Control óptico de células vivas Actividad Eléctrica por conjugadas Polímeros

Resumen

Se describe un método para la estimulación de la actividad eléctrica de cultivos celulares in vitro con luz visible, basado en el uso de polímeros semiconductores orgánicos.

Resumen

Las interfaces híbridas entre semiconductores orgánicos y tejidos vivos representan una nueva herramienta para aplicaciones in vitro e in vivo. En particular, los polímeros conjugados muestran varias propiedades óptimas como sustratos para sistemas biológicos, como buena biocompatibilidad, excelentes propiedades mecánicas, tecnología de procesamiento barata y fácil y posibilidad de deposición en sustratos ligeros, delgados y flexibles. Estos materiales se han empleado para interfaces celulares como sondas neuronales, transistores para la excitación y el registro de la actividad neuronal, biosensores y actuadores para la liberación de fármacos. Experimentos recientes también han demostrado la posibilidad de utilizar polímeros conjugados para la modulación totalmente óptica de la actividad eléctrica de las células. Se han reportado varios casos de estudio in vitro, incluyendo redes neuronales primarias, astrocitos y células de línea secundaria. Además, se ha demostrado que la fototransducción de señales mediada por polímeros orgánicos restaura la sensibilidad a la luz en retinas degeneradas, lo que sugiere que estos dispositivos pueden usarse para prótesis de retina artificial en el futuro. Con todo, los polímeros conjugados sensibles a la luz representan un nuevo enfoque para la modulación óptica de la actividad celular.

En este trabajo, se describen todos los pasos necesarios para fabricar una interfaz de biopolímero para la excitación óptica de células vivas. La función de la interfaz activa es transducir el estímulo luminoso en una modulación del potencial de membrana celular. Como caso de estudio, útil para estudios in vitro, se utiliza una película delgada de politiofeno como capa funcional que absorbe la luz, y se emplean células de riñón embrionario humano (HEK-293) como componente biológico de la interfaz. Se proporcionan ejemplos prácticos de control exitoso del potencial de membrana celular tras la estimulación con pulsos de luz de diferente duración. En particular, se ha demostrado que tanto los efectos despolarizantes como los hiperpolarizantes sobre la membrana celular pueden lograrse dependiendo de la duración del estímulo luminoso. El protocolo reportado es de validez general y puede extenderse directamente a otras preparaciones biológicas.

Introducción

La posibilidad de manipular la actividad celular con una resolución espacial y temporal precisa representa una estrategia clave en la investigación neurocientífica y en el tratamiento de trastornos neurológicos y psiquiátricos. ¹ Los métodos tradicionales se basan en la estimulación eléctrica de las células utilizando electrodos colocados en la proximidad o en contacto con el sistema de destino, ² que puede ser de diferente complejidad (una sola célula, red celular, rodajas de cerebro, in vivo tejidos cerebrales). Durante el siglo pasado, el uso de patch-clamp, metal y electrodos de sustrato integrado han proporcionado una imagen detallada de la fisiología y la fisiopatología de las neuronas individuales y de los mecanismos de funcionamiento de las redes neuronales. Sin embargo, la estimulación eléctrica sufre de limitaciones importantes. La primera de ellas está relacionada con una generalmente pobre resolución espacial debido a las dimensiones físicas de los electrodos y su geometría fija, que no se pueden adaptar fácilmentea los sistemas organizados complejos como los tejidos biológicos. Además, los problemas relacionados con la impedancia de los electrodos y de la diafonía entre los sistemas de estimulación y de registro se pueden deteriorar la relación final de señal a ruido de las mediciones. ³ Por otro lado, el uso de la luz para la estimulación puede ayudar a superar muchas limitaciones del enfoque eléctrica. En primer lugar, ofrece espacial sin precedentes (<1 m) y la resolución temporal (<1 ms), por lo que es posible dirigir tipos de células específicas e incluso compartimentos de células sub. Además, es altamente no invasivo ya que evita cualquier contacto físico con el tejido de interés y desenreda la estimulación de grabación. Además, tanto la intensidad de luz de longitud de onda y se pueden regular con precisión y por lo tanto diversos protocolos de estimulación se pueden aplicar. ^3,4

Sin embargo, la gran mayoría de las células animales no presentan ninguna sensibilidad específica a la luz. Varias estrategias para stimulatio óptican por lo tanto se han propuesto, ya sea explotando mediadores moleculares sensibles a la luz cerca o dentro de las células, o el uso de dispositivo de fotoactivo colocado externamente, cerca de la célula. La primera categoría se refiere a los mecanismos endógenos como el estímulo a través de (IR) de luz visible o infrarroja, así como el uso de cualquiera de los compuestos fotoisomerizables / fotoescindible o la expresión genética de los actuadores moleculares fotosensibles (optogenética). La última clase incluye técnicas para la estimulación exógena logrado con el uso de nano / micro-partículas inorgánicas o sustratos de silicio fotoconductores. ⁵ Sin embargo, todos estos sistemas tienen lados brillantes e inconvenientes. En particular, la absorción endógena de las células en el rango visible es débil y no fiable, y la generación concomitante de especies reactivas de oxígeno puede ser perjudicial para la célula. En general, IR se utiliza para inducir el calentamiento térmico local debido a la absorción de agua, pero el coeficiente de extinción de agua es pequeño, por lo que requiere stluz infrarroja rong (de decenas a cientos de W / mm ^2), que es difícil de administrar a través de la óptica del microscopio estándar y puede plantear problemas de seguridad para aplicaciones en vivo. Por otra parte, los compuestos de introducción en jaulas foto-conmutable tienen una acción limitada en el tiempo y, a menudo requieren de luz UV que es difícil de entregar debido a la penetración de tejido limitado. Además sufren de problemas de difusión de los compuestos activados sobre la fotólisis fuera de la zona iluminada. Por último, las herramientas de optogenética han permitido a los científicos para apuntar subpoblación celular específica y sub-compartimientos y están emergiendo rápidamente como una de las tecnologías clave en la investigación neurocientífica. Sin embargo, la inserción de un segmento de ADN exógeno a través de un vector viral plantea problemas de seguridad importantes, sobre todo en vista de la adopción en pacientes humanos. ^5,6 Por estas razones, la investigación sobre nuevos materiales y dispositivos capaces de manipulación óptica celular es un tema muy caliente.

Recientemente, una novela, se ha propuesto enfoque basado en el uso de polímeros conjugados sensibles a la luz, capaces de transducir eficientemente un estímulo óptico en una modulación de la actividad eléctrica celular. La estimulación de células por Polymer fotoexcitación (CSPP) técnica explota muchas características clave que permite típica de los semiconductores orgánicos: son intrínsecamente sensible a la luz en el rango visible; ⁷ que son biocompatibles, suave y conformable, y su flexibilidad mecánica permite una interfaz íntimo con el tejido tanto in vitro e in vivo ^8-10. Aparte de eso, pueden ser fácilmente funcionalizados para adaptarse mejor a la interfaz con las células vivas, y para permitir la excitación específica, sondeo y detección de capacidades. ^11,12 Además, soporte electrónico, así como el transporte iónico, lo que es ideal para la combinación del anuncio de la electrónica de la biología. ^13,14 Curiosamente, pueden trabajar en modo fotovoltaico, evitando la necesidad de aplicar un sesgo f exterioro la estimulación óptica celular eficiente. ¹⁵

La fiabilidad de la técnica CSPP se ha demostrado previamente en varios sistemas, incluyendo las neuronas primarias, ^{15,16 astrocitos,} 17 líneas de células secundarias ¹⁸ y los tejidos de la retina explantadas. ¹⁶ En este trabajo, todas las medidas necesarias para fabricar un bio-polímero sensible a la luz interfaz ¹⁹ para la estimulación óptica de los sistemas in vitro se describen en detalle. Como caso de estudio, una mezcla fotovoltaica orgánica prototípico de la región regulares poli (3-hexiltiofeno) (rr-P3HT), que funciona como el donador de electrones, y éster fenil-C61-butírico-ácido-metilo (PCBM), que actúa como el se emplea aceptor de electrones. A medida que el sistema biológico, se usan células embrionarias humanas de riñón (HEK-293). Se proporciona un ejemplo de un protocolo fotoestimulación con la grabación relativa de la actividad celular a través de mediciones electrofisiológicas.

La plataforma descritaSin embargo, es de validez general, y se puede extender fácilmente a la utilización de otros polímeros conjugados (ajustando correctamente el proceso de solución de la preparación y los parámetros de deposición), diferentes tipos de células (cambiando adecuadamente el protocolo de cultivo celular, procedimiento y tiempo solicitado chapado para la siembra y la proliferación celular) y diferentes protocolos de estimulación (longitud de onda de luz, de frecuencia estímulos y duración, densidad fotoexcitación).

Protocolo

1. Preparación de fotoactivos Sustratos

1. Preparar una P3HT: PCBM solución (1: 1 w / w) en clorobenceno a una concentración de 20 g P3HT / L. Mezclar la solución con un agitador magnético durante al menos 4 horas a 60 ° C. Considere un volumen de 150 l de solución para cada sustrato que se preparó.
2. Limpiar los portaobjetos de vidrio recubiertos con ITO (R = 10 Ω _s / sq, 18x18 mm ^2, el espesor de 170 micras) con baños consecutivos de agua desionizada, acetona e isopropanol en un aparato de ultrasonidos (10 min para cada paso). Seque el cubreobjetos con una pistola de nitrógeno. Poner las muestras en un limpiador de plasma a 100 W de potencia durante 10 min.
3. Deposita una fina capa de la capa activa en los sustratos limpios a través de spin-coating.
   1. Con una punta de diamante, corte un portaobjetos de vidrio de microscopio, (espesor ≈ 1 mm) para las mismas dimensiones laterales de los sustratos recubiertos de ITO. Retire la P3HT: solución PCBM de la placa de cocción y deje que se enfríe a temperatura ambiente.
   2. Set de dos-steps programa spin-revestidor: i) 30 segundos a 800 rpm; ii) 30 segundos a 1.600 rpm. Posicionar el cursor en el mandril de la escisión revestidor e iniciar el vacío para arreglarlo. Ponga una gota de acetona en la diapositiva y, a continuación el sustrato limpiado, con la cara recubierta con ITO hacia arriba. Inicie el giro spin-recubridora para deshacerse del exceso de acetona.
   3. Poner 150 ml de P3HT: solución PCBM sobre los sustratos y empezar de nuevo el spin-revestidor (usar el mismo protocolo descrito en 1.3.2).
   4. Después de la escisión revestidor ha terminado, retire la muestra y separar cuidadosamente el sustrato revestido de la lámina de vidrio. Limpiar la parte posterior del sustrato con un hisopo de sala limpia por inmersión en acetona.
      Nota: Los sustratos fotoactivos se pueden almacenar durante algunos días en una caja oscura hasta su uso. Para períodos más largos, los mantienen en una guantera con gas inerte.

2. Preparación de cultivos celulares de media y Electrofisiología Soluciones

1. Preparar el medio de crecimiento completo (CGM) paraHEK-293 células: Dulbecco medio de Eagle modificado (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) inactivado por calor no, 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina. Esterilizar el medio de un sistema de 0.2 micras de filtración y se almacena a 4 ° C.
2. Preparar la solución extracelular en agua ultrapura (concentraciones en mM): 135 NaCl, 5,4 KCl, 5 HEPES, 10 glucosa, 1,8 CaCl _2, 1 de MgCl _2. Ajustar el pH a 7,4 con NaOH. Esterilizar la solución con un sistema de 0.2 micras de filtración y se almacena a 4 ° C.
3. Preparar la solución intracelular en agua ultrapura (concentraciones en mM): 12 KCl, 125 K-gluconato, 1 _MgCl2, 0,1 CaCl _2, 10 EGTA, 10 HEPES, 10 ATP-Na _2. Tenga en cuenta que la ATP-Na ₂ es sensible al calor y agregarlo pasado. Ajustar el pH a 7,4 con NaOH. Esterilizar la solución con un sistema de 0.2 micras de filtración, la alícuota en 1 ml tubos y almacenar a -20 ° C.

3. Revestimiento HEK-293 célulassobre los sustratos activos

1. Coloque el sustrato fotoactivo en un vaso de precipitados de vidrio cubierto con aluminio o un plato Petri cerrada y poner en un horno a 120 ° C durante 2 hr para la esterilización. Desde este momento en adelante, realizar todas las operaciones en condiciones estériles. Poner las muestras en una campana estéril y dejar enfriar.
2. Revestir el sustrato fotoactivo con una capa de adhesión para reducir la hidrofobicidad de la superficie y para promover la adhesión celular.
   1. Coloque los sustratos activos en un P35 placa Petri o una placa de múltiples pocillos 6. Dada la hidrofobicidad de la capa de polímero conjugado, hacer un polidimetilsiloxano (PDMS) para fijar bien la muestra y confinar las soluciones.
      1. Mezclar PDMS y el catalizador en un 10: 1 proporción con una varilla de vidrio para obtener una suspensión viscosa.
      2. Se vierte la suspensión en una placa de múltiples pocillos 6, dispensando una cantidad suficiente para cubrir la mitad de cada pocillo.
      3. Espere a que la polimerización PDMS a RT.
      4. Cortar las PDMS curados en el centro para obtanando una forma cuadrada de la misma dimensión de la muestra de polímero.
      5. Esterilizar el PDMS pozos por inmersión en una mezcla de etanol-agua 70% durante al menos 30 min.
   2. Si bien el uso de los PDMS, rayar la capa fotoactiva a lo largo de toda la frontera del pozo con pinzas puntiagudas, con el fin de evitar el desprendimiento de toda la capa cuando la eliminación de los PDMS bien después de cultivo de células.
   3. Cubrir toda la superficie de cada muestra con una solución de fibronectina (2 mg / L en PBS). Un volumen de entre 500 a 750 l por muestra suele ser suficiente si un PDMS también se utiliza (superficie transparente del pozo: 15x15 mm ^2). Sin los PDMS así, alrededor de 2 ml de solución de fibronectina son necesarios para sumergir completamente la muestra; prestar atención a que el sustrato no flota, mientras que la adición de la solución. Incubar las muestras a 37 ° C durante al menos 1 hr.
   4. Eliminar la solución de fibronectina con una pipeta de vidrio y lavar una vez con 2 ml de PBS.
3. Plcomió HEK-293 células en las muestras tratadas con fibronectina a una densidad de 15.000 células / ^cm2 en medio de crecimiento completo. Use un volumen de 750-1.000 l de CGM para cada muestra si un PDMS también se utiliza, en caso contrario 2-3 ml de CGM son necesarios. Se incuban las células a 37 ° C y _5% de CO2 durante 24 a 48 horas.

4. protocolo de estimulación óptica y electrofisiológicos mediciones

1. Ponga la solución extracelular en un baño de agua a 37 ° C a termalizar; descongelar la solución intracelular, lo puso en una jeringa de 1 ml con una aguja de calibre 34 y mantenerlo en contacto con el hielo para evitar la degradación del ATP.
2. Tome un sustrato celular recubierto de la incubadora, retirando cuidadosamente los PDMS bien si está presente. Retire el medio de cultivo con una pipeta de vidrio y enjuague la muestra con solución extracelular. Proceda lentamente para evitar el desprendimiento de células.
3. Ponga el dispositivo en la muestra-titular de la estación de electrofisiología con solutio extracelularn y el electrodo de referencia. Preparar micropipetas de vidrio frescos para patch-clamp con un extractor (resistencia ideal es en el rango de 2-4 mO). Llene la mitad de la pipeta con solución intracelular y montarlo en el micromanipulador.
4. Busque una célula sana parchear en el dispositivo. Para evitar la excitación no deseada del sustrato fotoactivo, utilice iluminación IR para formación de imágenes, la colocación de un filtro de paso de longitud de onda larga (por ejemplo, un corte de longitud de onda λ = 750 nm se puede utilizar para los polímeros que absorben en el visible) en frente de la iluminador de microscopio.
5. Parche la celda seleccionada y aplicar el protocolo deseado para la estimulación óptica mediante la entrega de la luz a la muestra a través de la trayectoria de excitación de fluorescencia del microscopio (Figura 1). Una descripción detallada del protocolo de patch-clamp se puede encontrar en la referencia 20.
   1. Coloque el parche pipeta en estrecha proximidad a la membrana celular con un manipulador micrométrica. Durante el posicionamiento, aplicar overpressure para la pipeta con el fin de evitar que se pegue la suciedad en la punta. La pipeta debe ser pocas micras por encima de la célula.
   2. Empezar a bajar la pipeta hacia la membrana celular mientras se controla la resistencia de la pipeta en el software de control de parche. Cuando la resistencia de la pipeta se ha incrementado aproximadamente 1 MW, eliminar la sobrepresión de la pipeta mientras se aplica una succión suave, con el fin de formar el gigaseal entre la pipeta y la membrana celular (es decir, la resistencia medida debe aumentar a valores mayores que 1 GΩ) .
   3. Aplicar un potencial negativo de la pipeta cerca de la celda esperada potencial de reposo (por HEK293 célula un potencial de -40 mV se puede utilizar) para ayudar a estabilizar el sello. Compensar los transitorios capacitivos debido a la capacitancia pipeta con los comandos relativos sobre el amplificador de parches y / o el software de control de parches.
   4. Romper la membrana para permitir el acceso eléctrico a la citoplasma de la célula mediante la aplicación de una breve e intensa del pulso de succióna la pipeta. Ajuste el amplificador de patch al modo de pinza de corriente (I = 0, es decir, sin corriente inyectada en la célula) para realizar el seguimiento del potencial de la membrana celular. Esperar unos minutos para ver si el potencial de la pila es estable.
   5. Aplicar el protocolo de iluminación deseada a la célula y registrar el efecto sobre el potencial de membrana.
      Nota: La iluminación puede ser entregado a la muestra ya sea desde la parte inferior o desde la parte superior, dependiendo de la arquitectura microscopio.
      1. Seleccione una longitud de onda de excitación que es bien absorbido por el material activo; para la P3HT: PCBM mezcla, una longitud de onda en el intervalo de 450-600 nm se puede utilizar. Fotoexcitación densidades adecuadas están en el rango de 10-100 mW / mm ^2.
         Nota: pulsos cortos de luz (por debajo de 10 a 20 ms) resultan en una despolarización transitoria de la célula, mientras que con la iluminación prolongada (cientos de milisegundos o pulsos más largos) se observa una hiperpolarización sostenida hasta que la luz se apaga.

Resultados

Las células pueden ser fácilmente cultivadas en P3HT: PCBM sustratos, siempre que una capa de adhesión se deposita adecuada (como la fibronectina utilizado en la etapa 3.2 del protocolo descrito). P3HT: PCBM picos de absorción óptica en la parte verde del espectro visible; Sin embargo, otros polímeros conjugados sensibles a la luz se pueden seleccionar, de acuerdo con el rango de longitudes de onda de fotoestimulación preferida (Figura 2). Biocompatibilidad de estos sust...

Discusión

Los pasos críticos del protocolo reportado para in vitro estimulación óptica de células concierne principalmente la elección del polímero sensible a la luz, los parámetros de esterilización térmica, la intensidad y la duración de los estímulos luminosos. Un P3HT: película delgada PCBM fue seleccionado aquí, ya que garantiza una buena estabilidad temporal y electroquímica. Sin embargo, hay que notar que no todos los polímeros sensibles a la luz pueden ofrecer interpretaciones analógicas, ²² más especí...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
rr-P3HT	Sigma Aldrich	698989-5G
Sustratos recubiertos de ITO	Nano-CS	IT10300100
Fibronectina	Sigma Aldrich	F1141
clorobenceno	Sigma Aldrich	319996
PCBM	Nano-C	Nano-CPCBM-BF
acetona	Sigma Aldrich	270725
alcohol isopropílico	Sigma Aldrich	563935
células HEK	Normas LGC srl	ATCC-CRL-1573
HEPES	Sigma Aldrich	H0887
PBS	Sigma Aldrich	P5244
E-MEM	Normas LGC srl	ATCC-30-2003
EDTA	Sigma Aldrich	E8008-FBS
	LGC standards srl	ATCC-30-2020