Artículo de método

El radiomarcado y cuantificación de los niveles celulares de Fosfoinosítidos por acoplado a cromatografía líquida de alto rendimiento de flujo de centelleo

DOI:

10.3791/53529

⸱

6 de enero de 2016

 ,  , 
1Department of Chemistry and Biology, Program in Molecular Science, Ryerson University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fosfoinosítidos están señalando los lípidos cuya abundancia relativa cambia rápidamente en respuesta a diversos estímulos. Este artículo describe un método para medir la abundancia de fosfoinosítidos por las células metabólicamente etiquetado con 3 H- myo -inositol, seguido por extracción y desacilación. Glicero-inositides extraídos se separan luego por cromatografía líquida de alta resolución y cuantificados por centelleo de flujo.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los fosfoinositidos (PtdInsPs) son lípidos de señalización esenciales responsables de reclutar efectores específicos y conferir a los orgánulos identidad y función molecular. Cada una de las siete PtdInsPs varía en su distribución y abundancia, que están estrechamente reguladas por quinasas y fosfatasas específicas. La abundancia de PtdInsPs puede cambiar abruptamente en respuesta a varios eventos de señalización o perturbación de la maquinaria reguladora. Para comprender cómo estos eventos conducen a cambios en la cantidad de PtdInsP y su impacto resultante, es importante cuantificar los niveles de PtdInsP antes y después de un evento de señalización o entre condiciones de control y anormales. Sin embargo, debido a su baja abundancia y similitud, cuantificar las cantidades relativas de cada PtdInsP puede ser un desafío. En este artículo se describe un método para cuantificar los niveles de PtdInsP mediante el marcaje metabólico de células con 3-H-mio-inositol, que se incorpora a PtdInsPs. A continuación, los fosfolípidos se precipitan y se desacilan. Los 3H-glicero-inosítidos solubles resultantes se extraen posteriormente, se separan mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y se detectan mediante centelleo de flujo. Se describe en detalle el etiquetado y el procesamiento de muestras de levadura, así como la configuración instrumental para la HPLC y el centelleador de flujo. A pesar de perder información estructural sobre el contenido de la cadena de acilo, este método es sensible y se puede optimizar para cuantificar simultáneamente los siete PtdInsPs en las células.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los fosfoinositidos (PtdInsPs) son importantes fosfolípidos de señalización que ayudan a regular una variedad de funciones celulares, incluida la transducción de señales, el tráfico de membranas y la expresión génica, que luego modulan el comportamiento celular de orden superior, como la división celular, la identidad de orgánulos y la actividad metabólica1-3. Hay siete especies de PtdInsPs que se derivan de la fosforilación de las posiciones 3, 4 y/o 5 del grupo principal de inositol del fosfatidilinositol (PtdIns), el fosfolípido principal. Es importante destacar que las siete PtdInsP están distribuidas de manera desigual y la concentración local de cada especie de PtdInsP puede aumentar o disminuir en sitios subcelulares específicos donde se unen a un conjunto distinto de efectores de proteínas, lo que en conjunto permite que cada PtdInsP controle la identidad y función de su membrana huésped3,4. Además, los niveles de cada PtdInsP deben controlarse estrictamente, ya que esto puede afectar significativamente la intensidad de la señal producida por un PtdInsP. La localización y los niveles de cada PtdInsP dependen de la orientación y actividad de numerosas lípidos quinasas, fosfatasas y fosfolipasas que median la síntesis y el recambio de cada PtdInsP3,4. Por lo tanto, la mala regulación de la maquinaria reguladora de PtdInsP puede perturbar la función celular, lo que conduce a enfermedades como el cáncer y enfermedades degenerativas2,5,6. Para comprender completamente los roles y funciones de las PtdInsP y su maquinaria reguladora, se han desarrollado técnicas basadas en microscopía y bioquímicas para rastrear y cuantificar las PtdInsPs.

En muchos casos, las PtdInsPs se unen a sus efectores proteicos a través de un dominio proteico específico7-9. Estos módulos proteicos a menudo conservan sus propiedades adecuadas de plegamiento y reconocimiento de lípidos cuando se expresan por separado de la proteína completa. Esto dio lugar a sondas PtdInsP mediante la fusión de un dominio específico de proteína de unión a PtdInsP con una proteína fluorescente (FP) similar a la proteína fluorescente verde (GFP) para la detección subcelular de PtdInsP por microscopía. De hecho, muchos estudios han utilizado módulos de proteínas de unión a PtdInsP fusionados con FP para identificar la localización y la dinámica de especies específicas de PtdInsP mediante imágenes de células vivas1,10. Por ejemplo, el dominio de homología de Pleckstrin (PH) de la fosfolipasa C δ1 (PLCδ1) fusionado con GFP reconoce específicamente el fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato [PtdIns(4,5)P2] en la membrana plasmática, mientras que las copias en tándem del dominio FYVE del antígeno endosoma temprano 1 (EEA1) se han empleado para rastrear el fosfatidilinositol-3-fosfato (PtdIns3P) en los endosomas10-13. En general, las técnicas basadas en microscopía son excelentes para visualizar la localización y la dinámica de PtdInsP, pero hay varias advertencias, entre ellas que los dominios de unión a PtdInsP también pueden interactuar con factores adicionales además de las especies objetivo de PtdInsP y que no pueden detectar cambios por debajo de la fluorescencia citosólica de las sondas FP.

Las técnicas bioquímicas que incluyen la cromatografía en capa fina, la espectrometría de masas y el marcaje de radioisótopos también se pueden utilizar para caracterizar y cuantificar los niveles de cada PtdInsP14-16. Estos métodos requieren el aislamiento de lípidos para la detección de los niveles celulares de PtdInsPs. La espectrometría de masas se puede utilizar para caracterizar fosfolípidos a partir de extractos lipídicos y es invaluable para determinar la composición de la cadena de acilo de PtdInsPs14,17. Sin embargo, la espectrometría de masas es mayoritariamente semicuantitativa y sigue siendo difícil de resolver y cuantificar simultáneamente especies de PtdInsP del mismo peso molecular14,17. En comparación, el marcaje con radioisótopos de PtdInsPs seguido de centelleo de flujo acoplado a cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) es útil para la separación y cuantificación simultánea de las siete especies de PtdInsPs18. El uso de HPLC con una columna de intercambio aniónico fuerte (SAX) logra la separación basada en el peso molecular, la carga y la forma, fraccionando así los PtdInsP desacilados (Gro-InsPs) incluso del mismo peso molecular y carga. El acoplamiento del eluyente de HPLC a un centelleador de flujo genera picos de señal basados en radiactivos para cada especie de Gro-InsPs en relación con el glicerol-inositol original (Gro-Ins)18. En última instancia, esto corresponde a los niveles relativos de PtdInsPs en las células.

El radiomarcaje de PtdInsPs y el centelleo de flujo acoplado a HPLC es una herramienta útil para investigar la regulación y función del fosfatidilinositol 3,5-bisfosfato [PtdIns(3,5)P2], un PtdInsP que solo constituye ~0.1-0.3% de PtdIns16,19,20. La síntesis de PtdIns(3,5)P2 es realizada por la 5-quinasa PtdIns3P llamada Fab1 en levadura y PIKfyve en mamíferos21. Esta reacción es contrarrestada por una PtdIns(3,5)P2 5-fosfatasa llamada Fig4 en levaduras o mFig4/Sac3 en mamíferos22-24. Curiosamente, tanto PIKfyve/Fab1 como mFig4/Fig4/Sac3 existen en un solo complejo y están regulados por la proteína adaptadora del andamiaje, Vac14 en levadura o mVac14/ArPIKfyve en mamíferos25,26. En las células de levadura con deleción VAC14, Fab1 no funciona de manera eficiente, lo que lleva a una disminución del 90% en los niveles de PtdIns(3,5)P2 27,28. Por otro lado, Atg18 es una proteína efectora PtdIns(3,5)P2 que puede controlar la fisión vacuolar 29. Atg18 también es un regulador negativo de PtdIns(3,5)P2 ya que la deleción de su gen, ATG18, provoca un aumento de 10 a 20 veces en los niveles de PtdIns(3,5)P2 29,30. En general, los cambios en los niveles de PtdIns(3,5)P2 impactan severamente la función de la vacuola de levadura y los lisosomas de mamíferos, afectando consecuentemente procesos como el tráfico de membranas, la maduración de fagosomas, la autofagia y el transporte de iones 6,19,21,31.

Este artículo describe el proceso de marcaje de radioisótopos de PtdInsPs con 3 H-mio-inositol en levadura para detectar los niveles relativos de PtdIns(3,5)P2 en cepas de levadura de tipo salvaje, vac14Δ y atg18Δ. Usando esto como ejemplo, se muestran las capacidades de resolución de HPLC para la separación de PtdInsPs individuales, así como la sensibilidad del centelleo de flujo para la detección de trazas de 3-mio-inositol. También explicamos cómo se podría optimizar la metodología para etiquetar y separar 3PtdInsP marcadas con H de células de mamíferos, cuyas muestras tienden a ser más complejas ya que estas células poseen las siete especies de PtdInsP.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nota: El texto a continuación describe en detalle un método para medir PtdInsPs en la levadura. Proporciona los datos experimentales para las células de etiquetado de levadura con 3 H- myo -inositol, extrayendo y desacilante lípidos y un protocolo de HPLC-elución para fraccionar y cuantificar PtdInsPs desacilados. Tenga en cuenta que el etiquetado, desacilación, resolución y cuantificación de PtdInsPs en células de mamíferos requieren optimización y perfiles HPLC-elución más largos. Estos detalles se pueden encontrar en otros lugares, aunque se discuten algunos de los aspectos de la discusión. En general, la metodología para extraer los lípidos, desacilar y extraer el Gro-InsPs soluble en agua se da a partir de la levadura y se ilustra en la Figura 1.

1. Protocolo para el etiquetado y Análisis de PtdInsPs en levadura

  1. Cultivo de células y radiomarcaje
    1. Crecer un cultivo líquido de 20 ml de la SEY6210 cepa de levadura a 30 ° C con agitación constante en completa sintéticamedios de comunicación para la fase semilogarítmica o una densidad óptica a 600 nm (OD 600) de aproximadamente 0,6-0,7.
      Nota: No utilice medios YPD ya que esto puede afectar a 3 H- myo -inositol incorporación. Este tamaño de la cultura debe proporcionar material suficiente para 2-3 series de HPLC.
    2. Sedimenten un total de 10-14 OD de las células de levadura (tenga en cuenta que 1 ml de cultivo con una DO 600 = 1 contiene ~ 1x10 7 células) mediante centrifugación a 800 xg durante 5 min en un tubo de 12 ml de fondo redondo. Resuspender con 2 ml de-inositol libre de los medios de comunicación (IFM) (véase la Tabla 1 para la composición IFM).
    3. Repetir la centrifugación y aspirar los medios de comunicación. Resuspender el precipitado con 440 l de IFM y se incuba a TA durante 15 min.
    4. Añadir 60 l de 3 H- myo -inositol (1 l = 1 Ci) a cada muestra y se incuba a la creciente temperatura de 30 ° C durante 1 a 3 horas con agitación constante.
      Precaución: 3 myo H- -inositol es un compañero radiactivorial que debe ser manejado después de una formación adecuada. Además, todos los consumibles que hacen contacto con el material que contiene 3-H deben desecharse de manera adecuada y designados como residuos radiactivos.
      Nota: La temperatura de crecimiento se puede cambiar según sea necesario, siempre y cuando todas las cepas que deben compararse se cultivan a la misma temperatura.
    5. Transferir la suspensión celular (500 l) a un tubo de microcentrífuga que contiene 500 l de ácido perclórico 9% y 200 l de ácido lavó perlas de vidrio. Mezclar por inversión y se incuba en hielo durante 5 min.
    6. Vortex la muestra a la velocidad máxima durante 10 min y transferir los lisados ​​a un nuevo tubo de microcentrífuga usando una punta de carga de gel para evitar las perlas de vidrio.
    7. Se precipitan la muestra a 12.000 xg durante 10 min a 4 ° C y aspirar el sobrenadante.
    8. Resuspender el precipitado por sonicación baño en 1 ml de EDTA mM enfriado con hielo 100. Pellet de nuevo como antes.
  2. La desacilación y la extracción
    1. Recién preparar 5,0 ml del reactivo de desacilación mediante la combinación de 2,3 ml de metanol, 1,3 ml de metilamina al 40%, 0,55 ml de 1-butanol y 0,80 ml de agua. Invertir para mezclar.
    2. Aspirar el EDTA y sonicar el precipitado en 50 l de agua.
    3. Añadir 500 l de reactivo de desacilación y sonicar para mezclar. Incubar a TA durante 20 min.
    4. Lípidos de calor durante 50 minutos a 53 ° C en un bloque de calor. Secar las muestras completamente por centrifugación al vacío durante 3 horas o O / N.
      1. Asegúrese de que una trampa química se instala entre el vacío de centrífuga y la bomba de vacío para evitar que los vapores entren en el aire.
    5. Resuspender el precipitado con 300 l de agua por sonicación baño y se incuba a TA durante 20 min. Secar las muestras mediante centrifugación al vacío durante 3 horas o O / N. Repita este paso una vez más.
    6. Sonicar el sedimento con 450 l de agua. Esta es la fase acuosa durante la extracción.
    7. Recién preparar 10 ml de la extraction reactivo mediante la adición de 8,0 ml de 1-butanol, 1,6 ml de éter etílico y 0,40 ml de formiato de etilo. Invertir para mezclar.
    8. Añadir 300 l de reactivo de extracción de la de la fase acuosa. Vortex la mezcla a velocidad máxima durante 5 min y se separan las capas mediante centrifugación a velocidad máxima (18.000 xg) durante 2 min.
    9. Recoger la capa acuosa inferior en un nuevo tubo de microcentrífuga evitando al mismo tiempo la capa superior orgánica, la interfaz, y el sedimento. Repetir la extracción de la fase acuosa dos veces más con reactivo de extracción fresco.
    10. Completamente seca la capa acuosa se recogió por centrifugación al vacío. Dispersar el precipitado en 50 l de agua por sonicación baño.
    11. Añadir 2 l de cada muestra a 4 ml de fluido de centelleo en un vial de centelleo de 6 ml de polietileno. Determinar el número de cuentas (en CPM) en cada muestra mediante centelleo líquido usando una ventana abierta.
    12. Almacenar las muestras a -20 ° C hasta el momento de HPLC.
  3. Separación de3 H-glicero-inositides por HPLC
    1. Preparar el tampón A mediante el filtrado de 1 L de agua ultrapura con una botella 0,22 micras parte superior del filtro de vacío, seguido por desgasificación.
    2. Preparar el tampón B al hacer una solución 1 L de 1 M de fosfato dibásico de amonio (APS, MW 132,06) en agua y ajustar el pH a 3,8 con ácido fosfórico. Filtrar el fosfato de amonio con una botella superior filtro de 0,22 micras de vacío, seguido de desgasificación.
    3. Montar el vial para inyección mediante el equipamiento de un vial de 2 ml con un pequeño volumen 250 l inserto de resorte. Carga de 10 millones de CPM y añadir agua para un volumen total de 55 l. Prepare un frasco blanco con 55 l de agua.
    4. Tapar los viales con tapones de rosca equipados con una septa de PTFE / silicona (lado rojo hacia el interior del vial). Coloque cada vial en la bandeja de auto-muestreo de la HPLC, comenzando con el vial de blanco.
    5. Utilice un HPLC y el software asociado que controla el flujo de amortiguamiento, desgasifica tampones y los controles de la muestra injectien. Utilice un centelleador de flujo en línea y su software asociado para regular el caudal de líquido de centelleo y para monitorizar la señal H-3 decadencia.
      1. Utilice una columna de cromatografía líquida SAX con unas dimensiones de 250 mm x 4,6 mm y que contiene 5 micras de resina de sílice en el HPLC. Equipar la columna con un guardia de la columna para evitar la inyección de contaminantes.
      2. Instalar una celda de flujo de 500 l compatible con H 3 en el centelleo de flujo.
        NOTA: El fraccionamiento se puede hacer con un sistema de HPLC Agilent 1200 series infinito controlado por software Chemstation o con otros sistemas de HPLC disponibles comercialmente. De centelleo de flujo del eluyente de HPLC se puede hacer con un centelleador flujo β-RAM controlado por el software Laura u otro centelleador de flujo disponible comercialmente o software compatible.
    6. Inicialice la bomba cuaternaria con un caudal de 1,0 ml / min con tampón A. 100%
    7. Configurar un perfil de equilibrio en la HPLCpara controlar el gradiente de tampones A y B (llamar a este "Protocolo A equilibración"): 1% de tampón B durante 5 min, 1-100% de B durante 5 min, 100% de B durante 5 min, 100 a 1% de B durante 5 min, 1% de B durante 20 min. Establecer el límite de presión de 400 bar, 1,0 ml / min de caudal y 30 minutos el tiempo de ejecución.
    8. Configurar un perfil de elución (Figura 2) en el HPLC para controlar el gradiente de tampones A y B (llamar a este "Protocolo A"): 1% de B durante 5 min, 1.20% de B durante 40 min, 20 a 100% B durante 10 min, 100% de B durante 5 min, 100-1% de B durante 20 min, 1% de B durante 10 min. Establecer el límite de presión de 400 bar, 1,0 ml / min de caudal y 90 minutos el tiempo de ejecución.
    9. Establecer un protocolo de detección en el centelleo de flujo (llamar a este "Protocolo A de detección") para una duración de 60 minutos, con un caudal de fluido de centelleo de 2,5 ml / min y un tiempo de permanencia 8,57 seg.
    10. Programar una secuencia de inyección automatizada en el HPLC para comenzar con el blanco de agua en "Protocolo A equilibrado", seguido de correoada radiactivamente muestra sobre "Protocolo A". Inicialice la secuencia cuando esté listo.
    11. Mientras que la marcha todavía está en el protocolo de equilibrado, crear un proceso por lotes en el centelleador flujo para medir todas las muestras con "Protocolo de una detección." La inyección de cada nueva muestra inicializará "Protocolo A" en el HPLC, mientras que la activación de la centelleador flujo para comenzar "Protocolo A detección."
    12. A la finalización de todas las carreras, lave la HPLC, la columna y centelleador fluir con 100% de tampón A durante 30 min a 1,0 ml / min de caudal.
  4. Análisis de los datos
    1. Utilice software de Laura o cualquier otro software que pueda cuantificar los espectros de cromatografía. Los pasos descritos en esta sección se muestran en la Figura 3.
    2. Abrir los archivos haciendo clic en "Archivo", "Abrir" y seleccione el archivo de datos brutos para cada muestra.
    3. En la pestaña "cromatogramas", una zoom en estirar cada uno de los picos menores (unos 1.000 recuentos [eje y]) mientras que conserva la resolución de tiempo. Zoom en cada pico individual si es necesario.
    4. Resalte cada uno de los picos para el análisis con la función "Añadir ROI". Identificar picos por el tiempo de elución: Parental Gro-ins a los 10 minutos, Gro-Ins3P a los 18 min, Gro-Ins4P a 20 min, Gro-Ins (3,5) P 2 en 29 min y Gro-Ins (4,5 ) P 2 a los 32 min.
    5. En la pestaña de "mesas de las regiones", grabar el "área (cuenta)" de cada pico. Tenga en cuenta el "start (mm: ss)" el ​​tiempo y "fin (mm: ss)" tiempo de cada pico.
    6. Para la sustracción del fondo, resalte una región adyacente al pico que abarca la misma cantidad de tiempo. Restar el número de cuentas desde el pico correspondiente.
    7. Normalizar el área de cada pico contra parental Gro-Ins (expresado como "% de PtdIns totales"). Entonces, normalizar cada uno de los picos en cada condición experimental contra la condición de control (expresado como "naumento -fold comparación con el control ").
      NOTA: La normalización de cada pico también se puede hacer contra los recuentos totales pero ya que el parental Gro-Ins es mucho más abundante que todos los demás PtdInsPs los resultados tienden a ser similares.
    8. Exportar los datos de los cromatógrafos pulsando en "Archivo", "Guardar como ..." y elija el "CSV (separados por comas)" formato de archivo. Trazar los datos en una hoja de cálculo y presentar, según sea necesario.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Usando este método, PtdInsPs de levadura se marcaron metabólicamente con 3 H- myo -inositol. Después del marcaje, los fosfolípidos se precipitaron con ácido perclórico, seguido por desacilación fosfolípido y extracción de la Gro-InsPs soluble en agua (Figura 1). En esta etapa, es importante para cuantificar la señal radiactiva total asociado con el extraída Gro-InsPs por centelleo líquido para asegurar suficiente relación señal-ruido para los PtdInsPs...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En este artículo se detalla el protocolo experimental necesaria para cuantificar los niveles celulares de PtdnsPs por HPLC acoplado centelleo de flujo de la levadura. La metodología permite el etiquetado metabólico de PtdInsPs con 3 H- myo -inositol, seguido por el procesamiento de lípidos y la extracción de 3 H-Gro-InsPs, fraccionamiento HPLC soluble en agua y análisis. Usando este método, los niveles relativos de PtdInsPs en las células en diversas condiciones pueden ser cuantificados, t...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C.Y.H. fue apoyado por una Beca de Posgrado de Ontario del Gobierno de Ontario. Este artículo fue posible gracias a la financiación de R.J.B. del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería, el Programa de Cátedras de Investigación de Canadá y la Universidad de Ryerson.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1-ButanolBiobasicBC1800Grado reactivo
Fosfato de amonio dibásicoBioshopAPD001Grado ACS
Sulfato de amonioBiobasicADB0060Grado Ultra Puro
Muestreador automáticoAgilentG1329BAgilent 1260 serie infinity
BiotinaSigmaB4501
Ácido bóricoBiobasicBB0044
Cloruro de calcio deBiobasicCT1330Ahidro, grado industrial
Pantotenato de calcioSigmaC8731
Sulfato de cobre (II)Sigma451657D-glucosa anhidra
BiobasicGB0219Anhidro, grado biotecnológico
Modificación de Dulbecco de Eagle's Medium Life11995-065Con 4,5 g/L de glucosa, 110 mg/L de piruato, L-glutamina
Modificación de Dulbecco de Eagle's MediumMP biomedicals0916429 Con 4,5 g/L de glucosa, sin L-gluamina, sin inositol
EDTABiobasicEB0107de grado ultrapuro, libre de ácidos,
Caledon labs1/10/4700Anhidro, grado reactivo
Etilo de formiatoSigma112682Grado reactivo
Suero fetal bovinoWisent080-450de origen estadounidense, de primera calidad, inactivado
por calor Suero fetal bovino, Vida dializada26400044EE. UU. origen
FlowLogic ULabLogic Systems LtdSG-BXX-05Fluido de centelleo para centelleo de flujo 
Ácido fólicoBiobasicFB0466
Solución tampón HEPESSolución156300801 M
Inositol, Myo-[2-3H(N)]Perkin ElmerNET114005MCetanol 9:1 a agua
Insulina-Transferrina-Selenio-EtanolaminaVida51500056solución 100x
Cloruro de hierro (III)Sigma157740Reactivo grade
Laura - Software de análisis y recopilación de datos de cromatografíaLabLogic Systems LtdVersión 4.2.1.18Software de centelleo de flujo
L-glutamina SigmaG7513200  mM, solución, filtrada estérilmente, BioXtra, apta para cultivo celular
Cloruro de magnesioSigmaM8266
Sulfato de manganesoBiobasicMB0334Monohidrato, grado ACS
MetanolCaledon labs6701-7-40grado HPLC
Sigma 42646640% (v/v)
FosfatomonopotásicoBiobasicPB0445Anhidro, ácido
nicotínicoBiobasicNB0660Grado reactivo
OpenLAB CSD ChemStation AgilentRev. C.01.03 Software de HPLC
ácido p-aminobenzoico (PABA)BioshopPAB001.100Ácido libre
Penicilina-EstreptomicinaSigmaP4333100X, líquido, estabilizado, filtrado estéril, probado en cultivo celular
Ácido perclóricoSigma244252reactivo ACS, 70%
PhenoSpher Columna SAXPhenomenex00G-315-E05 µ m, 80 Å, 250 x 4,6 mm
Ácido fosfóricoCaledon labs1/29/8425Grado reactivo
Cloruro de potasioBiobásicoPB0440Grado ACS
Yoduro de potasioBiobásicoPB0443Grado ACS
Clorhidrato de piridoxinaSigmaP9755
Bomba cuaternariaAgilentG1311CAgilent 1260 serie infinity
RiboflavinaBioshopRIB333.100
Cloruro de sodioBiobasicDB0483
Molibdato de sodioSigma243655
Compartimento de columna termostatadoAgilentG1316AAgilent 1260 serie infinity
Clorhidrato de tiaminaSigmaT4625Grado de reactivo; hacer una solución de 0.02% (p/v), forma una suspensión. mezclar y congelar alícuotas
Ultima GoldPerkin Elmer 6013321Centelleo para el conteo de centelleo líquido
Sulfato de zincBiobasicZB2906Heptahidratado, grado reactivo
β-RAM 4Sistemas IN/USModelo 4Centelleador de flujo - 500 µ L celda de flujo; Analizador de centelleo de flujo radiomático alternativo de Perkin Elmer 
grado de biología molecular Éter etílico de grado USP Life anhidro Solución de metilamina de de grado ACS de grado USP de grado biotecnológico

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443 (7112), 651-657 (2006).
  2. Bridges, D., Saltiel, A. R. Phosphoinositides and Disease. Curr. Top. Microbiol. Immuno. 362, 61-85 (2012).
  3. Botelho, R. J. Changing phosphoinositides "on the fly": How trafficking vesicles avoid an identity crisis. BioEssays. 31 (10), 1127-1136 (2009).
  4. Simonsen, A., Wurmser, A. E., Emr, S. D., Stenmark, H. The role of phosphoinositides in membrane transport. Curr. Opin. Cell. Biol. 13 (4), 485-492 (2001).
  5. Katso, R., Okkenhaug, K., Ahmadi, K., Timms, J., Waterfield, M. D. Cellular Function of Phosphoinositide 3-Kinases: Implications for Development, Immunity, Homeostasis, and Cancer. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 615-675 (2001).
  6. Lenk, G. M., Meisler, M. H. Mouse models of PI(3,5)P2 deficiency with impaired lysosome function. Methods. Enzymo. 534, Elsevier Inc. (2014).
  7. Lemmon, M. A. Phosphoinositide recognition domains. Traffic. 4 (4), 201-213 (2003).
  8. Cullen, P. J., Cozier, G. E., Banting, G., Mellor, H. Modular phosphoinositide-binding domains-their role in signalling and membrane trafficking. Curr. Biol. 11 (21), R882-R893 (2001).
  9. Balla, T. Inositol-lipid binding motifs: signal integrators through protein-lipid and protein-protein interactions. J. Cell. Sci. 118 (Pt 10), 2093-2104 (2005).
  10. Burd, C. G., Emr, S. D. Phosphatidylinositol(3)-phosphate signaling mediated by specific binding to RING FYVE domains. Mol. Cell. 2 (1), 157-162 (1998).
  11. Lemmon, M. A., Ferguson, K. M., O'Brien, R., Sigler, P. B., Schlessinger, J. Specific and high-affinity binding of inositol phosphates to an isolated pleckstrin homology domain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92 (23), 10472-10476 (1995).
  12. Scott, C. C., et al. Phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis. J. Cell. Biol. 169 (1), 139-149 (2005).
  13. Gillooly, D. J., et al. Localization of phosphatidylinositol 3-phosphate in yeast and mammalian cells. EMBO J. 19 (17), 4577-4588 (2000).
  14. Haag, M., Schmidt, A., Sachsenheimer, T., Brügger, B. Quantification of Signaling Lipids by Nano-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry (Nano-ESI MS/MS). Metabolites. 2 (1), 57-76 (2012).
  15. Furutani, M., Itoh, T., Ijuin, T., Tsujita, K., Takenawa, T. Thin layer chromatography-blotting, a novel method for the detection of phosphoinositides. J. Biochem. 139 (4), 663-670 (2006).
  16. Cooke, F. T., et al. The stress-activated phosphatidylinositol 3-phosphate 5-kinase Fab1p is essential for vacuole function in. 8 (22), 1219-1222 (1998).
  17. Milne, S. B., Ivanova, P. T., DeCamp, D., Hsueh, R. C., Brown, H. A. A targeted mass spectrometric analysis of phosphatidylinositol phosphate species. J. Lipid. Res. 46 (8), 1796-1802 (2005).
  18. Rusten, T. E., Stenmark, H. Analyzing phosphoinositides and their interacting proteins. Nat. methods. 3 (4), 251-258 (2006).
  19. Ho, C. Y., Alghamdi, T. A., Botelho, R. J. Phosphatidylinositol-3,5-bisphosphate: no longer the poor PIP2. Traffic. 13 (1), 1-8 (2012).
  20. Samie, M., et al. A TRP channel in the lysosome regulates large particle phagocytosis via focal exocytosis. Dev. Cel. 26 (5), 511-524 (2013).
  21. Shaw, J. D., Hama, H., Sohrabi, F., DeWald, D. B., Wendland, B. PtdIns(3,5)P2 is required for delivery of endocytic cargo into the multivesicular body. Traffic. 4 (7), 479-490 (2003).
  22. Botelho, R. J., Efe, J. A., Emr, S. D. Assembly of a Fab1 phosphoinositide kinase signaling complex requires the Fig4 phosphoinositide phosphatase. Mol. Biol. Cell. 19, 4273-4286 (2008).
  23. Rudge, S. A., Anderson, D. M., Emr, S. D. Vacuole size control: Regulation of PtdIns(3,5)P2 levels by the vacuole-associated Vac14-Fig4 complex, a PtdIns(3,5)P2-specific phosphatase. Mol. Biol. Cell. 15, 24-36 (2004).
  24. Sbrissa, D., et al. Core protein machinery for mammalian phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate synthesis and turnover that regulates the progression of endosomal transport: Novel Sac phosphatase joins the ArPIKfyve-PIKfyve complex. J. Biol. Chem. 282 (33), 23878-23891 (2007).
  25. Alghamdi, T. A., et al. Vac14 protein multimerization is a prerequisite step for Fab1 protein complex assembly and function. J. Biol. Chem. 288 (13), 9363-9372 (2013).
  26. Ikonomov, O. C., Sbrissa, D., Fenner, H., Shisheva, A. PIKfyve-ArPIKfyve-Sac3 core complex: Contact sites and their consequence for Sac3 phosphatase activity and endocytic membrane homeostasis. J. Biol. Chem. 284 (51), 35794-35806 (2009).
  27. Dove, S. K., et al. Vac14 controls PtdIns(3,5)P(2) synthesis and Fab1-dependent protein trafficking to the multivesicular body. Curr. Biol. 12 (11), 885-893 (2002).
  28. Bonangelino, C. J., et al. Osmotic stress-induced increase of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate requires Vac14p, an activator of the lipid kinase Fab1p. J. Cell. Biol. 156 (6), 1015-1028 (2002).
  29. Dove, S. K., et al. Svp1p defines a family of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate effectors. EMBO J. 23 (9), 1922-1933 (2004).
  30. Efe, J. A., Botelho, R. J., Emr, S. D. Atg18 regulates organelle morphology and Fab1 kinase activity independent of its membrane recruitment by phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate. Mol. Biol. Cell. 18 (1), 4232-4244 (2007).
  31. Odorizzi, G., Babst, M., Emr, S. D. Fab1p Ptdlns(3)P 5-kinase function essential for protein sorting in the multivesicular body. Cell. 95 (6), 847-858 (1998).
  32. Duex, J. E., Nau, J. J., Kauffman, E. J., Weisman, L. S. Phosphoinositide 5-phosphatase Fig4p is required for both acute rise and subsequent fall in stress-induced phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate levels. Eukaryotic Cell. 5 (4), 723-731 (2006).
  33. Whiteford, C. C., Best, C., Kazlauskas, A., Ulug, E. T. D-3 phosphoinositide metabolism in cells treated with platelet-derived growth factor. Biochem J. 319 (3), 851-860 (1996).
  34. Murthy, P. P., et al. Evidence of two isomers of phosphatidylinositol in plant tissue. Plant physiology. 98 (4), 1498-1501 (1992).
  35. Zolov, S. N., et al. In vivo, Pikfyve generates PI(3,5)P2, which serves as both a signaling lipid and the major precursor for PI5P. Proc. 109 (43), 17472-17477 (2012).
  36. McEwen, R. K., et al. Complementation analysis in PtdInsP kinase-deficient yeast mutants demonstrates that Schizosaccharomyces pombe and murine Fab1p homologues are phosphatidylinositol 3-phosphate 5-kinases. J. Biol. Chem. 274 (48), 33905-33912 (1999).
  37. Tolias, K. F., et al. Type I phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinases synthesize the novel lipids phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate and phosphatidylinositol 5- phosphate. J. Biol. Chem. 273 (29), 18040-18046 (1998).
  38. Ikonomov, O. C., et al. The phosphoinositide kinase PIKfyve is vital in early embryonic development: preimplantation lethality of PIKfyve-/- embryos but normality of PIKfyve+/- mice. J. Biol. Chem. 286 (15), 13404-13413 (2011).
  39. Sarkes, D., Rameh, L. E. A Novel HPLC-Based Approach Makes Possible the Spatial Characterization of Cellular PtdIns5P and Other Phosphoinositides. Biochem J. 428 (3), 375-384 (2011).
  40. Sbrissa, D., Ikonomov, O. C., Filios, C., Delvecchio, K., Shisheva, A. Functional dissociation between PIKfyve-synthesized PtdIns5P and PtdIns(3,5)P2 by means of the PIKfyve inhibitor YM201636. Am. J. Physiol. Cel. Physiol. 303 (4), 436-446 (2012).
  41. D'Souza, K., Epand, R. M. Enrichment of phosphatidylinositols with specific acyl chains. Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 1838 (6), 1501-1508 (2014).
  42. Shulga, Y. V., Anderson, R. A., Topham, M. K., Epand, R. M. Phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase isoforms exhibit acyl chain selectivity for both substrate and lipid activator. J. Biol. Chem. 287 (43), 35953-35963 (2012).
  43. Pettitt, T. R., Dove, S. K., Lubben, A., Calaminus, S. D. J., Wakelam, M. J. O. Analysis of intact phosphoinositides in biological samples. J. Lipid. Res. 47 (7), 1588-1596 (2006).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Phosphoinositide QuantificationHPLC Flow ScintillationTritium LabelingYeast Cell AnalysisPhospholipid ExtractionDeacylation ProcedureRadioactive DetectionGradient ElutionPeak IntegrationData Normalization

Artículos relacionados