Con el fin de identificar nuevas mutaciones que afectan a la mecanosensación, diseñamos un ensayo que mide la respuesta conductual a la estimulación táctil de las cerdas de mosca en clones mutantes generados por el método MARCM. La combinación de técnicas permite la identificación de mutaciones mecanosensibles que, de otro modo, serían letales.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Un ensayo de conducta para Mechanosensation de clones en MARCM-basa
En este artículo
Resumen
Resumen
Debido a la homología estructural y funcional de las células pilosas del oído interno de los mamíferos, las neuronas que inervan los órganos de los sentidos externos de Drosophila proporcionan un excelente sistema modelo para el estudio de mechanosensation. Este protocolo describe un comportamiento simple toque en moscas de la fruta que se pueden usar para identificar mutaciones que interfieren con mechanosensation. La estimulación táctil de un macrochaete de cerdas en el tórax de la mosca provoca un reflejo de aseo de la primera o tercera pierna. Las mutaciones que interfieren con mechanotransduction (tales como NOMPC), o con otros aspectos del arco reflejo, pueden inhibir la respuesta preparación. Una pantalla tradicional de conductas adultas habría perdido mutantes que tienen un papel esencial durante el desarrollo. En lugar de ello, este protocolo combina la pantalla táctil con el análisis de mosaico con un marcador de células reprimible (MARCM) para permitir sólo las regiones limitadas de células mutantes homocigotos para ser generado y marcado por la exprESIÓN de la proteína fluorescente verde (GFP). Al probar clones MARCM para las respuestas de comportamiento anormales, es posible para escrutar una colección de mutaciones letales p de elementos para buscar nuevos genes implicados en mechanosensation que habrían sido perdidas por métodos más tradicionales.
Introducción
Los seres humanos confían en la capacidad de convertir los estímulos mecánicos de su entorno, como el tacto, la presión, la vibración o las ondas sonoras, en información sensorial que puede ser procesada por el sistema nervioso, en un proceso denominado mecanotransducción. Muchas de las características mecanicistas generales de la mecanotransducción entre humanos e invertebrados son las mismas1, lo que convierte a Drosophila en un modelo útil para estudiar los mecanismos moleculares de la mecanotransducción. Drosophila melanogaster contiene dos conjuntos de órganos sensoriales especializados (Tipo I y II) que son capaces de convertir los estímulos mecánicos en potenciales de acción. Los mecanorreceptores de tipo I tienen una neurona con una sola dendrita o proceso sensorial, rodeada por tres células de soporte2. Los mecanorreceptores de tipo I incluyen mecanorreceptores de cerdas, órganos cordotonales sensibles al oído (el órgano de Johnston) y sensilla campaniforme que transmiten información sobre los latidos de las alas3. Las cerdas que cubren la cara dorsal de la mosca son las más abundantes y de fácil acceso de los órganos de tipo I. De manera similar al entorno extracelular de las células ciliadas asociadas con la audición y el equilibrio en los vertebrados, las células de soporte que rodean a las neuronas mecanosensibles a las moscas secretan una endolinfa con alto contenido de potasio que crea un gradiente de concentración inusual para el potasio1. Las neuronas mecanosensibles, tanto de los mamíferos como de las moscas, utilizan este alto contenido de potasio extracelular para despolarizar la célula. En respuesta a la estimulación mecánica de las cerdas de los macroquetos hacia la pared del cuerpo, las neuronas sensoriales responden con una ráfaga de potenciales de acción impulsada por esta despolarización de potasio de la membrana celular4. Las neuronas sensoriales de Drosophila que inervan las cerdas se asemejan a las células mecanosensibles de otros organismos, incluidas las células ciliadas de los vertebrados, tanto en su estructura como en su función1,5. La accesibilidad de los órganos sensoriales externos de Drosophila a la manipulación experimental y la abundancia de técnicas genéticas disponibles para los investigadores hacen de Drosophila un excelente sistema modelo para investigar los fundamentos moleculares de la mecanosensación.
En la mosca, la estimulación de una sola neurona sensorial que inerva una cerda conduce a una respuesta conductual observable. La estimulación de diferentes cerdas evoca respuestas conductuales específicas y reproducibles, dependiendo de la cerda que se estimula. Tras la estimulación táctil, las moscas de tipo salvaje decapitadas exhiben un complejo reflejo de acicalamiento en el que limpian el área cerca de la cerda estimulada con un conjunto de movimientos de patas5-7. Cuando son homocigotas para mutaciones conocidas de un solo gen que interfieren con el aprendizaje7 o la coordinación y la actividad locomotora5, las moscas responden anormalmente a la estimulación mecánica. Por lo tanto, este reflejo de acicalamiento es una herramienta útil para estudiar los efectos de las mutaciones de un solo gen en un comportamiento específico y replicable.
La robusta respuesta conductual a la estimulación de una sola cerda de macrochete tiene el potencial de ayudar a identificar nuevos genes implicados en la mecanotransducción. Este protocolo se utiliza para probar una colección de moscas mutantes en ausencia de una respuesta conductual para indicar que la mutación interfiere con la mecanosensación. En la colección de mutantes seleccionada para el cribado, las mutaciones causan letalidad antes de la edad adulta y, por lo tanto, sería imposible de probar con los exámenes tradicionales de comportamiento en adultos. Originalmente, esta colección de elementos p letales se combinó con sitios de recombinación de FRT para probar defectos de crecimiento celular en clones. Los clones se hicieron específicamente en el ojo porque las moscas adultas pueden sobrevivir en el laboratoriosin visión funcional. Sin embargo, la eliminación de todas las mecanosensaciones puede hacer que los adultos estén gravemente descoordinados o mueran antes de la eclosión5. Este protocolo utiliza un enfoque de mosaico para eludir la letalidad de las mutaciones y permitir la realización de pruebas en la etapa adulta. Se utiliza una técnica genética llamada Análisis en Mosaico con un Marcador de Células Represibles (MARCM)9 para generar células mutantes homocigóticas en un número limitado de órganos sensoriales de moscas adultas, mientras que el resto del organismo permanece heterocigótico. Estas moscas MARCM sobreviven fácilmente hasta la edad adulta, sin embargo, las cerdas son homocigóticas para los genes letales de interés.
MARCM permite que se generen regiones de células mutantes homocigóticas y se marquen mediante la expresión de la proteína verde fluorescente (GFP), mientras que el resto del organismo permanece heterocigoto en ese locus particular y sin marcar9. MARCM combina mutaciones individuales del elemento p con cinco elementos genéticos comunes: GFP bajo el control de una secuencia activadora ascendente (UAS-GFP), proteína represora Gal80 bajo el control de un promotor general (tub-Gal80), factor de transcripción Gal4 bajo control de un promotor general (tub-Gal4), la enzima recombinasa FRT expresada a través de un promotor controlado por choque térmico y un sitio de recombinación FRT10. Al impulsar la recombinación mitótica a través de una recombinasa activada por choque térmico, un número limitado de células se vuelven homocigóticas para la mutación y se marcan con GFP. La expresión de GFP es reprimida en las células heterocigóticas por la presencia de Gal80 en la copia de tipo salvaje del cromosoma.
Un protocolo de choque térmico para MARCM fue optimizado para inducir la recombinación en los órganos sensoriales externos de las cerdas de mosca, mientras que gran parte del organismo permanece heterocigoto y, por lo tanto, no está marcado con GFP. Las moscas mosaico generadas utilizando este protocolo contenían mutaciones homocigóticas con mayor frecuencia en las cerdas centrales postalares o dorsales en la superficie del notum.
Hemos probado la utilidad de esta combinación de MARCM y la pantalla de comportamiento de acicalamiento con un mutante mecanosensible conocido, NOMPC. El canal iónico, sin potencial mecanorreceptor C (NOMPC), es un componente esencial de la vía de mecanotransducción en Drosophila5,11-13. NOMPC pertenece a la superfamilia de canales catiónicos5 de potencial receptor transitorio (TRP) y cumple todos los criterios para calificar como un canal mecanosensible en Drosophila14,15: 1) NOMPC se expresa en las puntas ciliadas de las neuronas sensoriales tipo 1 de Drosophila 13,16-18, 2) las larvas nulas de NOMPC no tienen una respuesta eléctrica a la estimulación táctil13, 3) La expresión ectópica de NOMPC en células insensibles al tacto puede inducir sensibilidad a la estimulación mecánica13, 4) la expresión heteróloga de NOMPC en células Schneider 2 produce un canal mecanosensible13, y 5) los mutantes adultos de NOMPC muestran defectos en su respuesta a la estimulación mecánica5. Dada esta evidencia, predijimos que los clones mutantes de NOMPC mostrarían una respuesta de acicalamiento alterada o inhibida en respuesta a la estimulación mecánica de las cerdas.
Se desarrolló un stock de MARCM que contiene la mutación NOMPC para su uso en un experimento de prueba de principio del ensayo de acicalamiento. Las moscas mosaico fueron estimuladas en las cerdas de los macroquetos que contenían células homocigóticas mutantes de NOMPC. Esperábamos una inhibición de la respuesta de acicalamiento tras la estimulación de la cerda de los macroquetos. Descubrimos que solo 2 de las 14 moscas de cerdas mutantes analizadas dieron una sola respuesta a la estimulación repetida; La mayoría no respondió a la estimulación de la cerda mutante homocigótica. Una vez confirmado que este ensayo conductual basado en MARCM produce un reflejo de acicalamiento anormal en un mutante del mosaico mecanosensible conocido, esta técnica puede utilizarse en un cribado de mutaciones mecanosensibles adicionales.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. Los cruces de generar moscas MARCM
- Mantener moscas en medios de harina de maíz melaza (6,5 g / L de agar; 23.5 g / L de levadura; 60 g / L de harina de maíz, 60 ml de melaza / l; 4 ml / mezcla de ácido L; 0,13% Tegosept) o medios de comunicación estándar de Drosophila a 22 grados Celsius en una luz de 12 h / oscuridad ciclo.
Nota: A Inferior a temperatura estándar se utiliza para mantener MARCM stocks saludable. Esto amplía el tiempo de desarrollo entre el huevo y la edad adulta a 14 días. - Utilice hembras vírgenes (aproximadamente 1 - 8 días de edad) de una población-MARCM listo que contiene los elementos genéticos necesarios (GFP bajo el control de una secuencia de activación aguas arriba (UAS-GFP), la proteína represora GAL80, el factor de transcripción Gal4, una choque térmico recombinasa impulsada, y un sitio de recombinación FRT).
Nota: Nuestro MARCM listos stocks contienen los siguientes genotipos: elavGal4, UAS-CD8-GFP, hs-flipase; FRT40A, tubGal80 / CyO; tubGal4 / TM3Sb.
Nota: El sitio FRT específico dependerá de la localización de la mutaciónen el genoma. Por ejemplo, FRT40A se utiliza para probar las mutaciones en el brazo izquierdo del cromosoma 2, como NOMPC (ver 10 para obtener más detalles sobre los protocolos MARCM). - Cross-MARCM listo hembras vírgenes a los varones que contienen una mutación de interés y su sitio FRT correspondiente (por ejemplo, en peso; NOMPC3, FRT40A / CYO; + / +). Para controlar para la inducción MARCM eficaz, establecer una segunda cruz usando las moscas macho que contienen el mismo sitio de FRT, pero sin una mutación. Utilice una relación aproximada de 5 hembras: 1 masculina en cruces.
2. Programado Huevo Acostado
- Después de permitir que las moscas para aparearse durante al menos una noche, mover adultos en nuevos viales con medio fresco. Permitir a las moscas a poner huevos en un ambiente oscuro durante aproximadamente 4 horas antes de transferir nuevamente las cruces en nuevos viales. Tenga en cuenta los tiempos de inicio y fin del período de puesta de huevos.
Nota: Los intervalos más cortos son aceptables cuando parece que hay un alto número de huevos en los medios de comunicación antes de la final de la InterVA 4-hrl.- Mantenga los frascos con un número suficiente de huevos (aproximadamente es mayor de 20) y almacenar en una luz de 12 h / oscuridad ciclo a 22 grados Celsius a ser calor conmocionado después.
Nota: Frascos con un bajo número de huevos en los medios de comunicación (menos de aproximadamente el 20) es poco probable que producir un número suficiente de moscas adultas para las pruebas de comportamiento, y en aras de la eficiencia, se recomienda que no se conservarán para su análisis posterior.
Nota: Nuestros moscas se crían con las luces encendidas 08 a.m.-8 p.m.. Hemos encontrado el tiempo de la tarde puntos conducen a densidades más altas de huevo, por lo tanto, por lo general realizar cruces cronometrados entre 4-8 pm y 20:00 medianoche. Las moscas ponen sus huevos a temperatura ambiente en un armario oscuro y luego se devuelven a la incubadora al día siguiente con el fin de no perturbar el ciclo luz-oscuridad regular en la incubadora.
- Mantenga los frascos con un número suficiente de huevos (aproximadamente es mayor de 20) y almacenar en una luz de 12 h / oscuridad ciclo a 22 grados Celsius a ser calor conmocionado después.
3. Realice choque térmico para inducir recombinación mitótica
- Aproximadamente 85 a 100 horas después de la puesta de huevos, lugar vmate- en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 1 hora. Asegúrese de que el nivel del agua alcanza por encima de la altura de los medios de comunicación en los viales, pero no anula completamente los viales para evitar que las larvas de ahogarse.
- Retirar los viales del baño de agua y permitir un período de recuperación de 1 hora a temperatura ambiente.
- Coloque los viales de nuevo en 37 grados centígrados baño de agua durante 1 hora.
- Retire los viales de baño de agua y almacenar en la incubadora de 12 horas de luz / oscuridad ciclo a los 22 grados Celsius, hasta la eclosión.
4. Preparación para las pruebas de comportamiento
- Tras la eclosión, anestesiar las moscas en el hielo. Seleccione moscas con genotipos que contienen todos los elementos genéticos para MARCM e indican probablemente se observaron clones de expresión marcadas GFP a partir de los marcadores fenotípicos observables utilizados en las existencias de los padres. Decapitar a las moscas con iridectomía tijeras.
Nota: Por ejemplo, hemos seleccionado para las moscas sin los marcadores genéticos CyO (alas rizadas) y Sb (cerda rastrojo) para identimoscas fy que contener todos los elementos genéticos necesarios para crear regiones de mosaico marcadas con GFP.
Nota: La decapitación es necesario para prevenir los adultos a partir de volar lejos cuando son estimuladas. - Coloque moscas sin cabeza en un ambiente cerrado, húmedo y permitir que aproximadamente el 10 - 20 h de recuperación. Sólo uso vuela sí mismos ese derecho cuando perturbado para su análisis posterior. Prueba vuela dentro de 30 horas de la decapitación.
5. Pruebas de Comportamiento
- Mediante la observación de las moscas decapitados bajo un microscopio de fluorescencia de disección, identificar clones homocigotos marcados con GFP en los órganos sensoriales externas de cerdas. Registre el nombre de cerdas y el lado izquierdo o derecho. Para eliminar cualquier sesgo potencial, el miembro del laboratorio que realiza la estimulación de cerdas debe ser ciego al genotipo de la cerda, de tipo salvaje o mutante.
- Provocar un reflejo de aseo desviando la GFP marcado cerdas hacia el cuerpo de la mosca con un pelo tieso o unas pinzas finas y observar la pierna rerespuesta. Dar una puntuación de uno a moscas que levantan la pierna en respuesta a la estimulación de cerdas y una puntuación de cero a las moscas que no se mueven sus piernas.
Nota: Previo estudios 6,7 han caracterizado la respuesta de la pierna que está provocada por la estimulación de una cerda en particular. Esto incluye la pierna que responde a cada cerda y la proporción de moscas que responden a la estimulación de ese cerdas particular. Sólo nos marcamos para los movimientos de la pierna que esperábamos para responder en base a la clasificación de Vandervorst 6. - Llevar a cabo cinco ensayos espaciados 2 minutos de diferencia.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
El éxito de este protocolo depende en gran medida del rendimiento total de moscas comprobables, la eficacia del choque térmico para inducir recombinación mitótica, y la capacidad de obtener una respuesta de comportamiento robusto en moscas estimuladas a intervalos de 2 min. Dado que aproximadamente el 12,5% de los embriones contiene los elementos necesarios MARCM y un estimado de 16,67% de los adultos que Eclose tener el potencial para la expresión de GFP, es crítica para obtener un alto...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Este protocolo utiliza un ensayo de comportamiento adulto para la detección de mutaciones que afectan mechanosensation en Drosophila. Debido a que la colección de mutantes contiene letales mutaciones p-elemento que impida la detección como adultos, este protocolo hace uso de una técnica genética compleja primero descrito por Lee y Luo , (1999) y detallada como un protocolo por Wu y Luo, (2006) para eludir la letalidad adulto. MARCM induce la recombinación mitótica entre cromosomas homólogos para generar regione...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer al Centro Bloomington de valores, Liqun Luo, Charles Zuker, y Lily y Yuh Nung Jan como la generosa distribución de las poblaciones de la mosca y la siguiente para su financiación: SOMAS-URM (JD y SW), Licenciado Ford Facultad Summer Fellowship (SW), BD Corporación Summer Research Fellowship (a CL y DL), El Renee y Anthony M. Marlon, MD '63 Summer Research Fellowship (DL) James C. '75 y Jane Colihan verano Becas de Investigación (A) a través de los Antiguos Alumnos / Padres Fondo de Investigación de Verano de la Universidad de la Santa Cruz y la Fundación de Investigación de Verano Stransky Fellowship (TO). Un agradecimiento especial al Departamento de Biología y la Oficina del Decano de Colegio de la Santa Cruz por el apoyo de todo el trabajo en el laboratorio.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Levadura de cerveza (25 lb) | MP Biomedicals | ICN90331225 | Comida para moscas |
| Maíz (25 lb) | MP Biomedicals | ICN90141125 | Comida para moscas |
| Agar (1 lb) | MoorAgar Inc. | 41004 | Comida para moscas |
| Tegosept (5 kg) | Genesee | 20-259 | Melaza para moscas |
| (1 galón) | Marca Sugarmill - Thomsen Food Service 0 | 2625 | Comida para moscas |
| Ácido propiónico | Fisher | A258-500 | Comida para moscas |
| Ácido fosfórico | Fisher | A260-500 | Comida para moscas |
| Viales de Drosophila, estrechos (PS) | Genesee | 32-109 | Cultivos de moscas |
| Botella de fondo cuadrado de 6 oz (PP) | Genesee | 32-130 | Fly Cultures |
| Flugs - Botellas de plástico para moscas | Genesee | 49-100 | Fly Cultures |
| Bolas de rayón, grandes | Genesee | 51-100 | Fly Cultures |
| Droso-Filler, estrecho | Genesee | 59-168 | Preparación de alimentos para moscas |
| Droso-Filler, botellas | Genesee | 59-170 | Fly Food Preparación |
| 8A-C / agitador de laboratorio accionado por engranajes con montaje de abrazadera en C 1/15 HP, 700 rpm velocidad variable, 115 V, 50/60 Hz | Cleveland Mixer | 8A-C | Fly Food Preparation |
| Hervidor | de agua Preparación de alimentos para moscas | ||
| crecimiento diurna | Forma Scientific | Temperatura y ciclo de luz/oscuridad controlados | |
| Baño de agua | VWR | Para calor | |
| choque Microtijeras | Herramientas de Bellas Ciencias | 15000-08 | Para la extracción de cabezas |
| Microscopio de disección por fluroscencia | Zeiss | SteREO Discovery V8 | Con filtro de paso de banda GFP cube (KSC295-814D) |
| Zeiss | X-Cite 120 | fuente de luz fluroscence | hace que esto sea fácil de configurar |
| Cámara para visor | Zeiss | AxioCam ICc1 | |
| Software de adquisición de imágenes | Zeiss | ||
| para antesia fría | |||
| Bandeja | para la decapitación de antesis fría | ||
| Cajas | de plástico para la recuperación de moscas descautivadas en ambiente húmedo |
Referencias
- Grünert, U., Gnatzy, W. K+ and Ca++ in the receptor lymph of arthropod cuticular mechanoreceptors. J Comp Physiol A. 161, 329-333 (1987).
- Kernan, M. J. Mechanotransduction and auditory transduction in Drosophila. Pflugers Arch. 454, 703-720 (2007).
- Gillespie, P. G., Walker, R. G. Molecular basis of mechanosensory transduction. Nature. 413, 194-202 (2001).
- Corfas, G., Dudai, Y. Adaptation and fatigue of a mechanosensory neuron in wild-type Drosophila and in memory mutants. J Neurosci. 10, 491-499 (1990).
- Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila. Neuron. 12, 1195-1206 (1994).
- Vandervorst, P., Ghysen, A. Genetic control of sensory connections in Drosophila. Nature. 286, 65-67 (1980).
- Corfas, G., Dudai, Y. Habituation and dishabituation of a cleaning reflex in normal and mutant Drosophila. J Neurosci. 9, 56-62 (1989).
- Chen, J., et al. Discovery-based science education: functional genomic dissection in Drosophila by undergraduate researchers. PLoS Biol. 3, e59(2005).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila. Nature Protocols. 1, 2583-2589 (2006).
- Eberl, D. F., Hardy, R. W., Kernan, M. J. Genetically similar transduction mechanisms for touch and hearing in Drosophila. J Neurosci. 20, 5981-5988 (2000).
- Walker, R. G., Willingham, A. T., Zuker, C. S. A Drosophila mechanosensory transduction channel. Science. 287, 2229-2234 (2000).
- Yan, Z., et al. Drosophila NOMPC is a mechanotransduction channel subunit for gentle-touch sensation. Nature. 493, 221-225 (2013).
- Arnadottir, J., Chalfie, M. Eukaryotic Mechanosensitive Channels. Annual Review of Biophysics. 39, 111-137 (2010).
- Christensen, A. P., Corey, D. P. TRP channels in mechanosensation: direct or indirect activation? Nature Reviews Neuroscience. 8, 510-521 (2007).
- Cheng, L. E., Song, W., Looger, L. L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The Role of the TRP Channel NompC in Drosophila Larval and Adult Locomotion. Neuron. 67, 373-380 (2010).
- Lee, J., Moon, S., Cha, Y., Chung, Y. D. Drosophila TRPN(=NOMPC) channel localizes to the distal end of mechanosensory cilia. PLoS One. 5, e11012(2010).
- Liang, X., Madrid, J., Saleh, H. S., Howard, J. NOMPC, a Member of the TRP Channel Family, Localizes to the Tubular Body and Distal Cilium of Drosophila Campaniform and Chordotonal Receptor Cells. Cytoskeleton. 68, 1-7 (2011).
- de Vries, S. E., Clandinin, T. R. Loom-sensitive neurons link computation to action in the Drosophila visual system. Curr Biol. 22, 353-362 (2012).
- Jarman, A. P. Studies of mechanosensation using the fly. Hum Mol Genet. 11, 1215-1218 (2002).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
