apropiada para cada ensayo en cajas proporcionadas. Haga clic en "Agregar variable" en la parte superior de la pantalla. Enter "Replicar" en la caja "Etiqueta". Enter "Replicar número" en cuadro "Descripción". Elija "numérico" de la lista desplegable de "Tipo".
10. Haga clic en "PLos valores redefinidos "caja. Seleccione la opción" Definir valores individuales "en el" Predefina valores numéricos "cuadro de diálogo. Introduzca" 1 "," 2 "," 3 "y" 4 "en" Valor predefinidas "espacio. Haga clic en" Añadir >> "entre cada adición número. Desactive la opción" Permitir que los otros valores "option.Click" OK ".
11. Elija "prueba" de menú desplegable en el cuadro de "Ámbito de aplicación". Introduzca el número de duplicados apropiado para cada ensayo en cajas proporcionadas. Seleccione la opción "Configuración de Arena" en la pestaña "Configuración" en la parte superior de la pantalla. Nombrar primer ajuste "Prueba 1". Haga clic en la opción "Grab imagen de fondo" de "(1 ensayo) Ajustes Arena" cuadro de diálogo.
12. Haga clic en "Examinar" en el cuadro de diálogo "Grab imagen de fondo". Busque el archivo de vídeo para la Prueba 1 y haga clic en "Abrir". Haga clic en la opción "Grab" en el cuadro de diálogo "Grab imagen de fondo" después de que aparezca el vídeo. Haga clic en el icono del círculo de color blanco cerca de la parte superior de la pantalla undER "Arena Configuración".
13. Manipular círculo que aparece de modo que toda la zona de baño está encerrado en el círculo. marcas de trama aparecen donde se define la zona de la arena. Haga clic en el icono "calibración de la balanza", cerca de la parte superior de la pantalla en "Ajustes del estadio". Izquierda haga clic en un borde de la arena. Sostener y arrastrar el ratón hacia el extremo opuesto de la arena. Soltar botón izquierdo del ratón.
14. Enter "10,5" en la casilla "real mundial de distancia" en el cuadro de diálogo "Calibración Distancia" que aparece. Haga clic en Aceptar". Si es necesario, ajuste recta de calibrado de manera que se extiende por todo el diámetro del área circular.
15. Haga clic en la opción "Configuración Arena Validar" en "Configuración Arena (Prueba 1)" cuadro de diálogo. Frente a cualquier problema si la configuración no se validan. Haga clic derecho en "Configuración Arena" previstas en la opción "Configuración" de la barra de herramientas "Experimento Explorer" en la izquierda de la pantalla y seleccione "Nuevo" del menú.
16. Repita los pasos hasta 04.11 a 04.15 h Ajustes de arenaave ha creado para cada ensayo. Asegúrese de elegir el archivo de vídeo adecuado para cada ensayo. Seleccione la opción "Configuración de detección" bajo la opción "Configuración" de la barra de herramientas "Experimento Explorer" en la izquierda de la pantalla.
17. Elija "Dinámico La resta" en el menú desplegable bajo el título "Método" en la "configuración de detección: Configuración de detección 1" cuadro de diálogo que appears.Choose diferentes colores de relleno para cada sujeto en "Identificación Asunto" en el diálogo: "Configuración de detección Configuración de detección 1" caja.
18. Seleccione la opción "Seleccionar vídeo" y busque el vídeo de prueba 1.Click "abierto" .Seleccione "5.9941" de caja "Frecuencia de muestreo" en "Vídeo" en la "configuración de detección: Configuración de detección 1" cuadro de diálogo. Haga clic en "Configuración" para la opción "imagen de referencia" en "detección" en el cuadro de diálogo: "configuración de detección de Configuración de detección 1".
19. Haga clic en "Iniciar el aprendizaje (C)4; opción en la "Imagen de referencia" diálogo box.Wait de programa para aprender la imagen de referencia. Una vez que la imagen en el cuadro de diálogo "Imagen de referencia" aparece sin animales, haga clic en "Usar la imagen de referencia dinámico" bajo "Ajuste de adquisición" en el cuadro de diálogo.
20. Haga clic en "Cerrar". Seleccione la opción "más oscura" del menú desplegable para "El sujeto es" bajo "detección" en el cuadro de diálogo: "configuración de detección de Configuración de detección 1". Establecer un número menor a "33" y un mayor número de "153" por "contraste oscuro" en "configuración de detección de" detección ": Configuración de detección cuadro de diálogo 1".
21. Haga clic en "Guardar cambios" en la parte inferior derecha del cuadro de diálogo: "configuración de detección de Configuración de detección 1". Haga clic en el botón de reproducción en el cuadro de diálogo "Control de reproducción" y confirme que el software es el seguimiento de los animales con éxito en comparación con sombras o escombros. Ajustar la cantidad de "contras oscurast "según sea necesario.
22. Una vez que el seguimiento es apropiado, haga clic en "Guardar cambios" en la parte inferior derecha del cuadro de diálogo: "configuración de detección de Configuración de detección 1". Elija "adquisición" en la opción "Configuración" de la barra de herramientas "Experimento Explorer" en la izquierda de la pantalla.
23. Haga clic en "Pista siguiente prueba planificada" en el cuadro de diálogo "Configuración de adquisición". Para confirmar el ajuste de prueba, vídeo y arena correcto se muestra en "Configuración" en el cuadro de diálogo "Configuración de adquisición".
24. Marque la opción "Detección determina la velocidad" en el cuadro de diálogo "Control de Adquisición". Haga clic en el botón con el círculo verde inscribirse en un cuadrado blanco para comenzar el proceso de adquisición. Repita los pasos hasta 04.22 a 04.23 todos los ensayos han sido rastreados.
25. Haga clic en "Perfiles de datos" en la opción "Análisis" de la barra de herramientas "Experimento Explorer" en la izquierda de screen.Choose "Time" en "agrupamiento" opción en la barra de herramientas "Componentes". Ajuste "A" a "0:02:00" en el "intervalo de tiempo Seleccionar la pista" la partida en el cuadro de diálogo "Time". Haga clic en Aceptar".
26. Arrastre el cuadro de "jerarquía" entre la caja de "Inicio" y el cuadro "número 1" en el área "Perfiles de datos" en el lado derecho de la pantalla. Haga clic en "Análisis de perfiles" en la opción "Análisis" de la barra de herramientas "Experimento Explorer" en la izquierda de la pantalla. Haga clic en "Velocidad" en la "distancia y el tiempo" la partida en la barra de herramientas "Variables dependientes" que aparece.
27. Haga clic en "Añadir" en el cuadro de diálogo "velocidad". Haga clic en "distancia recorrida" bajo la "distancia y el tiempo" la partida en la barra de herramientas "Variables dependientes". Haga clic en "Añadir" en la "distancia recorrida" cuadro de diálogo. Haga clic en "movimiento" en el "comportamiento individual" la partida en las "variables dependientes" toolbar.
28. Ajuste "intervalo de promedio" a "1" en el "filtro de valores atípicos" la partida en el cuadro de diálogo "Movimiento". Ajuste "Start velocidad" a "2,00" y "velocidad Stop" a "1,75" en el "umbral" la partida en el cuadro de diálogo "Movimiento".
29. Marcar ambas casillas para "Moving" y "No se está moviendo" en el capítulo "Cálculo de las estadísticas de" la partida en el cuadro de diálogo "Movimiento". Haga clic en "Añadir" en la parte inferior del cuadro de diálogo "Movimiento". Haga clic en "Resultados del análisis" en la opción "Resultados" en la barra de herramientas "Experimento Explorer" en la izquierda de la pantalla. Haga clic en "Calcular" en la parte superior de la pantalla.
30. Una vez calculadas las variables dependientes, haga clic en "Exportar" en la parte superior de la pantalla. Elija la carpeta de destino en el cuadro de diálogo "Resultados del análisis de Exportación". Seleccione "Excel" en el menú desplegable "Tipo de archivo" en el "Análisis de exportación output "cuadro de diálogo. Haga clic en" Aceptar ".
31. Haga clic en "Guardar Experimento" en la pestaña "Archivo" en la parte superior de la pantalla. Cierre el software de seguimiento digital. Importe los datos a un archivo de hoja de cálculo y analizar utilizando un paquete comercial de software de análisis estadístico.

Resultados

El procesamiento manual de los datos de las observaciones visuales mostraron anomalías por ciento de aumento con el aumento de la concentración de cobre después de sólo 72 horas de la exposición se inició con 2 día después de la escotilla (DPH) esturión (Figura 2). Las muestras de video documentadas las graves repercusiones que la exposición de cobre sobre el comportamiento natatorio de esturión (Video 2) y ayudaron a definir el deterioro del comportamiento como resultado. En otro ejemplo, el esturión a 30 DPH resultó sensible a la exposición de cobre con una mediana de 96 horas la concentración de efecto letal (LC50) de 40,3 mg / L basado en la mortalidad solamente. Sin embargo, cuando los puntos finales de comportamiento subletales de pérdida de equilibrio y la inmovilización se incluyen junto con la mortalidad la sensibilidad aumenta con una concentración estimada 96 hr efecto mediano (EC50), que van desde 2,4 hasta 5,0 g / L. Documentación en video capturados estos efectos subletales y más validados observaciones humanos de las anomalías de comportamiento registradosdurante la exposición. El uso de software de rastreo digital reduce el tiempo de procesamiento posterior de manera significativa en el análisis de la actividad de natación. Fish velocidad de natación, el tiempo empleado en movimiento, y la distancia recorrida disminuyó significativamente todos (Figura 3) con el aumento de la concentración de cobre. Trayectorias de natación también se redujeron con el aumento de la concentración de cobre (Figura 4).

Figura 1:.. Por ordenador captura de pantalla de una plantilla de hoja de cálculo utilizado para determinar la concentración de prueba de disolución madre preparación química de stock para las pruebas de toxicidad diluidores se determinó utilizando una plantilla de hoja de cálculo en base a una concentración objetivo Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2:. Diluter configuración y el diseño experimental Varias etapas de la vida de esturión blanco fueron expuestos al cobre. El tamaño del diluyente utilizado para las exposiciones se seleccionó en función del tamaño del pescado. (A) esturión primeras fases de vida se expusieron utilizando una configuración de diluyente pequeña y (b) el esturión mayores etapa de la vida se expusieron utilizando una configuración de diluyente grande.

Figura 3: Natación conducta resulta de una etapa de la vida temprana del esturión blanco (Acipenser transmontanus) la exposición de cobre de 72 horas (a partir de 30 días tras la eclosión [DPH] pescado). Criterios de valoración de la actividad de natación (a) duración de movimiento entre 30 DPH esturión blanco; (B) la velocidad de la natación; y (c

Figura 4: Los resultados de un primeras fases de vida del esturión blanco (Acipenser transmontanus) 96 horas de exposición de cobre (a partir de 2 días tras la eclosión [DPH] pescado) Sobrevivir esturión blanco en 2 DPH exhibir pérdida del equilibrio y la inmovilización después de 72 h de una. exposición 96 hr con el aumento de la concentración de cobre. El asterisco indica una diferencia significativa del control, las barras de error representan la desviación estándar.

Figura 5: Ejemplo de la natación de ruta resultados de un esturión blanco primeras fases de vida (Acipenser TRANSMOntanus) 96 horas de exposición de cobre (que mira fijamente con 30 días tras la eclosión [DPH] pescado). trayectorias de natación de esturión digitalizaron usando software de seguimiento digital a partir de (a) la replicación de control (n = 5 peces) y (b) a partir de un tratamiento de alto (50 g / L) replicar (n = 3 peces) después de una exposición de 96 horas. Tenga en cuenta el número de trayectorias de natación no representa el número de peces presentes en la cámara debido a algunos peces eran inactivos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El parámetro cuantificable	Parámetros de observación
Velocidad	Letargo / Hiperactividad
distancia recorrida	La pérdida de equilibrio
Duración del tiempo transcurrido en la zona	Espasmos / temblores / al revésabajo
Zona de transición de la cantidad de veces que organismo se desplaza entre zonas seleccionadas	Posición en la columna de agua
La partida a punto calcula la desviación de la trayectoria del animal hacia un punto de interés	Respiración (rápido / lento)
Encabezamiento calcula el título del punto del cuerpo seleccionado	Coloración
Girar ángulo diferencia en la partida entre dos muestras	Ocultación
-velocidad se calcula dividiendo el ángulo de giro por el intervalo de muestreo angular
Meandro calcula dividiendo el ángulo de giro por la distancia recorrida. Se utiliza para comparar convirtiendo en animales se mueven a diferentes velocidades
De tiempo en movimiento
Movilidad estado calcula la duración para la cual el área completa detectado como animales está cambiando, incluso si el cientoer punto sigue siendo el mismo
Rotación de una rotación se ha concluido cuando el punto del cuerpo seleccionado tiene un ángulo de giro acumulado de 360 ​​°. Gira en el sentido opuesto de menor que el umbral son ignorados.
Movilidad continua-calcula el porcentaje de la movilidad para el área completa del animal detectado, incluso si el punto central sigue siendo el mismo.
Distancia entre sujetos que se calcula la distancia entre todos los actores y los receptores seleccionados
Proximity-calcula la duración para la que el actor es o no en la proximidad del receptor
El movimiento relativo
movimiento-El Net ponderado movimiento del actor a (positivo) y de (negativo) el receptor, ponderado por la distancia entre ellos
movimiento ponderada de-moveme nt del actor desde el receptor, ponderado por la distancia entre ellos.
movimiento ponderada To- movimiento del actor para el receptor, ponderada por la distancia entre ellos
Control Trial período entre dos eventos declaración de los elementos de control de prueba, o dentro de uno de los elementos
Control Trial eventos momento en el que un evento dentro de un elemento que ha definido en el Control de prueba se produce.

Tabla 1:. Criterios de valoración del comportamiento cuantificados a través de un software de seguimiento digital de estos criterios de valoración se puede utilizar en los individuos o grupos y también sirven como una lista de comprobaciones de observación visual de deterioro conductual durante la exposición.

/www.jove.com/files/ftp_upload/53477/53477video1.avi "> Video ^1:. Visual definición de comportamiento anormal exhibida por esturión blanco afectado (Haga clic derecho para descargar) Se utilizó una lista de verificación de observación diaria para documentar anomalías La. pérdida del equilibrio y la inmovilización fueron las anomalías más frecuentes observadas durante las exposiciones. Modificado de Calfee y col. ⁷

Video 2: Visual documentación destacando un ejemplo de comportamiento natatorio blanco esturión. (Haga clic derecho para descargar) la actividad natatoria del esturión blanco se redujo en gran medida con la exposición al aumento de la concentración de cobre. El esturión se muestra en este video son de un control, medio bajo y un alto tratamiento al final de un cobre acuosa 96 horasexposición. Aunque el esturión blanco todavía estaban vivos, es evidente el pescado se deteriora en gran medida en los tratamientos en comparación con los controles. Modificado de Calfee y col. ⁷

Discusión

Los cambios en el comportamiento debido a la exposición a un contaminante a menudo se utilizan como criterio de valoración de la toxicidad subletal, pero pueden ser difíciles de medir. En general, las respuestas de comportamiento se miden por medio de observaciones visuales y análisis de datos manual que requiere una gran cantidad de tiempo para procesar. Sin embargo, con el avance de la tecnología, los métodos para cuantificar la actividad de natación se han centrado en el uso de la videografía ¹⁸ y de análisis de movimiento o software de seguimiento digital que reduce el tiempo de procesamiento y análisis. Durante el análisis del vídeo capturado los datos, la cuantificación de las variables de natación manualmente habrían sido mucho tiempo por lo que el uso de grabaciones de datos de vídeo y software de seguimiento de peces provistos de una manera más eficaz y eficiente para analizar el comportamiento de natación esturión. Aunque el procedimiento destacó el comportamiento de natación de un pez, la personalización de otros organismos tales como anfibios e invertebrados acuáticos requerirían modificaciones sencillas. Dependiendo de lo que endpoin conductualts se están abordando, diseño y sistemas de cámaras experimentales pueden ser desarrollados para su uso con casi cualquier paquete de software de seguimiento disponible en el mercado.

El método se demostró utilizando cobre disuelto, pero es aplicable a otros contaminantes o características tales como la temperatura o el contenido de oxígeno acuoso. Los protocolos desarrollados y presentados en este documento utilizan una cámara de vídeo digital simple como el dispositivo de grabación. Los archivos digitales se pueden transferir fácilmente a un ordenador y se cargan en el software de análisis de movimiento. Los métodos están siendo modificados constantemente y refinado para agilizar el proceso de cuantificación. Es imperativo que la calidad de vídeo sea en alta definición para que el software de análisis para identificar a cada individuo para el seguimiento de los peces. Cualquier fondo que no contrastan con los peces causará problemas cuando se trata de procesar los archivos de datos. Otro problema común con las dos dimensiones de seguimiento de vídeo es la identificación de los individuoscuando se cruzan los caminos de natación. Esto se puede corregir manualmente mediante la identificación de cada uno de los peces durante el cruce de ruta y la vinculación de los segmentos de trayectoria dentro del software. Alternativamente, la actividad total puede ser determinada a partir de cada cámara de la replicación como una media del grupo. Varias cámaras individuales con cada uno que contiene un pescado pueden ser filmados en el mismo campo de visión para calcular los movimientos de los peces.

Actualmente hemos actualizado a la utilización de una serie de cámaras de vigilancia superiores sobre las cámaras de exposición que están vinculados a un dispositivo de grabación de vídeo digital de alta definición (HD-DVR). Sin embargo, el uso de cualquier sistema de cámara que puede grabar en alta definición MPEG-4 vídeos funcionará. El HD-DVR se puede configurar para grabar en un momento determinado y programado por hasta 7 días. Este manos libres enfoque automatizado permite la captura de varios videos al mismo tiempo para mantener la consistencia y reducir al mínimo las perturbaciones externas que puedan comprometer el comportamiento de los peces. El syste HD-DVRms se conectan a una red interna lo que la transferencia de archivos es relativamente simple. Mientras que el sistema de cámara automatizado es una técnica muy mejorado para cuantificar el comportamiento de natación, todavía es beneficioso para realizar observaciones visuales para servir como información de apoyo adicional para la documentación del deterioro del comportamiento durante las pruebas de toxicidad.

Hay una larga historia de la literatura que documenta alterado comportamiento de los peces resultantes de la exposición a los metales que datan de la década de 1960 ^19,20,21. El cobre se ha demostrado que causa cambios en los niveles de actividad tales como la hipoactividad de agallas azules ²² (Lepomis macrochirus Rafinesque) y los cambios en la actividad locomotora y la alimentación de la trucha de arroyo ²³ (Salvelinus fontinalis). Al menos algunos peces jóvenes confían en su sentido del olfato para detectar y evitar a los depredadores, y el cobre inducida por la privación quimiosensorial puede afectar los comportamientos relacionados con la detección de sustancias químicas de alarma ^24,25,26 . El epitelio olfativo está dañado debido a la exposición al cobre se afectan los mecanismos sensoriales que podrían resultar en la desorientación, la evitación conductual, reducción en la alimentación y cualquier otro comportamiento que se guían por el olfato ^27. Estos comportamientos alterados fueron consistentes con lo observado durante las exposiciones.

El comportamiento de natación de esturión blanco se vio afectada en gran medida durante la exposición subletal a concentraciones de cobre acuosas .. Estos resultados ilustran cómo el comportamiento se ve afectada en concentraciones subletales de cobre y se puede utilizar como un indicador de estrés tóxico. El análisis basado en vídeo ha demostrado su eficacia en la cuantificación de la conducta natación y también sirvió como documentación visual cualitativa de los impactos severos sobre el esturión expuestos al cobre. El software de análisis también es capaz de cuantificar otros diversos criterios de valoración del comportamiento. Por favor refiérase a la Tabla 1 para obtener una lista. El sistema de exposición puede ser modificado para hacer frente a cada punto final enmodo de tiempo real y puede ser utilizado para cuantificar las diferencias en el comportamiento asociado con la exposición a diversos contaminantes de interés.

El uso de criterios de valoración del comportamiento en la investigación toxicológica acuática es cada vez más ocupados y debe ser considerado en la evaluación de los efectos de los contaminantes porque la función del comportamiento adaptativo es crucial en la determinación del daño ambiental ^9. Los impactos de los contaminantes ambientales a comportamiento de los peces es a menudo subjetiva y desafiando particularmente cuando se trata de efectos sub-letales en ausencia de métodos estándar ..

Piscina actividad tal como se cuantifica mediante el uso de estos métodos se puede controlar rigurosamente, es no destructiva con el estrés mínimo para el organismo y puede repetirse. Natación comportamiento es un índice válido y consistente de la toxicidad subletal que debe ser incorporado en los protocolos de ensayo para ampliar la sensibilidad de las pruebas de toxicidad estándar ^5.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
sulfato de cobre II pentahidratado	Sigma-Aldrich		contaminante de preocupación dispensador de
jeringa	Hamilton MicroLab Serie		Aparato para espigar productos químicos
matraz			para la solución
de almacenamiento de frascos de vidrio de 24-1,5 L cámara de			esturión de 2 dph
	Sony Handycam Software de seguimiento digital HDR-CX550V
Monitores de pantalla	Noldus Ethovision
de 3-17"
vigilancia	Modelo CL101
Dispositivos
Medidor de OD	Medidor de pH YSI
	Orion 940
sonda	de ph Orion
			de amoníaco
sonda de amoníaco	unidad
bomba de agua