Fosfoinosítidos están señalando los lípidos cuya abundancia relativa cambia rápidamente en respuesta a diversos estímulos. Este artículo describe un método para medir la abundancia de fosfoinosítidos por las células metabólicamente etiquetado con 3 H- myo -inositol, seguido por extracción y desacilación. Glicero-inositides extraídos se separan luego por cromatografía líquida de alta resolución y cuantificados por centelleo de flujo.
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Artículo de método
El radiomarcado y cuantificación de los niveles celulares de Fosfoinosítidos por acoplado a cromatografía líquida de alto rendimiento de flujo de centelleo
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En este artículo
Resumen
Resumen
Los fosfoinositidos (PtdInsPs) son lípidos de señalización esenciales responsables de reclutar efectores específicos y conferir a los orgánulos identidad y función molecular. Cada una de las siete PtdInsPs varía en su distribución y abundancia, que están estrechamente reguladas por quinasas y fosfatasas específicas. La abundancia de PtdInsPs puede cambiar abruptamente en respuesta a varios eventos de señalización o perturbación de la maquinaria reguladora. Para comprender cómo estos eventos conducen a cambios en la cantidad de PtdInsP y su impacto resultante, es importante cuantificar los niveles de PtdInsP antes y después de un evento de señalización o entre condiciones de control y anormales. Sin embargo, debido a su baja abundancia y similitud, cuantificar las cantidades relativas de cada PtdInsP puede ser un desafío. En este artículo se describe un método para cuantificar los niveles de PtdInsP mediante el marcaje metabólico de células con 3-H-mio-inositol, que se incorpora a PtdInsPs. A continuación, los fosfolípidos se precipitan y se desacilan. Los 3H-glicero-inosítidos solubles resultantes se extraen posteriormente, se separan mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y se detectan mediante centelleo de flujo. Se describe en detalle el etiquetado y el procesamiento de muestras de levadura, así como la configuración instrumental para la HPLC y el centelleador de flujo. A pesar de perder información estructural sobre el contenido de la cadena de acilo, este método es sensible y se puede optimizar para cuantificar simultáneamente los siete PtdInsPs en las células.
Introducción
Los fosfoinositidos (PtdInsPs) son importantes fosfolípidos de señalización que ayudan a regular una variedad de funciones celulares, incluida la transducción de señales, el tráfico de membranas y la expresión génica, que luego modulan el comportamiento celular de orden superior, como la división celular, la identidad de orgánulos y la actividad metabólica1-3. Hay siete especies de PtdInsPs que se derivan de la fosforilación de las posiciones 3, 4 y/o 5 del grupo principal de inositol del fosfatidilinositol (PtdIns), el fosfolípido principal. Es importante destacar que las siete PtdInsP están distribuidas de manera desigual y la concentración local de cada ....
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Protocolo
Nota: El texto a continuación describe en detalle un método para medir PtdInsPs en la levadura. Proporciona los datos experimentales para las células de etiquetado de levadura con 3 H- myo -inositol, extrayendo y desacilante lípidos y un protocolo de HPLC-elución para fraccionar y cuantificar PtdInsPs desacilados. Tenga en cuenta que el etiquetado, desacilación, resolución y cuantificación de PtdInsPs en células de mamíferos requieren optimización y perfiles HPLC-elución más largos. Estos detalles se pueden encontrar en otros lugares, aunque se discuten algunos de los aspectos de la discusión. En general, la metodología para extraer los lípidos, d....
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Resultados
Usando este método, PtdInsPs de levadura se marcaron metabólicamente con 3 H- myo -inositol. Después del marcaje, los fosfolípidos se precipitaron con ácido perclórico, seguido por desacilación fosfolípido y extracción de la Gro-InsPs soluble en agua (Figura 1). En esta etapa, es importante para cuantificar la señal radiactiva total asociado con el extraída Gro-InsPs por centelleo líquido para asegurar suficiente relación señal-ruido para los PtdInsPs.......
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Discusión
En este artículo se detalla el protocolo experimental necesaria para cuantificar los niveles celulares de PtdnsPs por HPLC acoplado centelleo de flujo de la levadura. La metodología permite el etiquetado metabólico de PtdInsPs con 3 H- myo -inositol, seguido por el procesamiento de lípidos y la extracción de 3 H-Gro-InsPs, fraccionamiento HPLC soluble en agua y análisis. Usando este método, los niveles relativos de PtdInsPs en las células en diversas condiciones pueden ser cuantificados, t.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
C.Y.H. fue apoyado por una Beca de Posgrado de Ontario del Gobierno de Ontario. Este artículo fue posible gracias a la financiación de R.J.B. del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería, el Programa de Cátedras de Investigación de Canadá y la Universidad de Ryerson.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1-Butanol | Biobasic | BC1800 | Grado reactivo |
| Fosfato de amonio dibásico | Bioshop | APD001 | Grado ACS |
| Sulfato de amonio | Biobasic | ADB0060 | Grado Ultra Puro |
| Muestreador automático | Agilent | G1329B | Agilent 1260 serie infinity |
| Biotina | Sigma | B4501 | |
| Ácido bórico | Biobasic | BB0044 | |
| Cloruro de calcio de | Biobasic | CT1330 | Ahidro, grado industrial |
| Pantotenato de calcio | Sigma | C8731 | |
| Sulfato de cobre (II) | Sigma | 451657 | D-glucosa anhidra |
| Biobasic | GB0219 | Anhidro, grado biotecnológico | |
| Modificación de Dulbecco de Eagle's Medium Life | 11995-065 | Con 4,5 g/L de glucosa, 110 mg/L de piruato, L-glutamina | |
| Modificación de Dulbecco de Eagle's Medium | MP biomedicals | 0916429 | Con 4,5 g/L de glucosa, sin L-gluamina, sin inositol |
| EDTA | Biobasic | EB0107 | de grado ultrapuro, libre de ácidos, |
| Caledon labs | 1/10/4700 | Anhidro, grado reactivo | |
| Etilo de formiato | Sigma | 112682 | Grado reactivo |
| Suero fetal bovino | Wisent | 080-450 | de origen estadounidense, de primera calidad, inactivado |
| por calor Suero fetal bovino, Vida dializada | 26400044 | EE. UU. origen | |
| FlowLogic U | LabLogic Systems Ltd | SG-BXX-05 | Fluido de centelleo para centelleo de flujo |
| Ácido fólico | Biobasic | FB0466 | |
| Solución tampón HEPES | Solución | 15630080 | 1 M |
| Inositol, Myo-[2-3H(N)] | Perkin Elmer | NET114005MC | etanol 9:1 a agua |
| Insulina-Transferrina-Selenio-Etanolamina | Vida | 51500056 | solución 100x |
| Cloruro de hierro (III) | Sigma | 157740 | Reactivo grade |
| Laura - Software de análisis y recopilación de datos de cromatografía | LabLogic Systems Ltd | Versión 4.2.1.18 | Software de centelleo de flujo |
| L-glutamina Sigma | G7513 | 200 mM, solución, filtrada estérilmente, BioXtra, apta para cultivo celular | |
| Cloruro de magnesio | Sigma | M8266 | |
| Sulfato de manganeso | Biobasic | MB0334 | Monohidrato, grado ACS |
| Metanol | Caledon labs | 6701-7-40 | grado HPLC |
| Sigma 426466 | 40% (v/v) | ||
| Fosfato | monopotásicoBiobasic | PB0445 | Anhidro, ácido |
| nicotínico | Biobasic | NB0660 | Grado reactivo |
| OpenLAB CSD ChemStation | Agilent | Rev. C.01.03 | Software de HPLC |
| ácido p-aminobenzoico (PABA) | Bioshop | PAB001.100 | Ácido libre |
| Penicilina-Estreptomicina | Sigma | P4333 | 100X, líquido, estabilizado, filtrado estéril, probado en cultivo celular |
| Ácido perclórico | Sigma | 244252 | reactivo ACS, 70% |
| PhenoSpher Columna SAX | Phenomenex | 00G-315-E0 | 5 µ m, 80 Å, 250 x 4,6 mm |
| Ácido fosfórico | Caledon labs | 1/29/8425 | Grado reactivo |
| Cloruro de potasio | Biobásico | PB0440 | Grado ACS |
| Yoduro de potasio | Biobásico | PB0443 | Grado ACS |
| Clorhidrato de piridoxina | Sigma | P9755 | |
| Bomba cuaternaria | Agilent | G1311C | Agilent 1260 serie infinity |
| Riboflavina | Bioshop | RIB333.100 | |
| Cloruro de sodio | Biobasic | DB0483 | |
| Molibdato de sodio | Sigma | 243655 | |
| Compartimento de columna termostatado | Agilent | G1316A | Agilent 1260 serie infinity |
| Clorhidrato de tiamina | Sigma | T4625 | Grado de reactivo; hacer una solución de 0.02% (p/v), forma una suspensión. mezclar y congelar alícuotas |
| Ultima Gold | Perkin Elmer 6013321 | Centelleo para el conteo de centelleo líquido | |
| Sulfato de zinc | Biobasic | ZB2906 | Heptahidratado, grado reactivo |
| β-RAM 4 | Sistemas IN/US | Modelo 4 | Centelleador de flujo - 500 µ L celda de flujo; Analizador de centelleo de flujo radiomático alternativo de Perkin Elmer |
Referencias
- Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443 (7112), 651-657 (2006).
- Bridges, D., Saltiel, A. R. Phosphoinositides and Disease. Curr. Top. Microbiol. Immuno. 362, 61-85 (2012).
- Botelho, R. J.
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Reimpresiones y permisos
