Simultánea de dos fotones<em&gt; En Vivo</em&gt; Imágenes de entradas sinápticas y Objetivos postsinápticos en la corteza del ratón retroesplenial

Resumen

Este video muestra el procedimiento de craneotomía que permite obtener imágenes crónicas de neuronas en la corteza retroesplenial de ratón utilizando microscopía in vivo de dos fotones en la línea transgénica Thy1-GFP. Este enfoque se combina con la inyección de virus adenoasociados que expresan mCherry en el hipocampo dorsal. Estas técnicas permiten el seguimiento a largo plazo de la plasticidad estructural dependiente de la experiencia en RSC.

Resumen

Este video muestra el procedimiento de craneotomía que permite obtener imágenes crónicas de las neuronas en la corteza retroesplenial (RSC) del ratón utilizando microscopía de dos fotones in vivo en la línea de ratones transgénicos Thy1-GFP. Este enfoque crea la posibilidad de investigar la correlación de las manipulaciones conductuales con los cambios en la morfología neuronal in vivo.

Se consideró que el procedimiento de implantación de la ventana craneal se limitaba solo a las regiones de la corteza de fácil acceso, como el campo de barril. Nuestro enfoque permite la visualización de neuronas en el RSC altamente vascularizado. RSC es un elemento importante del circuito cerebral responsable de la memoria espacial, que anteriormente se consideraba problemático para la obtención de imágenes in vivo de dos fotones.

La implantación de la ventana craneal sobre el RSC se combina con una inyección de virus adenoasociado recombinante que expresa mCherry (rAAV^mCherry) en el hipocampo dorsal. La mCherry expresada se extiende a proyecciones axonales desde el hipocampo hasta RSC, lo que permite la visualización de cambios tanto en los botones axonales presinápticos como en las espinas dendríticas postsinápticas en la corteza.

Esta técnica permite el monitoreo a largo plazo de la plasticidad estructural dependiente de la experiencia en RSC.

Introducción

microscopía de dos fotones revolucionó la observación de la actividad cerebral en vivir y comportarse animales. Desde su introducción en 1990, rápidamente ganó popularidad y ahora se implementa como uno de los enfoques más interesantes e innovadores en el examen de numerosos aspectos de la actividad cerebral in vivo ^1,2. Estas aplicaciones incluyen las mediciones de flujo de sangre, la activación neuronal (por ejemplo, utilizando indicadores de nivel de calcio o genes tempranos inmediatos de expresión) y la morfología de las células neuronales. Un número creciente de laboratorios utilizan microscopios de dos fotones, la aplicación de la t....

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales se describen a continuación fueron aprobados por el Comité Ético local en el Instituto Nencki of Experimental Biology, Academia de Ciencias de Polonia.

Nota: Algunas de las escenas en el vídeo asociado se aceleran. Factor de velocidad se indica en estas escenas.

1. Preparación para la Cirugía

1. Esterilizar todas las herramientas, envases de vidrio para líquidos y bastoncillos de algodón en el autoclave. Use guantes prescindibles. Limpiar la mesa de operaciones, el marco estereotáxico y todo lo que le rodea con etanol al 70%. Use una almohadilla quirúrgico estéri....

Resultados

La expresión de GFP en un subconjunto de neuronas en el ratón reportero Thy1-GFP permite imágenes in vivo de las dendritas corticales y proyecciones axonales locales en RSC. La Figura 1A muestra la máxima proyección de una pila de imágenes con múltiples dendritas GFP-positivas visibles. El cuerpo de la célula es oscurecida por una arteria. La Figura 1B muestra una imagen ampliada de un solo plano (zoom digital 3x) de la rama dendrítica se indica.......

Discusión

En el presente trabajo se presenta un protocolo para la utilización simultánea de dos fotones de imágenes in vivo de las entradas sinápticas y las metas post-sinápticas en RSC a través de una ventana del cráneo. El procedimiento de implantación consiste en varios pasos clave. En primer lugar, el animal se anestesió profundamente y se fija en el marco estereotáctico, entonces el cráneo sobre RSC se adelgaza con un taladro a lo largo de las líneas circulares marcados y se retira el hueso circular. Despué.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Fármaco
Isoflurano	Baxter	AErrane 8DG9623	5-2% preoperatorio
Isoflurano	Baxter	AErrane 8DG9623	1,5-2% durante la cirugía
Dexametasona	Scan Vet	Dexasone 2mg/ml	0,2 mg/kg
intramuscular Baytril	Bayer	2,50%	5 mg/kg por vía subcutánea
Tolfedina	Vetoquinol	4%	4 mg/kg por vía subcutánea
Butomidor	Richter Pharma	10 mg/ml	2 mg/kg por vía subcutánea
Carprofeno	KRKA-Polska	Rycarfa 50mg/ml	10 mg/kg por vía subcutánea
Lidocaína	Jelfa	Lignocainum	por vía tópica
Lidocaína	Jelfa	20 mg/g	por vía tópica
Surgery
Gelfoam	Ethicon	Spongostan dental; REF MS0005
Pomada para los ojos	Dedra	Lubrithal	pegamento tópico
CA	Pelikan Daniel	20G Huste Acrílico
dental	SpofaDental	Duracryl Plus
Marco estereotáxico	Stoelting	51500D
Tool
Coverglass	Harvard Aparato	HSE-64-0720	mm de diámetro
Taladro dental	Sigmed	Keystone KVet
Barra de fijación	a medida	pueden utilizar tuercas de tornillo N/A M2 o M3
Pinzas	Renex	PN-7B-SA
Micro tijeras	Falcon	BM.183.180
Microscopio de disección	KOZO	XTL6445T
Imaging
Holder frame	Hecho a medida	/A
Microscopio de dos fotones	Zeiss	Upright Axio Examiner Z1	Unidad láser: Camaleón coherente 690-1040nm con oscilador óptico paramétrico 1050-1300nm. Objetivos: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 y LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Detección: Filtros de paso de banda Zeiss BP 500-550 (GFP) y BP 570-610 (mCherry) separados por un divisor de haz a 560 nm y acoplados a dos fotodetectores de GaAsP.
< reactivo/>
	K. Deisseroth		Virus adenoasociado recombinante (rAAV) que expresa la proteína fluorescente mCherry bajo el control del promotor CaMK

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