Simultánea de dos fotones<em&gt; En Vivo</em&gt; Imágenes de entradas sinápticas y Objetivos postsinápticos en la corteza del ratón retroesplenial

Resumen

Este video muestra el procedimiento de craneotomía que permite obtener imágenes crónicas de neuronas en la corteza retroesplenial de ratón utilizando microscopía in vivo de dos fotones en la línea transgénica Thy1-GFP. Este enfoque se combina con la inyección de virus adenoasociados que expresan mCherry en el hipocampo dorsal. Estas técnicas permiten el seguimiento a largo plazo de la plasticidad estructural dependiente de la experiencia en RSC.

Resumen

Este video muestra el procedimiento de craneotomía que permite obtener imágenes crónicas de las neuronas en la corteza retroesplenial (RSC) del ratón utilizando microscopía de dos fotones in vivo en la línea de ratones transgénicos Thy1-GFP. Este enfoque crea la posibilidad de investigar la correlación de las manipulaciones conductuales con los cambios en la morfología neuronal in vivo.

Se consideró que el procedimiento de implantación de la ventana craneal se limitaba solo a las regiones de la corteza de fácil acceso, como el campo de barril. Nuestro enfoque permite la visualización de neuronas en el RSC altamente vascularizado. RSC es un elemento importante del circuito cerebral responsable de la memoria espacial, que anteriormente se consideraba problemático para la obtención de imágenes in vivo de dos fotones.

La implantación de la ventana craneal sobre el RSC se combina con una inyección de virus adenoasociado recombinante que expresa mCherry (rAAV^mCherry) en el hipocampo dorsal. La mCherry expresada se extiende a proyecciones axonales desde el hipocampo hasta RSC, lo que permite la visualización de cambios tanto en los botones axonales presinápticos como en las espinas dendríticas postsinápticas en la corteza.

Esta técnica permite el monitoreo a largo plazo de la plasticidad estructural dependiente de la experiencia en RSC.

Introducción

microscopía de dos fotones revolucionó la observación de la actividad cerebral en vivir y comportarse animales. Desde su introducción en 1990, rápidamente ganó popularidad y ahora se implementa como uno de los enfoques más interesantes e innovadores en el examen de numerosos aspectos de la actividad cerebral in vivo ^1,2. Estas aplicaciones incluyen las mediciones de flujo de sangre, la activación neuronal (por ejemplo, utilizando indicadores de nivel de calcio o genes tempranos inmediatos de expresión) y la morfología de las células neuronales. Un número creciente de laboratorios utilizan microscopios de dos fotones, la aplicación de la técnica en todo el mundo científico como un nuevo estándar para las imágenes del cerebro in vivo.

El método estándar consiste en la implantación de la ventana del cráneo (un agujero redondo en el cráneo cubierto con una tapa de vidrio) sobre el barril o la corteza visual del cerebro del ratón ^3. A continuación, dependiendo del protocolo experimental, el mouse somete a una serie de visualización y las sesiones de entrenamiento de comportamiento, lo que permite controlar los cambios en la actividad cerebral y la morfología neuronal en el tiempo ^4,5. En ambos casos la craneotomía sólo afecta el hueso parietal, sin cruzar las suturas. Se cree ampliamente que el principal inconveniente de la técnica es su limitada aplicación a cortezas fácilmente accesibles, tales como el barril o de la corteza visual. La implantación de la ventana del cráneo sobre otras regiones plantea muchas dificultades, debido a un sangrado excesivo y / u obstáculo espacial.

En este artículo se propone la implantación de la ventana del cráneo por encima de la corteza retroesplenial (RSC) como otra posible zona de interés para los dos fotones en la microscopía in vivo ^6. RSC es un elemento importante del circuito cerebral responsable de la formación de la memoria espacial. Anatómicamente, RSC es una parte de una red neuronal de conexión cortical, del hipocampo, y las regiones talámicas ^7. Esmuy involucrado en una serie de comportamientos, tales como el aprendizaje espacial y la extinción, así como la navegación espacial ^6.

Con el fin de visualizar los cambios morfológicos de las neuronas que utilizamos una línea de ratón transgénico que expresa la proteína verde fluorescente (GFP) bajo el promotor thy1. En estos ratones, GFP se expresa en aproximadamente el 10% de las neuronas en el cerebro que permiten una visualización clara de los axones y dendritas corticales utilizando microscopía de dos fotones ^8. Otra innovación que proponemos es la inyección de un serotipo recombinante adeno-asociado virus 2/1 (rAAV2 / 1) que codifica una proteína fluorescente de color rojo (mCherry) bajo un promotor específico de neuronas CaMKII ⁹ en las estructuras más profundas del cerebro que se proyectan hacia RSC , tales como el hipocampo. La expresión de rAAV2 / 1 ^mCherry en el hipocampo de ratón Thy1-GFP permite la visualización simultánea de elementos pre y postsinápticos del Hippocampo-Cortical ¹⁰ sinapsis. La expresión impulsada por el rAAV de mCherry requiere dos a tres semanas para la proteína para alcanzar el nivel suficiente en los terminales axonales. Este período es consistente con el tiempo usual requerido para la recuperación de la craneotomía.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales se describen a continuación fueron aprobados por el Comité Ético local en el Instituto Nencki of Experimental Biology, Academia de Ciencias de Polonia.

Nota: Algunas de las escenas en el vídeo asociado se aceleran. Factor de velocidad se indica en estas escenas.

1. Preparación para la Cirugía

1. Esterilizar todas las herramientas, envases de vidrio para líquidos y bastoncillos de algodón en el autoclave. Use guantes prescindibles. Limpiar la mesa de operaciones, el marco estereotáxico y todo lo que le rodea con etanol al 70%. Use una almohadilla quirúrgico estéril para crear un espacio estéril para todo el equipo esterilizado. Cortar espuma de gel en trozos pequeños y remojar en solución salina estéril.
   Nota: De acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, el etanol es un esterilizante ni un desinfectante de alto nivel. Sólo se debe utilizar como un agente de limpieza / desengrasado de superficies previamente esterilizados.
2. Poner el animal en THcámara de inducción de correo y establecer el nivel de isoflurano al 5% y el flujo de oxígeno a 2 l / min. Este procedimiento debe tomar alrededor de 3 min.
3. Llevar al animal fuera de la cámara de inducción. Utilice la cola o del dedo del pie aprieta con el fin de asegurar que el animal está completamente sedado.
4. El uso de un condensador de ajuste preciso afeitar el pelo de la parte posterior de la cabeza (entre las orejas) hasta los ojos.
5. Colocar el animal en el marco estereotáxico y estabilizar la cabeza con barras de oído.
6. Establecer niveles de anestesia con isoflurano al 1,5-2% y 0,3 L / min de oxígeno.
7. Aplicar el ungüento oftálmico.
8. Inyectar la vía subcutánea animal con Tolfedine (4 mg / kg), Butomidor (2 mg / kg) y Baytril (5 mg / kg) para prevenir la inflamación, el dolor y la infección, respectivamente.
9. Inyectar la vía intramuscular animal con dexametasona (0,2 mg / kg) para evitar la hinchazón del cerebro.
   Nota: Es posible inyectar por vía subcutánea o intraperitoneal dexametasona para prevenir el daño muscular.
10. Limpiar la piel con shisopos de algodón terile con Betadine seguidos por 70% de etanol.
11. Cambiar los guantes y rociarlas con un 70% de etanol.
    Nota: Durante el uso de guantes desechables no toque el campo estéril. Toca el único animal con la punta de los instrumentos quirúrgicos estériles e hisopos estériles.

2. Cirugía ventana del cráneo

1. Levantar la piel con pinzas y el uso de tijeras micro incise la piel horizontalmente a lo largo de la base de la cabeza y luego oblicuamente hasta el punto de frente entre los ojos. Retire la tapa de piel.
2. Aplique un ungüento de lidocaína con un hisopo estéril en el periostio para evitar el sangrado y el dolor excesivo.
3. Use hisopos de algodón estériles o un escalpelo para retirar el periostio. Se seca el cráneo con hisopos estériles.
4. El uso de una aguja estéril se aplica densa pegamento de cianoacrilato sobre los bordes de la piel para inmovilizarlos y para evitar el contacto con cemento dental. Espere a que el pegamento se seque.
5. Coloque un 3 mm cubreobjetos estéril sobre tque el cráneo anterior a esta sutura. Centre el cubreobjetos en RSC coordenadas: AP, bregma -2,8; ML, bregma 0. Marque los bordes cubreobjetos por el rascado la superficie del cráneo con una aguja estéril. Poner el cubre de nuevo en el recipiente estéril con un 70% de etanol.
6. Use un taladro dental de alta velocidad con rebabas de pequeño diámetro para delinear un círculo de 3 mm de diámetro. Limpiar el sitio de perforación del polvo de hueso con hisopos de cruce de solución salina estéril. Utilice la espuma de gel y de hisopos para detener el sangrado ocasional y limpiar el hueso.
7. En el medio de perforación comprobar el espesor del hueso con unas pinzas finas tocando con suavidad el círculo de hueso y la comprobación de su movilidad. Tenga en cuenta que el hueso es más gruesa en el área de la sutura. Detener la perforación cuando el círculo de hueso es móvil y sólo un par, capa delgada de hueso se deja en la circunferencia. Limpiar el campo operacional de todo el polvo de hueso restante con hisopos salinas de cruce.
8. La caída de la solución salina estéril en el área de perforación, que cubre el CIR perforadoCLE. saque con cuidado el círculo hueso con unas pinzas finas y luego suavemente pero con firmeza quitar el hueso levantándolo hacia arriba. Tenga cuidado de no sesgar el círculo de hueso mientras se levanta para evitar posibles daños a la dura.
9. Aplique suavemente la espuma de gel empapada en solución salina estéril sobre la duramadre para ayudar a detener el sangrado. Espere hasta que todo el sangrado se detiene por completo. Retirar con cuidado la espuma de gel de no perturbar el proceso de coagulación.
   Nota: El área de sutura es muy vascularizada, por lo que el sangrado en este punto podría ser profundos. Es esencial que esperar el tiempo suficiente para que el sangrado se detenga completamente. Es útil para mantener la espuma de gel empapada en solución salina enfriada colocándola en hielo.

3. Inyección de virus

1. Coloque la bomba de infusión a la torre estereotáctica y conectar el controlador.
2. Insertar la aguja 35G en la jeringa. Enjuague la jeringa 10 veces con etanol para esterilizarla y 10 veces con solución salina estéril para eliminar los restos de correoTHANOL. Eliminar las burbujas de aire de la jeringa. Inserte la jeringa en la bomba.
   Nota: Considere el uso de otros desinfectantes.
3. Descongelar una dosis única de rAAV2 / 1 ^mCherry preparación (se recomienda 10 ¹² pfu) y mantenerlo en hielo. Llene la jeringa con la solución de virus.
4. Centrar la aguja en el bregma y luego insertar suavemente en el hipocampo utilizando las siguientes coordenadas: AP-2, ML +/- 1,0, -1 DV. Estas coordenadas se encuentran cerca del borde de la craneotomía. Esperar durante 5 minutos para que el tejido se estabilice.
5. Inyectar 0,7 l de la solución rAAV2 / 1 ^mCherry a razón de 50 nl / min. Esperar 10 min para que el virus se adsorbe completamente. Retire con cuidado la aguja. Seque con espuma de gel si se presenta sangrado. Repita con el sitio contralateral.

4. craneal ventana de implantación

1. Coloque el cubreobjetos estéril, seca en la parte superior de la duramadre en el marco del círculo perforado. Mantenga el cubreobjetos con el forceps para aplanar suavemente la duramadre y llevar cubreobjetos 'bordes más cerca de la superficie del cráneo.
   Nota: Es posible que el cubreobjetos interrumpe el coágulo y se restablece el sangrado. Si ese es el caso, levantar el cubre objetos, colocarlo en el alcohol, secar y volver al paso 2.9.
2. Usando una aguja estéril aplicar el pegamento de cianoacrilato densa en los bordes de recubrimientos de vidrio para la fijación a la calavera. Espere a que el pegamento se seque.
3. Coloque una barra de fijación (tuerca M2 o un diseño hecho a medida) en la parte frontal del cráneo. Aplique el pegamento de cianoacrilato sobre los bordes de la barra. Espere a que el pegamento se seque.
   1. Colocar el gancho de fijación en una posición que permita el posicionamiento horizontal de la ventana del cráneo durante el diagnóstico por sesión. Colocarlo tan distantes como sea posible de la ventana. Si se coloca demasiado cerca de la ventana, la barra y el tornillo de conexión con el titular de la medida pueden suponer un obstáculo para el objetivo durante el proceso de formación de imágenes.
4. preparar el acrílico dental y aplicarlo sobre la superficie del cráneo alrededor del vaso. Es útil para formar una forma de cráter alrededor de la ventana. Se va a crear una cavidad para agua aplicada posteriormente para obtener imágenes con el objetivo de agua.
5. Crear un casquillo con el acrílico dental, que cubre el resto de la zona operativa, bordes de la piel, bar fijación, reforzando el cráter alrededor de la ventana craneal. Espere a que el cemento dental se endurezca.
6. Retire el animal del marco estereotáxico y ponerlo en la cámara de recuperación.
7. Espere a que el animal se recupere de la cirugía, mientras que la observación de las funciones fisiológicas.
8. Aplicar analgesia postoperatoria (carprofeno, 10 mg / kg) y el tratamiento de antibióticos (Baytril, 5 mg / kg) durante 48 horas.

5. Imaging

1. Iniciar el Ti: Zafiro láser, encienda el microscopio. El sistema usado en este experimento está equipado con un láser de dos fotones, sistema OPO y PMT dual GaAsP.
2. El sacrificio del animal en el Inducy cámara de inducir la anestesia.
3. Retire el animal de la cámara de inducción y el lugar de la máscara de anestesia de gas bajo el microscopio. Disminuir el flujo de oxígeno a 0,3 L / min y la concentración de isoflurano al 1,5-2%.
4. Fijar el animal al pie del microscopio personalizado con un tornillo M2 (u otro sistema de medida). Nivelar la ventana del cráneo.
   Nota: Es posible utilizar el sistema de fijación de la cabeza del fabricante microscopio, aunque la trama personalizada específica da mejores resultados (mejora de la estabilidad de la cabeza, posicionamiento constante en varias sesiones durante un experimento crónica).
5. El uso de los ajustes del microscopio de campo amplio y un centro de objetivo de baja magnificación de la vista en uno de los lados de la corteza retroesplenial y enfocarla en la superficie cubreobjetos.
6. Aplicar una gota de agua en el pozo de acrílico en forma de cráter. Cambiar a un objetivo de inmersión en agua a larga distancia. Mover el objetivo hacia la ventana del cráneo hasta que el menisco con aguanecta la muestra y objetiva.
7. Cambiar a la configuración de dos fotones y comenzar a escanear la parte superior a la inferior muestra el uso del zoom más bajo. El cruce de la duramadre será visible como un reflejo de la señal no específica alta.
8. Ajuste la configuración de adquisición de microscopio en ambos canales (GFP y mCherry) de acuerdo con la intensidad de señal de las células fluorescentes con el fin de cubrir todo el rango dinámico.
9. Después de encontrar una neurona adecuada (con el árbol dendrítico separado de otras células) realizar una exploración inicial usando sólo el filterset GFP con zoom más baja y la distancia z de 5 micras.
10. Obtener una proyección máxima de la pila de escaneado e imprimirlo para las anotaciones (utilizando colores invertidos).
11. Ajuste el zoom a un valor que permita a la imagen de los detalles morfológicos deseados. Imagen entera del árbol dendrítico en los canales de GFP y mCherry utilizando máxima proyección como guía.

Resultados

La expresión de GFP en un subconjunto de neuronas en el ratón reportero Thy1-GFP permite imágenes in vivo de las dendritas corticales y proyecciones axonales locales en RSC. La Figura 1A muestra la máxima proyección de una pila de imágenes con múltiples dendritas GFP-positivas visibles. El cuerpo de la célula es oscurecida por una arteria. La Figura 1B muestra una imagen ampliada de un solo plano (zoom digital 3x) de la rama dendrítica se indica...

Discusión

En el presente trabajo se presenta un protocolo para la utilización simultánea de dos fotones de imágenes in vivo de las entradas sinápticas y las metas post-sinápticas en RSC a través de una ventana del cráneo. El procedimiento de implantación consiste en varios pasos clave. En primer lugar, el animal se anestesió profundamente y se fija en el marco estereotáctico, entonces el cráneo sobre RSC se adelgaza con un taladro a lo largo de las líneas circulares marcados y se retira el hueso circular. Despué...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Fármaco
Isoflurano	Baxter	AErrane 8DG9623	5-2% preoperatorio
Isoflurano	Baxter	AErrane 8DG9623	1,5-2% durante la cirugía
Dexametasona	Scan Vet	Dexasone 2mg/ml	0,2 mg/kg
intramuscular Baytril	Bayer	2,50%	5 mg/kg por vía subcutánea
Tolfedina	Vetoquinol	4%	4 mg/kg por vía subcutánea
Butomidor	Richter Pharma	10 mg/ml	2 mg/kg por vía subcutánea
Carprofeno	KRKA-Polska	Rycarfa 50mg/ml	10 mg/kg por vía subcutánea
Lidocaína	Jelfa	Lignocainum	por vía tópica
Lidocaína	Jelfa	20 mg/g	por vía tópica
Surgery
Gelfoam	Ethicon	Spongostan dental; REF MS0005
Pomada para los ojos	Dedra	Lubrithal	pegamento tópico
CA	Pelikan Daniel	20G Huste Acrílico
dental	SpofaDental	Duracryl Plus
Marco estereotáxico	Stoelting	51500D
Tool
Coverglass	Harvard Aparato	HSE-64-0720	mm de diámetro
Taladro dental	Sigmed	Keystone KVet
Barra de fijación	a medida	pueden utilizar tuercas de tornillo N/A M2 o M3
Pinzas	Renex	PN-7B-SA
Micro tijeras	Falcon	BM.183.180
Microscopio de disección	KOZO	XTL6445T
Imaging
Holder frame	Hecho a medida	/A
Microscopio de dos fotones	Zeiss	Upright Axio Examiner Z1	Unidad láser: Camaleón coherente 690-1040nm con oscilador óptico paramétrico 1050-1300nm. Objetivos: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 y LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Detección: Filtros de paso de banda Zeiss BP 500-550 (GFP) y BP 570-610 (mCherry) separados por un divisor de haz a 560 nm y acoplados a dos fotodetectores de GaAsP.
< reactivo/>
	K. Deisseroth		Virus adenoasociado recombinante (rAAV) que expresa la proteína fluorescente mCherry bajo el control del promotor CaMK

3 N/A hecho Se N regalo