La identificación de los blancos directos de moléculas del genoma de metas sigue siendo un reto importante. Para entender cómo las moléculas de unión al ADN involucran el genoma, hemos desarrollado un método que se basa en la reticulación de moléculas pequeñas para aislar la cromatina (cósmica).
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Artículo de método
Mapeo de todo el genoma de la droga-ADN interacciones en células con COSMIC (reticulación de pequeñas moléculas para aislar la cromatina)
En este artículo
Resumen
Resumen
El genoma es el objetivo de algunos de los agentes quimioterapéuticos más eficaces, pero la mayoría de estos fármacos carecen de especificidad de secuencia de ADN, que conduce a la toxicidad limitante de la dosis y muchos efectos secundarios adversos. Targeting el genoma con pequeñas moléculas específicas de secuencia puede permitir moléculas con el aumento del índice terapéutico y menos efectos fuera de objetivo. -methylpyrrole N / N poliamidas metilimidazol son moléculas que pueden ser racionalmente diseñados para dirigir las secuencias de ADN específicas con exquisita precisión. Y a diferencia de la mayoría de los factores de transcripción naturales, poliamidas pueden unirse al ADN metilado y cromatinizados sin una pérdida en la afinidad. La especificidad de secuencia de poliamidas ha sido ampliamente estudiado in vitro con la identificación del emplazamiento cognado (CSI) y con los enfoques bioquímicos y biofísicos tradicionales, pero el estudio de poliamida unión a dianas genómicas en las células sigue siendo difícil de alcanzar. Aquí mostramos un método, la reticulación de moléculas pequeñas a Isolate cromatina (cósmica), que identifica los sitios de unión de poliamida en todo el genoma. Cósmico es similar a inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), pero difiere en dos aspectos importantes: (1) un fotoentrecruzador se emplea para permitir la captura selectiva, controlada temporalmente de eventos de unión de poliamida, y (2) el asa de afinidad biotina se utiliza para purificar poliamida conjugados -ADN en condiciones semi-desnaturalizante para disminuir ADN que es no covalentemente. Cósmico es una estrategia general que puede ser utilizado para revelar los eventos de unión en todo el genoma de poliamidas y otros agentes quimioterapéuticos del genoma de metas.
Introducción
La información para hacer cada célula en el cuerpo humano está codificado en el ADN. El uso selectivo de la información que gobierna el destino de una célula. Los factores de transcripción (TFS) son proteínas que se unen a secuencias específicas de ADN para expresar un subconjunto particular de los genes en el genoma, y el mal funcionamiento de TFS está vinculada a la aparición de una amplia gama de enfermedades, incluyendo defectos de desarrollo, el cáncer y la diabetes 1,2. Hemos estado interesados en el desarrollo de moléculas que pueden unirse selectivamente al genoma y modular las redes de regulación de genes.
Poliamid....
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Protocolo
1. La reticulación en células vivas
- Comience con ~ 2.5x10 7 células H1, u otras células cultivadas.
NOTA: Este número de células H1 corresponde a cinco platos de 10 cm (aproximadamente 40% de confluencia). - Cultivar las células en medios E8 en placas revestidas en una superficie que soporta las células madre pluripotentes (ver Lista de Materiales), y se incuba a 37 ° C en ambiente humidificado del 5% de CO 2. Células Cosecha enzimáticamente (ver Lista de Materiales). Nota: No permita que las células H1 excedan el 90% de confluencia; confluencia induce la diferenciación espontánea de células H1. Para contar las célula....
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Resultados
Para tener en cuenta la fragmentación del genoma no uniforme y otras variables, el ADN purificado siempre debe ser normalizado contra una referencia de ADN de entrada. Los cebadores específicos de un locus de interés pueden ser utilizados. Es útil también para analizar un locus donde no se espera que la molécula para unirse, como un control negativo. Vemos un incremento> 100 veces en la ocupación de poliamida tras la irradiación con luz de 365 nm (Figura 2).
Enriquecido A.......
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Discusión
Uno de los principales desafíos con ChIP convencional es la identificación de anticuerpos adecuados. ChIP depende en gran medida de la calidad del anticuerpo, y la mayoría de los anticuerpos comerciales son inaceptables para ChIP. De hecho, el consorcio Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) encontró que solo el 20% de los anticuerpos comerciales son adecuados para los ensayos de ChIP. 50 Con COSMIC, los anticuerpos son reemplazados por estreptavidina. Debido a que las poliamidas se funcionalizan con biotina, l.......
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Divulgaciones
A.Z.A. es el único propietario de Vista Motif, LLC y WINStep Forward.
Agradecimientos
Agradecemos a los miembros del laboratorio Ansari y al Prof. Parameswaran Ramanathan por sus útiles discusiones. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los NIH CA133508 y HL099773, la beca de la facultad H. I. Romnes, y el Premio de Investigación Médica W. M. Keck a A.Z.A. G.S.E. fue apoyado por una beca Peterson del Departamento de Bioquímica y Biociencias Moleculares Subvención de Capacitación NIH T32 GM07215. A.E. fue apoyado por la beca de posgrado Morgridge y la beca del Centro de Células Madre y Medicina Regenerativa, y D.B. recibió el apoyo de la beca NSEC de NSF.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) | cualquier fuente | ||
| Benbenzamidina | cualquier fuente | ||
| Pepstatina | cualquier fuente | ||
| Proteinasa K | cualquier fuente | ||
| Dynabeads MyOne Estreptavidina C1 | Life Technologies | 65001 | |
| PBS, pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | Se pueden utilizar otras fuentes |
| : StemPro, Accutase, Reactivo de disociación celular | Life Technologies | , A1110501 | |
| QIAquick PCR Kit de purificación | Qiagen | 28104 | Hemos probado con éxito otros fabricantes de columnas de ADN. |
| Kit de preparación de muestras TruSeq ChIP | Illumina | IP-202-1012 | Este kit se puede utilizar para preparar el ADN COSMIC para la secuenciación de próxima generación |
| Matrigel Matriz de membrana basal | BD Biosciences | 356231 | Se utiliza para recubrir placas con el fin de cultivar ESC H1 Papel de |
| microcentrífuga ámbar | cualquier | ||
| cualquier fuente | |||
| Filtro Pyrex | Cualquier fuente | Los platos para hornear Pyrex son adecuados | |
| Mezcla maestra de qPCR | Cualquier fuente | ||
| RNasa | cualquier fuente | ||
| HCl (6 N) | cualquier fuente | ||
| Placas de cultivo de tejidos de 10 cm Cualquier | fuente | ||
| Pipetas serológicas | cualquier fuente | ||
| Pipetas Pasteur de | cualquier fuente | ||
| Puntas de pipeta | de cualquier fuente | ||
| Tubos cónicos de 15 ml | fuente | ||
| Microcentrífuga | Cualquier fuente | ||
| Nutator | cualquier fuente | ||
| Magnético Bastidor de separación | cualquier fuente | ||
| Fuente UV | CalSun | B001BH0A1A | Se pueden utilizar otras fuentes UV, pero el tiempo de reticulación debe optimizarse empíricamente |
| Misonix Sonicator | Qsonica | S4000 con bocina de copa 431C1 | pueden utilizar otros sonicadores, pero las condiciones de sonicación deben optimizarse empíricamente |
| Incubadora de CO2 humidificada | cualquier fuente | ||
| Cabina de seguridad biológica con salida de vacío | cualquier fuente |
Referencias
- Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional Regulation and Its Misregulation in Disease. Cell. 152, 1237-1251 (2013).
- Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S. K., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. A census of human transcription factors: function, expression and evolution. Nat Rev Genet<....
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Reimpresiones y permisos
