El aislamiento de regiones genómicas específicas e identificación de moléculas asociadas por enChIP

Resumen

La identificación de moléculas asociadas con regiones genómicas específicas de interés es necesaria para comprender los mecanismos de regulación de las funciones de estas regiones. Este protocolo describe los procedimientos para realizar la inmunoprecipitación de cromatina mediada por moléculas de unión al ADN (enChIP) para la identificación de proteínas y ARN asociados con una región genómica específica.

Resumen

La identificación de moléculas asociadas con regiones genómicas específicas de interés es necesaria para comprender los mecanismos de regulación de las funciones de estas regiones. Para permitir la identificación no sesgada de moléculas que interactúan con una región genómica específica de interés, recientemente desarrollamos la técnica de inmunoprecipitación de cromatina mediada por moléculas de unión al ADN (enChIP). Aquí, describimos cómo usar enChIP para aislar regiones genómicas específicas e identificar las proteínas y ARN asociados. En primer lugar, una región genómica de interés se marca con una proteína similar a un activador de la transcripción (TAL) o un complejo de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR) que consta de una forma catalíticamente inactiva de Cas9 y un ARN guía. Posteriormente, la cromatina se reticula y fragmenta por sonicación. A continuación, el locus marcado se inmunoprecipita y se invierte la reticulación. Finalmente, las proteínas o RNAs que se asocian a la cromatina aislada se someten a análisis de espectrometría de masas o de secuenciación de ARN, respectivamente. Este enfoque permite la identificación exitosa de proteínas y ARN asociados con una región genómica de interés.

Introducción

Se requiere la identificación de moléculas asociadas con las regiones genómicas específicas de interés para entender los mecanismos de regulación de las funciones genómicas tales como la transcripción y la regulación epigenética. Aunque varios se han desarrollado técnicas para el análisis bioquímico de las regiones genómicas específicas ^1-7, no se utilizan ampliamente en esta etapa debido a sus problemas intrínsecos tales como la aplicación limitada (por ejemplo, sólo para alto número de copia o loci loci con repeticiones) y demasiado tiempo y esfuerzos requeridos.

Con el fin de realizar el análisis bioquímico de regiones genómicas específicas fácilmente, hemos desarrollado dos tecnologías locus específicos cromatina immunoprecipitation (CHIP), a saber, por inserción de chip (ichip) ^8.13 y diseñados chip molécula mediada por unión al ADN (enChIP) ^14-17 . En ichip, un lugar de interés se marca mediante la inserción de secuencias de reconocimiento de una proteína de unión al ADN exógeno como LexA. El lugar se aísla mediante purificación por afinidad utilizando la proteína de unión al ADN etiquetados. Complejos En enChIP, ingeniería moléculas de unión al ADN, tales como proteínas de dedos de zinc, la transcripción (TAL) proteínas del tipo activador, y agrupados interspaced regularmente repeticiones palindrómicas cortas (CRISPR), se utilizan para etiquetar un locus de interés (Figura 1). Posteriormente, la región genómica se aísla mediante purificación por afinidad de las moléculas de unión al ADN etiquetados.

Una de las ventajas de enChIP sobre ICHIP es que la inserción de secuencias de reconocimiento de una proteína de unión a ADN exógeno no es necesario. Focalización de loci usando complejos CRISPR que consisten en una forma catalíticamente inactiva de Cas9 (dCas9) y una guía de ARN (gRNA) es mucho más fácil que la orientación de estas regiones por ichip o enChIP utilizando proteínas TAL y zinc-finger. Aquí se describe un protocolo de paso a paso para enChIP combinada con espectrometría de masas y secuenciación de ARN (RNA-Seq) para identificar locus-asoproteínas y ARNs TED, respectivamente.

Protocolo

1. Diseño de moléculas de ADN vinculante Engineered Reconociendo el locus diana

1. Para enChIP utilizando complejos CRISPR, utilice la herramienta web CRISPRdirect (http://crispr.dbcls.jp) para identificar secuencias candidato objetivo gRNA en la región genómica de interés descrito previamente ^18. Esta herramienta web devuelve 23 pb sitios genómicos de la forma 5'-N ₂₀ NGG-3 'dentro de la región de destino.
2. Sintetizar una gBlock incluyendo la secuencia del promotor U6 y la secuencia de 5'-N ₂₀ en 5'-N ₂₀ NGG-3 'usando los servicios comerciales (ver Figura 2) ^19,20. Para propósitos de la subclonación, incluir sitios de enzimas de restricción apropiadas fuera de la gBlock.
3. Inserte la gBlock en un vector apropiado tal como se describe anteriormente ^16. Varios vectores retrovirales para Gblocks están disponibles (ver Materiales).
4. Para enChIP utilizando proteínas TAL, diseñar proteínas TAL reconociendo la target loci. Generar plásmidos que codifican proteínas TAL utilizando servicios comerciales. Generar vectores de expresión que contienen las proteínas TAL fusionados con una o más etiquetas tales como FLAG 3 × ¹⁵ como se describió anteriormente.

2. Establecimiento de células para el Análisis enChIP

1. Expresar 3 × FLAG-dCas9 y la gRNA (procedimiento basado en CRISPR) o 3 × FLAG-TAL (procedimiento a base de proteínas TAL) en las células a analizar como se describe anteriormente ^{14-17 de.}
   1. Utilice transfección transitoria si la eficiencia de transfección es alta. Un vector de expresión que contiene 3 × FLAG-dCas9 y el promotor CMV está disponible (ver Materiales).
   2. Considerar el establecimiento de transformantes estables usando métodos convencionales si la eficiencia de transfección transitoria es baja. Además de los vectores retrovirales mencionados anteriormente para gBlock, vectores retrovirales de 3 × FLAG-dCas9 están disponibles (ver Materiales).
2. Confirmar la expresión de la 3xFLAG-dCas9 o proteína 3xFLAG-TAL en las células transfectadas por análisis de inmunotransferencia usando un anticuerpo anti-FLAG (Ab) como se describió previamente ^{14-17 de.}
   Nota: La expresión de estas proteínas etiquetadas también puede ser confirmada por tinción intracelular con anti-FLAG-FITC y un análisis FACS subsiguiente. Un protocolo para la tinción intracelular se puede descargar desde nuestra página web (http://www.biken.osaka-u.ac.jp/lab/microimm/fujii/iChIP_protocols/english.html).
3. Confirmar la expresión de la gRNA por la técnica de RT-PCR estándar.
4. Para la identificación cuantitativa de las proteínas que interactúan con la región genómica de interés, considere el uso de un etiquetado de isótopos estables de aminoácidos en cultivo celular (SILAC) análisis combinado con enChIP (enChIP-SILAC).
   Nota: los medios de comunicación para el análisis SILAC se pueden adquirir de proveedores comerciales. SILAC es de gran alcance en la detección de interacciones específicas.
   1. Células de cultivo en un medio pesado SILAC. Preparar células culturoja en medio de luz SILAC como control negativo. Utilice al menos 5 × 10 ^{7 células} para cada medio SILAC (pesada o ligera). Para el etiquetado eficiente, añadir tanto L-lisina-2HCl, ¹³ C ₆ y L-arginina-HCl, ¹³ C _6, ¹⁵ N ₄ en los medios SILAC pesados. Nota: Por lo menos cinco divisiones celulares son necesarias para las proteínas de la etiqueta.
      1. Por ejemplo, cultivo de células de fibrosarcoma humano HT1080 que expresan establemente 3xFLAG-dCas9 y un gRNA a 37 ° C y 5% de CO ₂ en medios DMEM durante SILAC y suero bovino fetal dializado con lisina-2HCl plus L-Arginina-HCl (medio de Luz) o ¹³ C ₆ L-lisina-2HCl ^más 13 C ₆ ¹⁵ N ₄ L-arginina-HCl (medio pesado) (ver Materiales) ^16. Añadir 50 mg de ligero o pesado L-lisina-2HCl y L-arginina-HCl en 500 ml de medio.
      2. Células trypsinize y replate antes de que sean confluentes para que las células mantienen growt exponencialmarido.

3. La reticulación de las células con formaldehído

1. Para las células en cultivo en suspensión, transferencia de 2 × 10 ⁷ células que expresan proteínas 3xFLAG-tal o 3xFLAG-dCas9 más gRNA y suspender en 30 ml de medio de cultivo regular en un tubo de centrífuga de 50 ml. Cuando se usan más células, aumentar los volúmenes y cantidades de reactivos proporcionalmente. Para los experimentos de SILAC, mezclar las células cultivadas en un medio pesado o mediano ligero (5 x 10 ⁷ células cada uno) y dividir el total de 1 x 10 ⁸ células en 5 tubos que contienen 2 x 10 ⁷ células.
2. Añadir 810 l de 37% de formaldehído a 30 ml de la suspensión celular (concentración final 1%) y se incuba a 37 ° C durante 5 min. Para las células adherentes, fijar directamente las células en placas de cultivo mediante la adición de 810 l de 37% de formaldehído a 30 ml de medio de cultivo.
3. Detener la reticulación mediante la adición de 3,1 ml de 1,25 M solución de glicina (concentración final 127 mM), yincubar a TA durante 10 min.
4. Recoger las células por centrifugación (300 xg durante 5 min a 4 ° C). Deseche cuidadosamente el sobrenadante incluyendo formaldehído y almacenarlo en una botella de recuperación apropiado.
   1. Para las células adherentes, separar las células con un raspador celular y la cosecha en un tubo de 50 ml, y recoger las células como se describe en este paso.
   2. Para los experimentos de SILAC, mezclar las células desprendidas cultivadas en un medio pesado o mediano ligero (5 x 10 ⁷ células cada uno), se divide el total de 1 x 10 ⁸ células en 5 tubos que contienen 2 x 10 ⁷ células, y recoger las células como se describe en este paso.
5. Lavar el sedimento celular con 30 ml de PBS dos veces por tubo. Deseche cuidadosamente el sobrenadante incluyendo formaldehído y almacenarlo en una recuperación apropiado bottle.Handle los residuos de formaldehído de acuerdo con las directrices de seguridad química. Las células fijadas pueden ser congelados y almacenados a -80 ° C.

4. Preparación de la cromatina (por 2 x 10^{7 células)}

1. Suspender las células fijadas en 10 ml de tampón de lisis celular (Tris 10 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM, 0,5% de Igepal CA-630, y 1 × inhibidores de la proteasa) y se incuba en hielo durante 10 min.
2. Centrifugar la muestra (830 × g a 4 ° C durante 8 min) y descartar el sobrenadante con cuidado.
3. Suspender el sedimento en 10 ml de tampón de lisis nuclear (Tris 10 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM, NaCl 0,5 M, 1% de Triton X-100, desoxicolato de sodio 0,5%, 0,5% lauroilsarcosina, y inhibidores de la proteasa 1X). Incubar en hielo durante 10 min y Vortex cada 2-3 min.
4. Centrifugar la muestra (830 × g a 4 ° C durante 8 min) y descartar el sobrenadante con cuidado.
5. Lavar el precipitado en 10 ml de PBS. El sedimento (fracción de cromatina) se puede almacenar a -80 ° C después de la congelación inmediata en nitrógeno líquido.

5. La sonicación de la cromatina (por 2 x 10 ⁷ células)

1. Suspender la fracción de la cromatina en 800 l detampón de lisis modificado 3 (10 mM Tris (pH 8,0), EDTA 1 mM, NaCl 150 mM, 0,1% de desoxicolato de sodio, 0,1% de SDS, y 1x inhibidores de la proteasa) y transferir a un tubo de 1,5 ml.
2. Sonicar la cromatina utilizando un sonicador (ver Materiales) y las siguientes condiciones: salida: 3; deber: 100% (continuo); y hora: gratuito. Realizar 10-18 ciclos de sonicación durante 10 segundos y enfriamiento en hielo durante 20 seg. Para evitar un calentamiento excesivo, incubar las muestras en hielo durante 2 minutos cada 5-6 ciclos. Para evitar la formación de espuma, mantener la posición de la punta de la sonda de sonicación 0,5 cm por encima del fondo del tubo.
3. Centrifugar la muestra a (16.000 × g a 4 ° C durante 10 min) y transferir el sobrenadante a un tubo de 1,5 ml. La cromatina sonicado se puede almacenar a -80 ° C después de la congelación inmediata en nitrógeno líquido.

6. Evaluación de la cromatina Fragmentación

1. Mezclar 10 l de la cromatina fragmentada con 85 l de agua destilada.
2. Añadir 4 lde NaCl 5 M y se incuba a 65 ° CO / N.
3. Añadir 1 l de 10 mg / ml de RNasa A y se incuba a 37 ° C durante 45 min.
4. Añadir 2 l de EDTA 0,5 M (pH 8,0), 4 l de 1 M Tris (pH 6,8), y 1 l de 20 mg / ml de proteinasa K, y luego se incuba a 45 ° C durante 1,5 hr.
5. Separadas 10 l de la muestra por electroforesis en un gel de agarosa al 1% que no contiene colorantes de tinción, tales como SYBR Green.
6. Tinción del gel para evaluar la distribución de las longitudes de la cromatina fragmentado. Se recomiendan las condiciones que generan una longitud media de 0,5 a 2 kpb (rango de 0,2 a 4 kpb).
7. Se purifica el ADN de las muestras restantes por extracción con fenol-cloroformo o mediante el uso de un kit de extracción de ADN (ver Materiales). El ADN purificado se puede utilizar como ADN de entrada para estimar los rendimientos de los análisis enChIP (véase 8.11).

7. Preparación de Dynabeads conjugado con anticuerpos (por 2 x 10 ⁷ células)

1. Prepare dos tubos de 1,5 ml, uno para pre-compensación utilizando IgG de ratón normal y el otro para la incubación con el anti-FLAG Ab. Añadir 150 l de perlas magnéticas-G conjugado de proteína (ver Materiales) a cada tubo.
2. Colocar los tubos en un soporte de imán y esperar 3 min. Descartar el sobrenadante con la pipeta.
3. Suspender las perlas en 1 ml de PBS que contenía 0,01% de Tween-20 (PBS-T). Colocar los tubos en un soporte magnético y esperar a 2 min. Descartar el sobrenadante con la pipeta, y luego repita el paso.
4. Suspender las perlas en 1 ml de PBS-T que contiene 0,1% de BSA.
5. Añadir 15 g de IgG de ratón normal o anti-FLAG Ab y gire a 4 ° CO / N.
6. Centrifugar brevemente, a continuación, coloque los tubos en un soporte de imán y esperar 3 min. Descartar el sobrenadante con la pipeta.
7. Suspender las perlas en 1 ml de PBS-T. Invierta la muestra varias veces y centrifugar brevemente. Colocar los tubos en un soporte de imán y esperar a 3 min, a continuación, descartar el sobrenadante mediante pipeteo. Repita el lavadodos veces más con PBS-T (un total de tres pasos de lavado).

8. La cromatina Immunoprecipitation (por 2 x 10 ⁷ células)

1. Mezclar la cromatina fragmentado preparado en 5.3) (aproximadamente 800 l) con una quinta parte del volumen (aproximadamente 200 l) de tampón de lisis modificado 3 que contiene 5% de Triton X-100 (concentración final de 1% de Triton X-100).
2. Añadir la solución de la cromatina al tubo en el que se prepararon perlas magnéticas Proteína G-conjugados conjugadas con IgG de ratón normal. Rotar a 4 ° C durante 1 hr.
3. Se coloca el tubo en un soporte de imán y esperar 3 min.
4. Transferir el sobrenadante en el tubo en el que se prepararon perlas magnéticas Proteína G-conjugados conjugados con Ab anti-FLAG. Gire a 4 ° CO / N.
5. Se coloca el tubo en un soporte de imán y esperar 3 min. Descartar el sobrenadante con la pipeta.
6. Suspender las perlas en 1 ml de tampón de baja salinidad (Tris 20 mM (pH 8,0), EDTA 2 mM, NaCl 150 mM, 1% Triton X-100, inhibidores de la proteasa SDS, y 1x 0,1%) y giran a 4 ° C durante 5 min. Se coloca el tubo en un soporte de imán y esperar 3 min. Descartar el sobrenadante con la pipeta y repita el paso de lavado.
7. Lavar las perlas con tampón de alto contenido de sal (Tris 20 mM (pH 8,0), EDTA 2 mM, NaCl 500 mM, 1% Triton X-100, inhibidores de la proteasa SDS, y 1x 0,1%) dos veces.
8. Lavar las perlas con tampón de LiCl (10 mM Tris (pH 8,0), EDTA 1 mM, 250 mM LiCl, 0,5% de Igepal CA-630, 0,5% de desoxicolato de sodio, e inhibidores de proteasa 1X) dos veces.
9. Lavar las perlas con TBS-IGEPAL CA-630 (Tris 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, inhibidores de IGEPAL CA-630, y 1x de proteasa 0,1%) una vez.
10. Suspender las perlas en 200 l de tampón de elución (Tris 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, 0,1% de Igepal CA-630, inhibidores de la proteasa 1x, y 500 mg / ml 3 péptido × FLAG) y se incuba a 37 ° C durante 20 minutos. Se coloca el tubo en un soporte de imán y esperar 3 min. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 ml y repetir el elutel paso de iones.
11. Se purifica el ADN de pequeña porción (por ejemplo, 5%) del eluato por extracción con fenol-cloroformo o mediante el uso de un kit de extracción de ADN (ver Materiales). El ADN purificado puede ser utilizado para la PCR con el cebador específico se establecen para estimar los rendimientos de enChIP analiza mediante la comparación con el ADN de entrada preparada en la Etapa 6.7 como se describe anteriormente ^14,16.

9. SDS-PAGE, tinción y análisis de espectrometría de masas

1. Mezclar el eluato (400 l) con 1 ml de 2-propanol, 50 l de acetato de sodio 3M (pH 5,2), y 5 l de 20 mg / ml de glucógeno. Precipitar la cromatina a -20 ° CO / N.
2. Centrifugar la muestra (16.000 × g a 4 ° C durante 30 min) y descartar el sobrenadante. Enjuague el sedimento con 1 ml de etanol al 70% y se centrifuga de nuevo (16.000 × g a 4 ° C durante 10 min). Eliminar el sobrenadante por completo con la pipeta.
3. Suspender el sedimento en 40 l de tampón de muestra 2x (Tris 125 mM (pH 6,8), 10% 2-mercaptoethanol, 4% SDS, 10% de sacarosa, y 0,004% de azul de bromofenol). Vortex durante 5 min para disolver la pastilla completamente y, a continuación se incuba a 100 ° C durante 30 min para desnaturalizar las proteínas y revertir la reticulación.
4. Para SDS-PAGE, correr 40 l de la muestra en el gel hasta que el colorante alcanza 1 cm por debajo del pozo. Nota: Utilizamos generalmente 4-20% geles de gradiente, pero otros% geles pueden ser utilizados.
5. Tinción del gel con azul brillante de Coomassie o tinción de plata.
6. Cortar el gel en cinco piezas (2 mm de altura).
7. Realizar la digestión en gel y el análisis de espectrometría de masas como se describió previamente ^{13-16 de.}
8. Para los experimentos de SILAC con 5 x 10 ⁷ células cada uno (total de 1 x 10 ⁸ células), suspender pellet a partir de los cinco tubos iniciales en 40 l de tampón de muestra 2x (no es necesario para escalar hacia arriba).

10. Purificación de análisis de ARN y ARN-Seq

1. Para purificar el ARN después de enChIP, añadir 5 U / ml de inhibidor de RNasa (seMateriales e) a todas las soluciones tampón, excepto tampón de lisis modificado 3 y el tampón de elución, a los que suman 40 U / ml de inhibidor de RNasa.
2. Mezclar el eluato (400 l) con 16 l de NaCl 5 M y se incuba a 65 ° C durante 2 hr.
3. Añadir 1 ml de reactivo a base de ácido guanidinio-fenol-(ver Materiales) a la muestra. Vortex durante 15 segundos y luego se incuba a RT durante 5-15 min. Centrifugar la muestra durante 15 min a 12.000 × g y RT.
4. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 ml y añadir 5 l de p-bromoanisol. Vortex durante 15 segundos y luego se incuba a temperatura ambiente durante 3-5 min. Centrifugar la muestra durante 10 min a 12.000 × g y RT.
5. Transferir el sobrenadante (aproximadamente 1 ml) en un nuevo tubo 2 ml y se añade 1 ml de 2-propanol. Invertir el tubo e incubar a TA durante 10 min. Cargar la mezcla en una columna en un kit de purificación de ARN (ver Materiales). Centrifugar la columna durante 1 minuto a 12.000 × g y RT.
6. lavarla columna con 400 l de ARN tampón de lavado en un kit de purificación de ARN (ver Materiales).
7. Añadir 80 l de DNasa I cóctel (mezcla de 5 l de DNasa I (1 U / l), 8 l de 10 × DNasa I tampón de reacción, 3 l de DNasa / RNasa libre de agua, y 64 l de ARN tampón de lavado en un kit de purificación de ARN (ver Materiales)) a la columna. Incubar la muestra a 37 ° C durante 15 min y centrifugar durante 30 segundos a 12.000 × g y RT.
8. Lavar la columna con 400 l de ARN prelavado Buffer en un kit de purificación de ARN (ver Materiales) dos veces.
9. Eluir el ARN con 50 l de DNasa / RNasa libre de agua. El ARN eluido se puede utilizar para la secuenciación de ARN.

Resultados

En general, 1-30% de las regiones genómicas diana se puede purificar usando enChIP. Figura 3 incluye datos representativos que muestran los rendimientos de los análisis enChIP focalización telómeros y el promotor del interferón (IFN) de regulación del factor 1 (IRF-1) de genes. Como ejemplos de los resultados típicos, La Tabla 1 enumera las proteínas asociadas con el promotor de IRF-1 de una manera IFN-específico identificado por enChIP-SILAC, la Tabla 2 se enumeran las proteínas de unión a telómeros identificados por enChIP combinada con espectrometría de masas (enChIP-MS) y la Tabla 3 se enumeran los RNAs asociados con telómeros identificados por enChIP-RNA-Seq.

Figura 1. Visión general de enChIP. enChIP usando CRISPR (A, B) y TAL (C, D, E Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Secuencia de gBlock. El promotor U6 (en negro), el G nucleótidos bntes de la secuencia guía (en azul), se muestra la secuencia de guía (gRNA espaciador) (en rojo), la secuencia de andamio (en verde) y la secuencia de terminación (en naranja).

Figura 3. Los rendimientos de los análisis enChIP representativo. Entradas (A) Porcentaje de la meta de la FIC-1 locus y el locus Sox2 no objetivo. Entradas (B) Porcentaje de los telómeros objetivo y no objetivo gamma-satélites. Las cifras se han adaptado y modificado a partir de las publicaciones anteriores ^15,16.

Categorías	Proteínas
Transcripción	DDX1, PARP1, CKAP4, Pescadillo homólogo, PURβ, activado ARN polimerasa II p15 activador transcripcional, BTF3, Myb vinculanteproteína 1A
Desacetilación de histonas, componentes correpresores	Rbbp4, PA2G4, TBL3
Acetiltransferasa	Proteína arginina N-metiltransferasa 1
ADN topoisomerasa	ADN topoisomerasa 2α
Las histonas	Histona H2A.Z, H3.2 histonas

Tabla 1:. Ejemplos de proteínas asociadas con la región promotora IRF-1 humano de forma IFN-específico identificado por enChIP-SILAC La tabla ha sido adaptada de una publicación anterior ^16.

Categorías	Proteínas
Proteínas de unión telómeros mamíferos	PML, RPA, CDK1, PARP1, PCBP1
Telómeros bi-proteínas hallazgo en la levadura u otros organismos	IMP4
Las proteínas que interactúan con los telómeros vinculante proteínas [proteína de unión de los telómeros asociada]	ADN polimerasa α (POLA1) [Cdc13p], ARMC6 [TRF2], CTBP1 [FoxP2-POT1], exportina-5 [terc], GNL3L [TRF1], exportina-1 [terc], 14-3-3 [terc]
Las proteínas de localización de heterocromatina	BEND3
Las proteínas que regula las marcas epigenéticas	KDM5C
Las proteínas cuyas mutaciones afectan la función de los telómeros	Α ADN polimerasa (POLA1), Hat1, Nup133, CDK7, DPOE1, Prdx1, TYSY, -glutamato cisteína ligasa, glutarredoxina, SMRC1

Tabla 2:. Ejemplos de proteínas asociadas con telómeros ratón identificados por enChIP-MS La mesa ha sido ADAPTEd de una publicación anterior ^15.

Categorías	RNAs
Componentes de la telomerasa	Terc, rMRP
Telomérica RNAs	Terras
scaRNAs	Scarna6, Scarna10, Scarna13, Scarna2
H / ACA snoRNAs	Snora23, Snora74a, Snora73b, Snora73a
C / D snoRNAs	Snord17, Snord15a, Snord118
lncRNA	Neat1

Tabla 3: Ejemplos de ARN asociados con telómeros ratón identificados por enChIP-RNA-Seq La tabla ha sido adaptada de una publicación anterior ^17..

Discusión

Aquí, describimos la purificación de regiones genómicas específicas utilizando moléculas de unión al ADN modificadas, como el sistema CRISPR y las proteínas TAL, y la identificación de proteínas y ARN unidos a estas regiones genómicas. La unión de moléculas de unión al ADN modificadas al genoma puede afectar la estructura de la cromatina, incluido el posicionamiento de los nucleosomas, y puede anular las funciones genómicas, como se describe en los experimentos de interferencia CRISPR²¹. Para evitar estos posibles efectos aberrantes, proponemos pautas específicas para elegir regiones genómicas objetivo. En primer lugar, para evitar la posible inhibición del reclutamiento de ARN polimerasas y factores de transcripción, así como la interrupción del posicionamiento del nucleosoma alrededor del sitio de inicio de la transcripción, las regiones diana para los análisis de las regiones promotoras deben ser varios cientos de pares de bases aguas arriba de (5' hasta) el sitio de inicio de la transcripción. Por el contrario, cuando se analizan regiones genómicas con límites distintos, como potenciadores y silenciadores, las regiones genómicas que se yuxtaponen directamente a estas regiones pueden ser atacadas porque es menos probable que la unión de moléculas de unión al ADN modificadas afecte sus funciones. Además, es mejor evitar el uso de regiones diana que se conservan entre diferentes especies, porque las moléculas importantes de unión al ADN a menudo se unen a regiones conservadas evolutivamente y la inhibición de su unión podría alterar las funciones de las regiones genómicas diana. En este sentido, siempre es necesario comprobar que la función de la región genómica diana se mantiene en las células establecidas utilizadas para los análisis de enChIP. Debido a que se pueden probar fácilmente múltiples ARNg y es tedioso y costoso generar múltiples versiones de TAL o proteínas de dedos de zinc que reconocen diferentes regiones genómicas objetivo, enChIP usando CRISPR es más ventajoso que enChIP usando otras proteínas.

Se ha demostrado que dCas9 se une a sitios fuera del objetivo, aunque la afinidad con esos sitios podría ser más débil que la de los sitios objetivo^22-25. Hay varias formas de controlar la contaminación de las moléculas unidas a esos sitios fuera del objetivo. Primero, se recomendaría el uso de varios, al menos dos, ARNg diferentes. Aquellas moléculas comúnmente observadas en enChIP utilizando distintos ARNg serían verdaderos positivos. En segundo lugar, la comparación de diferentes condiciones para enChIP sería efectiva para cancelar la contaminación de moléculas no específicas y moléculas unidas a sitios fuera del objetivo. Ejemplos de esos conjuntos de comparación serían (i) estimulación (-) y (+), o (ii) diferentes tipos de células, como células T frente a células B. Finalmente, se debe realizar un análisis cuantitativo de la unión de las moléculas candidatas para confirmar su unión específica a los sitios diana. Es preferible preparar células que expresen solo dCas9 pero no ARNg como control negativo.

Utilizando análisis de enChIP, pudimos identificar con éxito una serie de moléculas conocidas y nuevas que interactúan con regiones genómicas específicas (Tablas 1-3)^14-17. Sin embargo, esta técnica no pudo detectar algunas otras proteínas conocidas que interactúan con estas regiones. Por ejemplo, STAT1 se asocia con el promotor IRF-1 tras la estimulación de IFNγ⁸, pero nuestro análisis enChIP-SILAC no detectó STAT1 como una proteína inducida para interactuar con esta región genómica¹⁶. Además, en el análisis enChIP-MS de los telómeros, no detectamos proteínas shelterina formadas por TRF-1 y TRF-2¹⁵, que han demostrado interactuar con los telómeros²⁶. Hay algunas razones potenciales para estas discrepancias. Primero, la estequiometría de unión de Stat1 al promotor IRF-1 podría ser muy baja. Es razonable que enChIP-MS, incluido enChIP-SILAC, detecte proteínas que están más abundantemente asociadas con regiones genómicas diana; por lo tanto, podría ser necesario el análisis de más células para detectar estas proteínas. Los aumentos en las sensibilidades de los instrumentos de MS también contribuirían a la detección eficiente de proteínas con baja unión estequiométrica. En segundo lugar, algunas proteínas, posiblemente incluyendo Stat1 y shelterinas, podrían ser objetivos difíciles para los análisis de EM. En tercer lugar, en nuestro análisis de las proteínas de unión a telómeros¹⁵, las proteínas 3×FLAG-TAL que reconocen los telómeros (3×FN-Tel-TAL) podrían haber bloqueado la unión de las shelterinas a los telómeros de manera competitiva.

En contraste con la dificultad relativa de detectar factores de transcripción que se unen a regiones genómicas específicas utilizando enChIP, identificamos con éxito reguladores epigenéticos como las enzimas de modificación de histonas utilizando análisis de enChIP. El éxito de esta técnica puede deberse al hecho de que los reguladores epigenéticos se unen a una amplia gama de regiones genómicas; por lo tanto, hay más proteínas disponibles por región genómica para la EM. Debido a que los reguladores epigenéticos se reconocen cada vez más como objetivos importantes para los medicamentos contra enfermedades intratables como el cáncer, enChIP sería una herramienta útil para la identificación de objetivos epigenéticos de fármacos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Servicio de síntesis gBlock	Life	Technologies Gene Synthesis by GeneArt
Servicio de síntesis gBlock	IDT (Integrated DNA Technologies)	gBlocks Fragmentos de
pSIR-neo	Addgene	51128
pSIR-GFP	Addgene	51134
pSIR-DsRed-Express2	Addgene	51135
pSIR-hCD2	Addgene	51143
Servicio de síntesis TAL	Life Technologies	GeneArt Precision TALs
3xFLAG-dCas9/pCMV-7.1	Addgene	47948
3× FLAG-dCas9/pMXs-puro	Addgene	51240
3× FLAG-dCas9/pMXs-IG	Addgene	51258
3× FLAG-dCas9/pMXs-I2	Addgene	51259
3× FLAG-dCas9/pMXs-neo	Addgene	51260
anti-FLAG M2 Ab	Sigma-Aldrich	F1804
anti-FLAG conjugado por FITC M2	Sigma-Aldrich	F4049
Medio DMEM para SILAC	Life Technologies	89985	Otro medio se puede comprar en Life Technologies
FBS dializado para SILAC	Life Technologies	89986
L-Lisina-2HCl para SILAC	Life Technologies	89987	Para Medio Ligero
L-Arginina-HCl para SILAC	Life Technologies	89989	Para Medio Ligero
L-Lisina-2HCl, 13C6 para SILAC	Life Technologies	89988	Para Medio Pesado
L-Arginina-HCl, 13C6, 15N4 para SILAC	Life Technologies	89990	Para Medio
Pesado Completo, mini, Sin EDTA	Roche Diagnostics	4693159
disruptor ultrasónico UD-201	Tomy Seiko
ChIP DNA Clean & Concentrador	Zymo Research	D5205
Dynabeads-Protein G	Life Technologies	DB10004
Inhibidor de RNasin Plus RNasa	Promega	N2611
Isogen II	Nippon Gene	311-07361
Direct-zol RNA Miniprep kit Zymo	Research	R2050
LTQ Orbitrap Velos	Thermo Fisher Scientific		Un componente de un sistema nanoLC-MS/MS para el análisis de MS
nanoLC	Advance, Michrom Bioresources		Un componente de un sistema nanoLC-MS/MS para el análisis de MS
Automuestreador HTC-PAL	CTC Analytics		Un componente de un sistema nanoLC-MS/MS para el análisis de MS