Artículo de método

Un estudio de la complejación de Mercurio (II) con Dicysteinyl tetrapéptidos por electrospray espectrometría de masas de ionización

DOI:

10.3791/53536

⸱

8 de enero de 2016

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1Department of Chemistry and Biochemistry, University of North Carolina at Greensboro, 2Department of Chemistry, Winston-Salem State University

En este artículo

Resumen

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Se presenta la caracterización de complejos formados en diferentes proporciones relativas de mercurio(II) a tetrapéptidos dicysteinil mediante espectrometría de masas orbitrap de ionización por electrospray.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En este estudio evaluamos un método para la caracterización de complejos, formados en diferentes proporciones relativas de mercurio(II) a tetrapéptido dicysteinilo, por espectrometría de masas orbitrap de ionización por electrospray. Esta estrategia se basa en la caracterización exitosa previa de complejos de mercurio-dicitensteinilo que involucran tripéptidos mediante la utilización de espectrometría de masas, entre otras técnicas. El cloruro de mercurio (II) y un tetrapéptido dicysteinil se incubaron en un medio tamponado desgasificado en proporciones estequiométricas variables. Los complejos formados se analizaron posteriormente en un espectrómetro de masas por electrospray que consistía en un analizador de masas lineal híbrido de iones y orbis trampa. Los espectros de espectrometría de masas de ionización por electrospray (ESI-MS) se adquirieron en modo positivo y los picos observados se analizaron para determinar los distintos patrones de distribución isotópica del mercurio y los picos monoisotópicos asociados. Este trabajo demuestra que se puede determinar una estequiometría precisa del mercurio y el péptido en los complejos formados bajo condiciones de ionización por electrospray especificadas mediante el uso de ESI MS de alta resolución basada en distintos patrones de distribución isotópica de mercurio.

Introducción

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Los fármacos clínicos actuales prescritos para la terapia de quelación de la intoxicación por mercurio1 contienen grupo(s) tiol(es), que es/son responsables de unir y secuestrar los iones de mercurio2,3. Sin embargo, los estudios han demostrado que estos pequeños compuestos tioles [ácido dimercaptosuccínico (DMSA) y ácido dimercaptopropano-sulfónico (DMPS)] no son óptimos para la terapia de quelacióndel mercurio 4-6. Por lo tanto, es necesario comprender la asociación y las tendencias de formación compleja del mercurio con los tioles para mejorar el diseño racional de fármacos de compuestos tioles para la quelación del mercurio. Recientemente, informamos que los tripéptidos de n-alquilo y arilo dicysteinil con grupos ditiol pueden servir como "anclajes dobles" efectivos para acomodar los sitios de coordinación de mercurio (II) para formar complejos 1:1 de mercurio (II):p péptido y 1:2 de mercurio (II) :(péptido)2 7. Además, estudiamos el efecto del aumento de los residuos de cistinilo en formaciones de tipo complejo8. En este estudio, investigamos la asociación del mercurio (II) con dos tetrapéptidos de dicistenilo, donde los residuos de cisteínilo están separados por dos residuos de aminoácidos. Con el fin de evaluar el efecto de los grupos de unión auxiliares para el mercurio, los aminoácidos intermedios son dos residuos de glicina (no sustituidos) o dos residuos de ácido glutámico (gamma-carboxilado).

La reacción del péptido cisteínilo con el mercurio (II) requiere condiciones que impidan la oxidación de los grupos cisteinil tiol para formar enlaces disulfuro9. Además, la asociación del mercurio (II) con los péptidos de cistinilo para formar varios tipos de complejos de mercurio-péptido depende de la proporción inicial de mercurio (II): péptido en la mezcla de reacción7,8. Los tipos de complejos de mercurio-péptidos formados en estas mezclas de reacción pueden analizarse mediante espectroscopia de masas de ionización suave, que es una herramienta analítica sensible para determinar las interacciones de las especies entre los iones metálicos y los péptidos10-14. En consecuencia, proporcionará un perfil de los diversos tipos de aductos de péptidos mercuriados que se forman bajo una condición de ionización por electrospray especificada. Aquí, mostraremos cómo los péptidos de cistinílo y las soluciones de cloruro de mercurio (II) se pueden preparar en una solución tampón de formiato de amonio desgasificada cubierta con argón para minimizar la oxidación. Al hacer reaccionar diferentes equivalentes molares de mercurio (II) con tetrapéptidos dicistetinilo, mostraremos cómo la proporción inicial de péptido de mercurio (II) :p tiene un efecto sobre los tipos de complejos formados. También mostraremos cómo la espectrometría de masas de ionización por electrospray (ESI) se puede utilizar como herramienta de caracterización para proporcionar una estequiometría precisa de mercurio a péptido en los complejos formados. El protocolo de vídeo asociado demostrará las condiciones experimentales para la preparación de los complejos de mercurio, el procedimiento para analizar las mezclas de reacción en condiciones de ionización por electropulverización especificadas y la caracterización de las estequiometrías de los complejos de tetrapéptidos de mercurio (II)-dicysteinilo, sobre la base de los distintos patrones de distribución de isótopos de mercurio, utilizando el programa ChemCal15. Está destinado a ayudar a aquellos que estén interesados en utilizar la espectrometría de masas ESI orbitrap para analizar varios complejos formados por iones metálicos que existen en diferentes formas isotópicas.

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Protocolo

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Nota: Por favor consulte a todas las hojas de datos de seguridad de materiales pertinentes (MSDS) antes de usar. Cloruro de mercurio es una sustancia química tóxica. Equipo de protección personal (guantes, gafas de seguridad y bata de laboratorio) deben ser usados ​​cuando entregarlo y todas las soluciones asociadas. Deshágase de las soluciones en botellas de residuos químicos etiquetados claramente designadas para los metales pesados.

1. Preparación de 5 mM desgasificado formiato de amonio Buffer, pH 7,5

  1. Disolver 0,1576 g de tampón de formiato de amonio en 450 ml de agua de grado HPLC. Ajustar el pH de la solución anterior con 1 M de ácido fórmico y de hidróxido de amonio 1 M a 7,5. Transferir dicha solución a un matraz aforado de 500 ml y añadir agua HPLC a la línea de calibración para hacer una solución de formiato de amonio 5 mM.
  2. Desgasificar la 5 mM de tampón de formiato de amonio en virtud de un sistema de vacío durante 10 min y purga con argón. Repetir dos veces y solución de tienda bajo argón. En el día de uso, filtrar la solución tampón a través de un filtro de 0,2 micras se acabene uso.

2. Preparación de mercurio (II) Cloruro de Soluciones

  1. Pesar 0,2375 g de mercurio (II). Disolver en 25 ml de tampón de formiato de amonio 5 mM para producir una (II) solución de cloruro de 0.035 M mercurio.
  2. Añadir 0,214 ml de solución 0,035 M de mercurio (II) cloruro de 9.785 ml de 5 mM de tampón de formiato de amonio para crear una solución 7,5 x 10 -4 M. Manta la solución 7,5 x 10 -4 M de mercurio (II) con gas argón.

3. Preparación de CGGC de la Solución

  1. Disolver 2,0 mg del tetrapéptido dicysteinyl, CGGC, en 0.118 ml de acetonitrilo de grado HPLC y luego añadir 1,0647 ml de formiato de amonio 5 mM, pH 7,5 tampón que ha sido desgasificado en argón para dar una solución madre 5 mM CGGC.
  2. Añadir 225 l de la solución madre 5 mM CGGC a 1.275 l de 5 mM formación de amonio pH 7,5 tampón para dar una solución M CGGC 7,5 x 10 -4.

4. Preparaciónde diversas mezclas de reacción de mercurio (II) y CGGC

  1. Preparación de 1: 0,5 proporción de mercurio (II): solución CGGC
    1. Coloque de 255 l de formiato de amonio 5 mM, tampón pH 7,5 en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Añadir 30 l de solución de mercurio (II) cloruro de 7,5 x10 -4 M en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con el tampón de formiato de amonio.
    2. Vortex la solución durante 10 s. A continuación, añadir 15 l de 7,5 x 10 -4 M solución CGGC en el microcentrífuga de 1,5 ml. Vortex la solución durante 10 s. Dejar reposar la solución durante 10 min antes de la inyección en el espectrómetro de masas.
  2. Preparación de 1: 1 relación de mercurio (II): solución CGGC
    1. Coloque 240 l de formiato de amonio 5 mM, tampón pH 7,5 en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Añadir 30 l de solución de mercurio (II) cloruro de 7,5 x10 -4 M en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con el tampón de formiato de amonio.
    2. Vortex la solución durante 10 s. entoncesañadir 30 l de 7,5 x 10 -4 M CGGC solución en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Repetir de manera similar a la descrita en el apartado 4.1.
  3. Preparación de 1: 2 proporción de mercurio (II): solución CGGC
    1. Coloque 210 l de formiato de amonio 5 mM, tampón pH 7,5 en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Añadir 30 l de solución de mercurio (II) cloruro de 7,5 x10 -4 M en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con el tampón de formiato de amonio.
    2. Vortex la solución durante 10 s. A continuación, añadir 60 l de 7,5 x 10 -4 M CGGC solución en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Repetir de manera similar a la descrita en el apartado 4.1.

5. Preparación de PECO Stock Solución

  1. Disolver 3,5 mg del tetrapéptido dicysteinyl, PECO, en 0.145 ml de acetonitrilo de grado HPLC para disolver el péptido. A continuación, añadir 13.067 ml de formiato de amonio 5 mM, pH 7,5 tampón que ha sido desgasificado en argón para producir 0,5 mSolución M PECO.
  2. Vortex la solución hasta que se disuelva todo péptido. Añadir 1,125 ml de 0,5 mM solución PECO y 0,375 ml de 5 mM de formiato de amonio, pH 7,5 tampón a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para dar una solución x 10 -5 M PECO 7.5. Vortex hasta que se mezcle.

6. Preparación de diversas mezclas de reacción de mercurio (II) y la solución PECO

  1. Preparación de 1: 0,5 proporción de mercurio (II): solución de PECO
    1. Coloque de 255 l de formiato de amonio 5 mM, tampón pH 7,5 en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Añadir 30 l de solución de mercurio (II) cloruro de 7,5 x10 -4 M en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con el tampón de formiato de amonio.
    2. Vortex la solución durante 10 s. A continuación, añadir 15 l de 7,5 x 10 -4 M PECO solución en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Repetir de manera similar a la descrita en el apartado 4.1.
  2. Preparación de 1: 1 relación de mercurio (II): solución de PECO
    1. Coloque 24081; l de formiato de amonio 5 mM, tampón pH 7,5 en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Añadir 30 l de solución de mercurio (II) cloruro de 7,5 x10 -4 M en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con el tampón de formiato de amonio.
    2. Vortex la solución durante 10 s. A continuación, añadir 30 l de 7,5 x 10 -4 M PECO solución en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Repetir de manera similar a la descrita en el apartado 4.1.
  3. Preparación de 1: 2 proporción de mercurio (II): solución de PECO
    1. Coloque 210 l de formiato de amonio 5 mM, tampón pH 7,5 en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Añadir 30 l de solución de mercurio (II) cloruro de 7,5 x10 -4 M en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con el tampón de formiato de amonio.
    2. Vortex la solución durante 10 s. A continuación, añadir 60 l de 7,5 x 10 -4 M PECO solución en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Repetir de manera similar a la descrita en el apartado 4.1.

7. Analyzing las mezclas de reacción de mercurio (II) y muestras CGGC por espectrometría de masas ESI Orbitrap

  1. Preparar el espectrómetro de masas ESI 16
    1. Dibuje 100 l de estándares de calibración en una jeringa de vidrio de 500 l.
    2. Coloque la jeringa en la cuna de la bomba de jeringa MS, conecte el tubo, e inyectar en el espectrofotómetro de masas.
    3. Configure el nombre de archivo para la carrera seleccionando el icono del archivo y escribiendo el nombre del archivo.
    4. Seleccione el botón de datos adquieren en el módulo de adquisición de datos y recoger 150 exploraciones.
    5. Analizar el cromatograma para verificar los estándares de calibración mediante la apertura del módulo de procesamiento de datos del software. Abra el módulo, vaya al menú Archivo y seleccione "Abrir" y seleccione el archivo en el cuadro de diálogo. Compruebe que los picos en el cromatograma se correlacionan con la masa para cargar proporciones de los estándares.
    6. Limpie la jeringa de vidrio de 500 l mediante la elaboración de 500 l de metanol grado HPLC y luego distribuir el metanol en un vaso de precipitados.
    7. Elaborar 500 l de metanol grado HPLC en la jeringa de vidrio y limpiar el sistema como en el paso 7.1.2.
    8. Seleccione el módulo de configuración de métodos de software para ajustar los parámetros. Seleccione el menú de modo de exploración e identificar el analizador como FTMS, y luego haga clic en "Aceptar". A continuación, haga clic en los varios iconos en la página de vista de espectro en tiempo real, establecer los siguientes parámetros: Envoltura caudal de gas: 10, la temperatura Fuente: 0, la tensión capilar: 37 V, lente del tubo: 95 V, el voltaje de pulverización: 4,20 kV , caudal 10,00 l / min, Analizador: FTMS, Número de exploraciones: 150.
  2. Ejecución de muestras CGGC en ESI espectrómetro de masas
    1. Ejecutar el formiato de amonio, pH 7,5 5 mM.
      1. Coloque 500 l de tampón de formiato de amonio 5 mM en la jeringa de vidrio de 500 l, colocarlo en el soporte de jeringa de la bomba de la EM, y conecte el tubo.
      2. Ejecutar tampón a través del tubo durante 1-2 min.
      3. Configure el nombre de archivo para la carreraseleccionando el icono del archivo y escribiendo el nombre del archivo.
      4. Seleccione el botón de datos adquieren en el módulo y recoger 150 exploraciones.
      5. Haga clic en el botón de ejecución para detener colección después se recogen 150 exploraciones.
      6. Abra el módulo explorador de datos, a continuación, vaya al menú Archivo y seleccione "Abrir" y seleccione el archivo en el cuadro de diálogo. Verifique que no hay picos a 483, 683, 1.163 y 1.363 m / z están presentes que se asemejan al péptido o mercurio (II) -péptido.
    2. Ejecute el 1: 0,5 de mercurio (II): Solución relación CGGC.
      1. Colocar 250 ml de 1: 0,5 de mercurio (II): relación CGGC de la muestra en la jeringa.
      2. Coloque la jeringa en la cuna de la bomba de jeringa MS, conecte el tubo, y el primer aparato.
      3. Seleccione un nombre de archivo para la carrera seleccionando el icono del archivo y escribiendo el nombre del archivo.
      4. Pulse el botón de datos adquieren en el módulo de adquisición de datos y recoger 150 exploraciones y haga clic en el botón de ejecución para detener la colección.
      5. Abra el módulo, vaya al menú Archivo y seleccione "Abrir" y seleccione el archivo en el cuadro de diálogo. Verifique que el cromatograma contiene picos incluyendo el uno para el péptido CGGC solo.
      6. Lavar la jeringa mediante la aspiración con 500 l de tampón formiato de amonio y luego dispensar el tampón de formiato amónico en un vaso de precipitados.
      7. Seleccione el botón de residuos en la MS y lave el tubo tres veces con tampón de formiato amónico 500 l.
      8. Lavar la jeringa mediante la aspiración con 500 l de metanol y luego dispensar el metanol en un vaso de precipitados.
      9. Enjuague bien el tubo una vez con 500 l de metanol.
      10. Seleccione el botón detector de carga en la MS.
      11. Añadir 500 l de tampón de formiato de amonio a la jeringa.
      12. Coloque la jeringa en la cuna de la bomba de jeringa MS, conecte el tubo, y el primer aparato.
      13. Seleccione un nombre de archivo para la memoria intermedia de ejecutar seleccionando el icono del archivo y escribiendo el nombre del archivo.
      14. oprimael botón y datos adquieren recoger 150 exploraciones y luego haga clic en el botón de parada de ejecución.
      15. Abra el módulo de datos del navegador, vaya al menú Archivo y seleccione "Abrir" y seleccione el archivo en el cuadro de diálogo. Verifique que el cromatograma es nula de los picos de los últimos Hg: run CGGC.
    3. Ejecute el 1: 1 de mercurio (II): Solución relación CGGC.
      1. Colocar 250 ml de 1: 1 de mercurio (II): relación CGGC muestra en la jeringa.
      2. Repita de una manera similar a la descrita para los pasos 7.2.2.2 a 7.2.2.15.
    4. Ejecute el 1: 2 de mercurio (II): Solución relación CGGC
      1. Colocar 250 ml de 1: 2 de mercurio (II): CGGC muestra la concentración en la jeringa.
      2. Repita de una manera similar a la descrita para los pasos 7.2.2.2 a 7.2.2.15.

8. Analizar las mezclas de reacción de Mercurio y muestras de los PECO por Orbitrap ESI Espectrometría de Masas

  1. Ejecución de las muestras de los PECO en ESI espectrómetro de masas
    1. Repita el procedimiento de análisis (Pasos 7.1 a 7.2), utilizando muestras de los PECO y las mezclas de reacción de mercurio (II) y los PECO en diversas proporciones estequiométricas.

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Resultados

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Se realizó un estudio para caracterizar la posible composición compleja de mercurio de péptido durante dos tetrapéptidos, CGGC y PECO (Figura 1) por espectrometría de masas ESI. Los complejos de mercurio (II) con CGGC o PECO se investigaron mediante la reacción de las mezclas de mercurio (II) y soluciones de péptidos en tres proporciones diferentes molares: 1: 0,5, 1: 1 y 1: 2 (mercurio (II): péptido) . La concentración de mercurio (II) fue de 7,5 x 10 -6 M y ...

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Discusión

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El tetrapéptido dicysteinyl hidrófobo CGGC (C 10 H 18 N 4 O 5 S 2; MW = 338) (Figura 1), forma complejos con mercurio (II) como se muestra en la Figura 2 y la Tabla 1 Además, forma dímeros peptídicos y trímeros. incremental a medida que la cantidad de péptido aumentos en la mezcla de reacción. Como se muestra por los valores de m / z de los dímeros asociados [(2M + ...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

No hay divulgación para el trabajo informado.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MN-S reconoce el apoyo de la National Science Foundation, RUI conceder CHE 1011859. Los autores agradecen el Fondo Tríada Espectrometría de Masas de la Universidad de Carolina del Norte en Greensboro para el uso del espectrómetro de masas Thermo Fisher Scientific LTQ Orbitrap XL. Los autores agradecen a Daniel Todd, Vincent Sica y Brandie Erhmann en la Universidad de Carolina del Norte en Greensboro para sugerencias y comentarios útiles con respecto a este trabajo.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Cloruro de mercurio (II)Sigma-Aldrich429724Altamente tóxico
Formiato de amonioSigma-Aldrich516961
Ácido fórmicoSigma-AldrichF0507
Hidróxido de amonioFisherA512-P500
HPLC aguaFisherW5-4
HPLC AcetonitriloFisherBP2405-1
HPLC MetanolFisherA452-4

Referencias

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