Clonación funcional utilizando una Xenopus Sistema de Expresión de ovocitos

Summary

Describimos un sistema de ovocitos y capuchones animales de Xenopus para la clonación de expresión de genes capaces de inducir una respuesta en ectodermo competente, y discutimos técnicas para el análisis posterior de dichos genes. Este sistema es útil en la identificación funcional de una amplia gama de productos génicos.

Abstract

La identificación de genes responsables de la inducción embrionaria plantea una serie de desafíos; por nombrar algunos, las moléculas secretadas de interés pueden ser bajas en abundancia, pueden no ser secretadas sino estar atadas a la(s) célula(s) señalizadora(s), o pueden requerir la presencia de socios de unión o moléculas reguladoras aguas arriba. Por lo tanto, en la búsqueda de productos genéticos capaces de provocar una respuesta inductiva temprana del cristalino en un ectodermo competente, utilizamos un sistema de clonación de expresión que permitiría la identificación de factores paracrinos o yuxtacrinos, así como proteínas transcripcionales u otras proteínas reguladoras. Se inyectaron grupos de ARNm en los ovocitos de Xenopus y el tejido que respondió se colocó directamente sobre los ovocitos y se realizó un cocultivo. Después de la clonación funcional de ldb1 a partir de una biblioteca de ADNc en etapa de placa neural basada en su capacidad para provocar la expresión del marcador de placa del lente temprano foxe3 en el ectodermo de la tapa animal competente para el lente, caracterizamos el patrón de expresión del ARNm y analizamos la progresión del desarrollo después de la sobreexpresión o el derribo de ldb1. Este sistema es adecuado en una amplia variedad de contextos en los que se busca la identificación de un inductor o sus moléculas reguladoras aguas arriba utilizando una respuesta funcional en tejido competente.

Introduction

Los enfoques genéticos avanzados para identificar genes de interés a través de su función o pérdida de función^1,2 son una parte integral de la comprensión de eventos de patrones complejos en el desarrollo. Junto con las poderosas técnicas de genética inversa disponibles para una gama cada vez más amplia de sistemas e investigadores^3-5, ahora es posible identificar genes con un papel funcional clave en una vía y luego dilucidar esa función a nivel celular y en interacción con otros productos génicos. Un enfoque para la identificación funcional de genes de interés que ha producido muchos hallazgos clave en el pasado es la clonación de expresión^6,7.

Nuestro reciente objetivo⁸ fue identificar los factores inductivos tempranos del cristalino, ya que se ha demostrado que los pasos iniciales en el proceso inductivo del cristalino de los vertebrados ocurren ya en las etapas de la gástrula. Con ese fin, utilizamos el ectodermo^{de 9} sombreros animales transitoriamente competente para el cristalino (estadio 11-11,5¹⁰) de embriones de Xenopus como tejido que responde a la inducción, y el ovocito de Xenopus en estadio VI como fuente de producción de los factores inductores.

El siguiente protocolo se basa en los protocolos de clonación de expresiones y selección de hermanos de Smith y Harland^6,7, también utilizados con éxito por otros^11-13. En nuestro sistema de expresión de ovocitos (utilizado por primera vez para la producción de factores inductores por Lustig y Kirschner¹⁴), se seleccionan e identifican grupos de transcripciones inyectadas capaces de hacer que los ovocitos produzcan directa o indirectamente factores que provoquen una respuesta inductiva del cristalino en el ectodermo del sombrero animal. Dado que el sistema es útil para expresar directamente las moléculas inductoras secretadas (el ARNm de INHBB inyectado en ovocitos causa la inducción del mesodermo en el ectodermo⁸ del sombrero animal competente para el mesodermo), originalmente esperábamos que el procedimiento de cribado fuera útil principalmente para la identificación de factores paracrinos. Sin embargo, dado que identificamos un factor nuclear en nuestro cribado (ldb1⁸), está claro que el sistema puede utilizarse para identificar una amplia variedad de moléculas, como factores reguladores transcripcionales o traduccionales, miRNAs, cofactores o factores de yuxtacrina.

Protocol

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por la Universidad de Virginia Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión.

Nota: La figura 1 muestra una vista general esquemática de los procedimientos experimentales.

1. Preparación de ovocitos

1. X. Pre-prime laevis hembras con 150 U de Mare embarazada suero de gonadotropina (PMSG) aproximadamente una semana antes de que el aislamiento de los ovocitos. Inyectar 1 ml 150 U / ml PMSG en dorsal linfático salida con 1 cc jeringa estéril con 29 G aguja.
2. Preparar soluciones para inyección de ovocitos y ensayo casquillo ovocito-animal.
   1. Preparar Ca ⁺⁺ / Mg ⁺⁺ exento de OR2 (OR2-): NaCl 82 mM, KCl 2,5 mM, 1,5 mM Na ₂ HPO _4, 50 mM HEPES pH 7,2.
   2. Preparar OR2: OR2- más 1 mM _CaCl2 y _MgCl2 1 _mM.
   3. Preparar OCM: 60% Leibovitz L15, 0,4 mg / ml BSA, 100 mg / ml de gentamicina, pH 7,8.
   4. Prepare MBS 1x: NaCl 88 mM, 1 mM de KCl, 0,7 mM CaCl _2, 1 mM MgSO _4, 5 mM HEPES (pH 7,8), 2,5 mM NaHCO _3.
   5. Preparar 3% de Ficoll en 1X MBS.
   6. Preparar NAM 1x: NaCl 110 mM, KCl 2 mM, 1 mM Ca (NO _{3) 2,} 1 mM MgSO _4, EDTA 0,1 mM, 1 mM NaHCO _3, 2 mM Na ₃ PO _4, pH 7,4.
3. Anestesiar la hembra en una solución al 0,03% de acetato de sal metanosulfonato 3-aminobenzoato (MS222) en 0,1x MBS (primero disolver 0,3 g MS222 en etanol 10 ml de 95%, luego se diluye en 1 litro MBS 0,1x) mediante la colocación de rana en solución para 10-15 minutos o hasta que no responde.
   1. Compruebe que la anestesia es completa girando rana anestesiado sobre su espalda para asegurarse de que no responde (incompletamente ranas anestesiados mover las extremidades o girar el cuerpo más).
4. Quirúrgicamente aislar fragmentos de ovario haciendo una incisión abdominal a través de la piel y la pared del cuerpo con hoja de bisturí, aislando tejido ovárico con pinzasy tijeras. Coloque fragmentos de ovario en OR2-. Cierre la pared del cuerpo con una sutura de seda 3-0 en una aguja curva de 24 mm y cierre la piel por separado con los mismos puntos de sutura. Permitir la recuperación de la hembra en 1 g / l de sal de acuario en el agua.
5. Con unas pinzas finas, tejido ovárico lágrima en pequeños (10 - 20 ovocitos) piezas y traslado al OR2- fresco.
6. Fragmentos de ovario Defolliculate en 2,0 mg / ml de colagenasa A en OR2- agitando suavemente en un agitador durante 1 hora, la transferencia a colagenasa fresco y agitar durante una hora adicional.
7. Lavar ovocitos 10 veces en OR2 [que contienen Ca ⁺⁺ / Mg ^++], descartando ovocitos pequeños.
8. Lave ovocitos en OCM dos veces y traslado al fresco OCM. Aislar ovocitos Etapa VI por tamaño después de una inspección visual y desechar ovocitos inmaduros (más pequeñas): Etapa VI ovocitos son más grandes que los ovocitos inmaduros con pigmentación incluso en el hemisferio animales y son de aproximadamente 1,2-1,4 mm de diámetro.
9. Mantener ovocitos a 18-20 ° C in OCM antes de la inyección. Nota: placas de Petri recubiertas de agarosa se pueden utilizar para minimizar la adherencia de los ovocitos a plato.

2. La inyección de transcripciones Library

1. Preparar una biblioteca de cDNA direccional ¹⁵ usando ARN extraído en una etapa apropiada de desarrollo (por ejemplo, la etapa placa neural 14 ^10). Compra una biblioteca de ADNc o construir uno usando un kit comercial por la visión general en los cuatro pasos siguientes.
   1. Aislar aproximadamente 5 g de ARNm mediante el uso de un producto para enriquecer en poli (A) + RNA (Ver Tabla de Materiales) y siguiendo las instrucciones del fabricante. Nota: Las transcripciones que se utilizarán para producir la biblioteca de cDNA puede ser restringido a un tejido induciendo (tal como la placa neural, después de microdisección del tejido deseado), o pueden ser a partir de embriones enteros en una etapa particular.
   2. Producir ADNc con un kit comercial, siguiendo las instrucciones del fabricante.
   3. Ligar aproximadamente 20 ng de ADNc en un vector incluido con el kit comercial u otro vector adecuado. Un vector de plásmido apropiado incluye secuencias para la estabilidad del ARNm tales como 5 'β-globina y 3 de poli (A) secuencias (pCS2 +, pTnT, pCS105).
   4. Transformar ligación en células bacterianas competentes utilizando el protocolo recomendado por proveedor para la transformación de choque térmico.
      Nota: Alternativamente, una colección de (ORFeome) clones marco de lectura abierto está comercialmente disponible y puede ser usado para generar las transcripciones de inyección.
2. Preparar 10 piscinas de plásmidos de ^desde 3 10 hasta abril 10 complejidad ^(desde abril 10 hasta 05 10 complejidad total). Esto representa 10 placas con 1.000 - 10.000 colonias cada una.
   1. Biblioteca placa de cultivo en 10 placas de 15 cm LB-ampicilina, crecer 12 - 18 horas a 37 ° C, y recoger colonias de cada por una suave presión con un esparcidor de vidrio en 7 ml LB.
   2. Preparar un stock de glicerol a partir de 0,5 ml (añadir a 0,2 ml de glicerol estéril y se almacena a -20 y# 730; C), y el uso de los restantes 6,5 ml para preparar ADN con un estándar comercialmente disponible kit de ADN miniprep siguiendo las instrucciones del fabricante.
3. Linealizar el ADN plásmido agrupada (1.0 - 2.0 g) con enzima de restricción apropiada digerir ¹⁶ a 37 C durante 1 - 1,5 h. Aislar el DNA linealizado con extracción con fenol / cloroformo seguido de precipitación con etanol y resuspensión en agua por las especificaciones del kit RNA polimerasa utilizada. Sintetizar ARN sentido con un kit de ARN polimerasa comercial siguiendo las instrucciones del fabricante.
4. Preparar agujas de microinyección (utilizando un extractor de aguja con un tubo capilar de vidrio) de aproximadamente 20 m de diámetro; medir puntas de aguja en un microscopio compuesto con un micrómetro ocular calibrado. Nota: La configuración del extractor de agujas deben determinarse empíricamente para producir una aguja con una punta fina de tal manera que cuando se rompen con unas pinzas finas produce el tamaño de la punta deseada.
5. Prepárese (empujar arcilla encapa uniforme sobre el fondo del plato) arcilla forrada 35 x 10 mm placas de Petri con ranuras paralelas para mantener ovocitos en su lugar durante la microinyección; producir ranuras con una sonda centro comercial o pipeta Pasteur fundido en la punta de la llama. Como una alternativa a la arcilla, preparar platos de agarosa haciendo muescas con un molde de elastómero ^17. Ovocitos Transferir con una pipeta de gran calibre a un 3% de Ficoll en 1X MBS (aproximadamente 2 ml) en las filas de los platos de barro forradas.
6. Usando microinyector, llenar la aguja con 1 ng / nl ARN y ajustar el balance para producir ligera presión positiva (para evitar la elaboración de citoplasma del ovocito).
7. Inyectar ovocitos con aproximadamente 20 nl ARN en la región ecuatorial. Permitir 1 h para los ovocitos inyectados a permanecer en Ficoll-MBS, a continuación, transferir suavemente para 1x MBS. Incubar durante 8-24 horas a 20 ° C antes del ensayo casquillo animal.

3. Cap Ensayo Animal

1. Preparar 3 / 4x NAM y obtener unas pinzas finas, bucle de cabello, fragmentos cubreobjetos curvas, dis barro forradashes con hendiduras en forma de copa para mantener ovocitos. Haga fragmentos cubreobjetos curvas rompiendo aparte cubreobjetos de vidrio en fragmentos pequeños (aproximadamente 1 - 2 mm x 2-4 mm) y que pasa por la llama hasta que los bordes pulir y caerse, produciendo una pieza curva.
2. Fertilizar X. laevis huevos ¹⁸ a través in vitro o el apareamiento natural y la cultura a la gástrula etapas (10 - 11 horas después de la fertilización a RT) en 0,1x MBS antes de la clasificación por etapas; recoger mediados de gástrula (etapa 11 - 11,5) ^{10 embriones.}
3. Embriones de transferencia a una placa de Petri, aproximadamente la mitad con 3 / 4x NAM. El uso de dos pares de pinzas finas, retire la fertilización (vitelina) membrana desde gastrulae.
4. Transferencia de ovocitos a 3 / 4x NAM (aproximadamente 2 ml) en platos de barro forradas e inmovilizar en impresiones individuales en la arcilla, que produce impresiones para dar cabida a los embriones individuales como ranuras fueron descritos anteriormente.
5. Embriones de traslado hasta los platos de barro forradas y cortar las tapas animales de gastrulae usando dos pares de pinzas finas. Tenga cuidado de aislar casquillo ectodermo animales y no tejido ecuatorial ^18.
6. Colocar un casquillo animal en el hemisferio animales de cada ovocito con la superficie interior de la tapa de los animales en contacto con el ovocito. Mantenga recombinantes juntos mediante la aplicación de fragmento de cubreobjetos de vidrio curvada y aplicando presión hacia abajo al vidrio, aplanando el ectodermo como los contactos cubreobjetos la arcilla (CAPS animal puede permanecer abierta con la capa interior expuesta a la superficie del ovocito para 6 - 8 horas o más largo ).
   Nota: Como alternativa, coloque la tapa del animal en una hendidura de la arcilla con su superficie interna orientada hacia arriba y coloque un ovocito en la tapa; asegurar el recombinante con pequeñas extensiones de arcilla.
7. Cultura a 20 ° C hasta el control de los embriones llegan a la etapa deseada para el ensayo.
8. Recombinante separada mediante la eliminación de cubreobjetos / arcilla y aislar ectodermo con unas pinzas y un bucle de pelo.
9. Fijar fragmentos ectodérmicas durante 1 hora en MEMFA (3,8%formaldehído en MEM [0.1 M MOPS pH 7.4, 2 mM EGTA, 1 mM MgSO y _4]).
10. Fragmentos de transferencia (y embriones de control) de MEMFA en etanol y se almacena a -20 ° C.

4. Análisis de la Respuesta en ectodermo por hibridación in situ (ISH)

1. Preparar soluciones para ISH.
   1. Preparar 1x PBS: 0,01 M tampón fosfato salino, NaCl 0,138 M, pH 7,4
   2. Preparar PBS-Tween (PTW): 1x PBS, 0,1% de Tween-20
   3. Preparar la solución de 100x Denhart: 2% de BSA, 2% de polivinilpirrolidona, 2% de Ficoll
   4. Preparar Tampón de Hibridación: 50% formamida, 5x SSC, 1 mg / ml de ARN de levadura torula, 1 mg / ml de heparina, solución de Denhart 1x, 0,1% de Tween-20, 0,1% de CHAPS, EDTA 10 mM, DEPC-H ₂ O
   5. Preparar maleico Acid Buffer (MAB): ácido maleico 100 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5
   6. Preparar MAB + bloque: MAB, 2% reactivo de bloqueo (calor a 60 ° C para disolver)
   7. Preparar fosfatasa alcalina (AP) Tampón: Tris 100 mMpH 9,5, 50 mM de MgCl _2, NaCl 100 mM, 0,1% de Tween, dH ₂ O
2. Prepare la sonda de ARN.
   1. El uso de un kit RNA polimerasa comercial y DIG-NTP mezcla, añadir a un tubo de 1,5 ml (50 l de reacción): 25,5 l DEPC-H ₂ O, 10 l 5X Transcription Buffer, 2,5 l de mezcla 10x dig-NTP, 5 l 100 mM TDT, 2 l ARNsin, 2 l plantilla de ADN linealizado (~ 1 g / l), 3 l ARN polimerasa e incubar 37 ° C durante 90 minutos.
   2. Añadir 2 l ARN polimerasa e incubar 37 ° C durante 60 minutos.
   3. Compruebe 2 l de reacción en un 1% en gel de agarosa.
   4. Añadir 1 l RQ1 RNasa libre de DNasa e incubar 37 ° C durante 20 minutos.
   5. Precipitar la sonda mediante la adición de 50 l DEPC-H ₂ O, 25 l 10 M acetato de amonio y 313 l de etanol. Almacenar a -20 C durante la noche (O / N) a continuación, recuperar el ARN por centrifugación a 13.800 xg durante 20 min. Lavar con 500 l 75% de etanol, girar brevemente, retireetanol y permitir pellet se seque al aire. Añadir 50 l DEPC-H ₂ O.
   6. Añadir Tampón de Hibridación a una concentración final de ~ 0,5 g / l.
3. Preparar de tejidos para la hibridación. A menos que se indique lo contrario, llenar viales a la cima con cada cambio de solución descritos (aproximadamente 4 ml).
   1. Retire etanol a partir de viales y embriones de transferencia en 75% de etanol / PTW, entonces 50% de etanol / PTW durante 10 minutos cada uno, en posición horizontal sobre rockero.
   2. Lavar tres veces en PTW durante 5 minutos cada uno en eje de balancín.
   3. Transferencia a 10 mg / l tratamiento de proteinasa K en PTW; tubos de roca vertical 15 min.
   4. Enjuague dos veces 10 minutos cada uno en 0,1 M trietanolamina pH 7.8 - tubos de roca vertical.
   5. Añadir 12,5 l anhídrido acético para tubos y el rock verticalmente 5 min. Repita el procedimiento con anhídrido acético 12,5 l adicional durante 5 min.
   6. Lave en PTW 5 min verticalmente en eje de balancín.
   7. REFIX en 4% de paraformaldehído 20 min en eje de balancín. Heat Tampón de Hibridacióna 60 ° C.
   8. Lavar tres veces en PTW durante 5 minutos cada uno en eje de balancín.
   9. Retire todos pero ~ 1 ml de PTW de cada tubo y añadir 250 l Hyb Buffer; agitar suavemente los tubos para mezclar. Tubos de roca vertical 5 min.
   10. Reemplazar con 60 ˚C Hyb Buffer (0,5 ml) y agitar suavemente a 60 ° C 10 min. Reemplazar con frescos Hyb Buffer y agitar a 60 ° C de dos a 4 horas.
   11. Sonda de calor (1 ml a 0,5 mg / l en Hyb Buffer) a 60 ° C (3 min). Retire Hyb Buffer y añadir sonda para tubos. Agitar suavemente O / N a 60 ° C.
4. Preparar tejidos para anticuerpos.
   1. Cálido Hyb Buffer y 2x SSC + 0,1% de Tween-20 soluciones a 60 ° C.
   2. Reemplace solución sonda con Hyb Buffer (salvo sondas a -20 ° C durante 2 - 3 veces reutilización). Lavar a 60 ° C durante 10 minutos.
   3. Lavar tres veces a 60ºC en 2x SSC-Tween (20 minutos cada uno con agitación).
   4. Lavar tres veces a 60 ° C en 0,2x SSC-Tween (20 minutos cada uno con agitación).
   5. Lavar dos veces en MAB (RT) durante 15 min cada uno horizontalmente en eje de balancín.
   6. Añadir 1 ml MAB + bloque. Lávese las 2 horas verticalmente en eje de balancín.
   7. Traslado a 1 ml MAB + bloque que contiene un anti-digoxigenina-AP 1/2000. Roca verticalmente en 4 CO / N.
5. Preparar Tejidos para Color reactivo.
   1. Reemplace la solución de anticuerpo con MAB; lavar tres veces en el MAB 5 minutos cada uno horizontalmente en eje de balancín.
   2. Lavar tres veces en el MAB de 1 hora cada uno horizontal en eje de balancín.
   3. Lavar dos veces en AP Buffer 10 minutos cada uno en posición horizontal sobre rockero.
   4. Traslado tejido para pozos múltiples bandeja de plástico, retire AP Buffer y añadir BM reactivo Púrpura (~ 1 ml). Permita reacción tenga lugar en la oscuridad 5 min de O / N.
   5. Cuando se logra tinción apropiada, traslado de tejidos a viales de PTW. Lavar dos veces 10 minutos en cada una PTW en eje de balancín.
   6. Fijar en solución de Bouin en 4 CO / N en eje de balancín.
   7. Lave Bouin con tres 70% de etanol / 30% PTW lavados a TA. Proceda to captura de imagen usando epi-iluminación y una cámara montada en el microscopio, el blanqueado, si es necesario ^18.

5. Selección Sib y clonación

1. Seleccione la piscina con la mayor actividad (mayor respuesta en el tejido ectodérmico).
2. Valorar (diluir con LB a la densidad apropiada) el stock de glicerol de la piscina con la mayor actividad y la placa a cabo diez nuevas placas con aproximadamente una décima parte de las colonias de la etapa previa (usando la sección 2 en el protocolo anterior).
3. Reducir el tamaño de la piscina hasta que la actividad se remonta a una sola colonia.
4. Obtener secuencia de ADN usando cebadores estándar en el vector.

Results

En respuesta a la expresión del ARNm inyectado en oocitos, respondiendo tejido casquillo animal se sometió a ensayo para la expresión de Otx2 mediante hibridación in situ (Figura 2 y Tabla 1); Otx2 se expresa en el ectodermo lente presuntiva (PLE) a partir de cierre del tubo neural a través de placoda del cristalino engrosamiento ^19. Sin embargo, desde Otx2 se expresa también en el ectodermo neural anterior, así como la cabe...

Discussion

El método descrito aquí para la clonación funcional de genes capaces de inducir una respuesta en ectodermo competente puede ser usado para identificar una amplia gama de productos génicos. Este método se expande al trabajo anterior mediante la combinación de los ensayos de inducción de tejido con técnicas de clonación de expresión. Utilizamos las vías metabólicas de Xenopus el ovocito como una fuente de producción de factores de inducción de, directa o indirectamente, después de la inyección de ARN. Esto, en co...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
12/101	Banco de hibridomas	12/101	Anticuerpo monoclonal para la detección de tejido muscular
20x SSC Buffer	Sigma	S6639	para ISH
Anhídrido acético	Sigma	A6404	para ISH
Anti-Dig-AP	Roche	11093274910	para ISH
Aurum Plasmid Mini Kit	Bio-Rad	732-6400	Purificación de ADN plasmídico
Reactivo de bloqueo	Roche	11096176001	para ISH
BM Purple	Roche	11442074001	para ISH
Boekel Horno de hibridación	Fisher Scientific	13-245-121	para ISH
Bouin's Solution	Sigma	HT10132	para ISH
BSA	Sigma	A9647	para OCM
CHAPS	Sigma	C3023	para ISH
Colagenasa A	Roche	10103578001	Desfoliculación de ovocitos
Cisteína	Sigma	C121800	Embriones de Dejelly
DEPC-H2O	Fisher Scientific	BP5611	para ISH
Mezcla de marcaje de ARN Dig Roche		11277073910	para sondas ISH
Pinzas Dumont #5	World Precision Instruments	500233	para envoltura Vitelline
3-aminobenzoato de etilo	Sigma	A5040	MS222 anestésico
Ficoll PM 400	Sigma	F4375	para medios de inyección
Formamida	Sigma	F9037	para ISH
Sulfato de gentamicina	Sigma	G1914	para OCM
Capilares de vidrio	World Precision Instruments	4878	3,5" de largo, I,D, 0,530 mm
Viales de muestra de vidrio	Fisher Scientific	06-408B	para ISH
Hair loop			Pelo adherido en pipeta Pasteur para la manipulación de tejidos
Sal sódica de heparina	Sigma	H4784	para inyector ISH
Nanoliter 2010	World Precision Instruments	Nanoliter 2010	Microinyector controlado por microprocesador
Instant Ocean	Carolina	972433	Aquarium Sal para la recuperación de ranas
IRBG XGC Xenopus verificado de longitud completa cam cDNA	Source Bioscience	989_IRBG	cDNA library
Placas de agar LB con 100 µ g/ml Ampicilina	Teknova	L5004	Placas LB-Amp prevertidas de 150 mm para la selección de hermanos
LB Luria Caldo	Teknova	L8650	LB para la recolección de colonias en la selección de hermanos a partir de placas y dilución de cultivos Kit de aislamiento magnético
ARNm	New England BioLabs	S1550S	para el aislamiento de ácido maleico de ARN enriquecido con poli(A)
	Sigma	M0375	para ISH
Micromanipulador manual Microfil	World Precision Instruments	M3310R	Micromanipulador manual
Mezclador nutante	Fisher Scientific	22-363-152	Balancín para ISH
Permoplast	Nasco SB33495M		Arcilla para placas de inyección y disección
Salina tamponada con fosfato	Sigma	P5368	para ISH
PMSG	Sigma	G4877	para estimular el desarrollo de los ovocitos
Polivinilpirrolidona	Sigma	PVP40	para
ISH Extractor programable	World Precision Instruments	PUL-1000	Extractor de agujas de micropipeta
Proteinasa K	Sigma	P6556	para ISH
pTnT Vector	Promega	L5610	Construcción de la biblioteca de ADNc
Sistema de combinación Riboprobe	Promega	P1450	in vitro transcripción
Superíndice Kit de construcción de bibliotecas de ADNc de longitud completa	Kit	18248013	Life Technologies para la construcción de bibliotecas de ADNc
Suturas, seda 3-0	Fisher Scientific	19-037-516	Hilo y aguja de sutura para la extracción post-ovocito
Torula RNA	Sigma	R3629	para ISH
Trietanolamina	Sigma	T1502	para ISH
Tween 20	Sigma	P9416	para
el sistema de síntesis de ADNc RiboClone universal	ISH Promega	C4360	kit alternativo para la construcción de bibliotecas de ADNc
Clones de entrada ORF completos de Xenopus - ORProfuente de colaboración	Bioscience	5055_XenORFeome	ORFeome clones
XL2-Blue Células ultracompetentes	Agilent Technologies	200150	células para la transformación de ADNc biblioteca