Clonación funcional utilizando una<em&gt; Xenopus</em&gt; Sistema de Expresión de ovocitos

Resumen

Describimos un sistema de ovocitos y capuchones animales de Xenopus para la clonación de expresión de genes capaces de inducir una respuesta en ectodermo competente, y discutimos técnicas para el análisis posterior de dichos genes. Este sistema es útil en la identificación funcional de una amplia gama de productos génicos.

Resumen

La identificación de genes responsables de la inducción embrionaria plantea una serie de desafíos; por nombrar algunos, las moléculas secretadas de interés pueden ser bajas en abundancia, pueden no ser secretadas sino estar atadas a la(s) célula(s) señalizadora(s), o pueden requerir la presencia de socios de unión o moléculas reguladoras aguas arriba. Por lo tanto, en la búsqueda de productos genéticos capaces de provocar una respuesta inductiva temprana del cristalino en un ectodermo competente, utilizamos un sistema de clonación de expresión que permitiría la identificación de factores paracrinos o yuxtacrinos, así como proteínas transcripcionales u otras proteínas reguladoras. Se inyectaron grupos de ARNm en los ovocitos de Xenopus y el tejido que respondió se colocó directamente sobre los ovocitos y se realizó un cocultivo. Después de la clonación funcional de ldb1 a partir de una biblioteca de ADNc en etapa de placa neural basada en su capacidad para provocar la expresión del marcador de placa del lente temprano foxe3 en el ectodermo de la tapa animal competente para el lente, caracterizamos el patrón de expresión del ARNm y analizamos la progresión del desarrollo después de la sobreexpresión o el derribo de ldb1. Este sistema es adecuado en una amplia variedad de contextos en los que se busca la identificación de un inductor o sus moléculas reguladoras aguas arriba utilizando una respuesta funcional en tejido competente.

Introducción

Los enfoques genéticos avanzados para identificar genes de interés a través de su función o pérdida de función^1,2 son una parte integral de la comprensión de eventos de patrones complejos en el desarrollo. Junto con las poderosas técnicas de genética inversa disponibles para una gama cada vez más amplia de sistemas e investigadores^3-5, ahora es posible identificar genes con un papel funcional clave en una vía y luego dilucidar esa función a nivel celular y en interacción con otros productos génicos. Un enfoque para la identificación funcional de genes de interés que ha producido muchos hallazgos clave en el pasado es la clonación de expresión

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por la Universidad de Virginia Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión.

Nota: La figura 1 muestra una vista general esquemática de los procedimientos experimentales.

1. Preparación de ovocitos

1. X. Pre-prime laevis hembras con 150 U de Mare embarazada suero de gonadotropina (PMSG) aproximadamente una semana antes de que el aislamiento de los ovocitos. Inyectar 1 ml 150 U / ml PMSG en dorsal linfático salida con 1 cc jeringa estéril con 29 G aguja.
2. Preparar soluciones pa....

Resultados

En respuesta a la expresión del ARNm inyectado en oocitos, respondiendo tejido casquillo animal se sometió a ensayo para la expresión de Otx2 mediante hibridación in situ (Figura 2 y Tabla 1); Otx2 se expresa en el ectodermo lente presuntiva (PLE) a partir de cierre del tubo neural a través de placoda del cristalino engrosamiento ^19. Sin embargo, desde Otx2 se expresa también en el ectodermo neural anterior, así como la cabe.......

Discusión

El método descrito aquí para la clonación funcional de genes capaces de inducir una respuesta en ectodermo competente puede ser usado para identificar una amplia gama de productos génicos. Este método se expande al trabajo anterior mediante la combinación de los ensayos de inducción de tejido con técnicas de clonación de expresión. Utilizamos las vías metabólicas de Xenopus el ovocito como una fuente de producción de factores de inducción de, directa o indirectamente, después de la inyección de ARN. Esto, en co.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
12/101	Banco de hibridomas	12/101	Anticuerpo monoclonal para la detección de tejido muscular
20x SSC Buffer	Sigma	S6639	para ISH
Anhídrido acético	Sigma	A6404	para ISH
Anti-Dig-AP	Roche	11093274910	para ISH
Aurum Plasmid Mini Kit	Bio-Rad	732-6400	Purificación de ADN plasmídico
Reactivo de bloqueo	Roche	11096176001	para ISH
BM Purple	Roche	11442074001	para ISH
Boekel Horno de hibridación	Fisher Scientific	13-245-121	para ISH
Bouin's Solution	Sigma	HT10132	para ISH
BSA	Sigma	A9647	para OCM
CHAPS	Sigma	C3023	para ISH
Colagenasa A	Roche	10103578001	Desfoliculación de ovocitos
Cisteína	Sigma	C121800	Embriones de Dejelly
DEPC-H2O	Fisher Scientific	BP5611	para ISH
Mezcla de marcaje de ARN Dig Roche		11277073910	para sondas ISH
Pinzas Dumont #5	World Precision Instruments	500233	para envoltura Vitelline
3-aminobenzoato de etilo	Sigma	A5040	MS222 anestésico
Ficoll PM 400	Sigma	F4375	para medios de inyección
Formamida	Sigma	F9037	para ISH
Sulfato de gentamicina	Sigma	G1914	para OCM
Capilares de vidrio	World Precision Instruments	4878	3,5" de largo, I,D, 0,530 mm
Viales de muestra de vidrio	Fisher Scientific	06-408B	para ISH
Hair loop			Pelo adherido en pipeta Pasteur para la manipulación de tejidos
Sal sódica de heparina	Sigma	H4784	para inyector ISH
Nanoliter 2010	World Precision Instruments	Nanoliter 2010	Microinyector controlado por microprocesador
Instant Ocean	Carolina	972433	Aquarium Sal para la recuperación de ranas
IRBG XGC Xenopus verificado de longitud completa cam cDNA	Source Bioscience	989_IRBG	cDNA library
Placas de agar LB con 100 µ g/ml Ampicilina	Teknova	L5004	Placas LB-Amp prevertidas de 150 mm para la selección de hermanos
LB Luria Caldo	Teknova	L8650	LB para la recolección de colonias en la selección de hermanos a partir de placas y dilución de cultivos Kit de aislamiento magnético
ARNm	New England BioLabs	S1550S	para el aislamiento de ácido maleico de ARN enriquecido con poli(A)
	Sigma	M0375	para ISH
Micromanipulador manual Microfil	World Precision Instruments	M3310R	Micromanipulador manual
Mezclador nutante	Fisher Scientific	22-363-152	Balancín para ISH
Permoplast	Nasco SB33495M		Arcilla para placas de inyección y disección
Salina tamponada con fosfato	Sigma	P5368	para ISH
PMSG	Sigma	G4877	para estimular el desarrollo de los ovocitos
Polivinilpirrolidona	Sigma	PVP40	para
ISH Extractor programable	World Precision Instruments	PUL-1000	Extractor de agujas de micropipeta
Proteinasa K	Sigma	P6556	para ISH
pTnT Vector	Promega	L5610	Construcción de la biblioteca de ADNc
Sistema de combinación Riboprobe	Promega	P1450	in vitro transcripción
Superíndice Kit de construcción de bibliotecas de ADNc de longitud completa	Kit	18248013	Life Technologies para la construcción de bibliotecas de ADNc
Suturas, seda 3-0	Fisher Scientific	19-037-516	Hilo y aguja de sutura para la extracción post-ovocito
Torula RNA	Sigma	R3629	para ISH
Trietanolamina	Sigma	T1502	para ISH
Tween 20	Sigma	P9416	para
el sistema de síntesis de ADNc RiboClone universal	ISH Promega	C4360	kit alternativo para la construcción de bibliotecas de ADNc
Clones de entrada ORF completos de Xenopus - ORProfuente de colaboración	Bioscience	5055_XenORFeome	ORFeome clones
XL2-Blue Células ultracompetentes	Agilent Technologies	200150	células para la transformación de ADNc biblioteca

Estudios de desarrollo de anticuerpos de de