Artículo de método

Resolución de alta Análisis Cuantitativo Inmunoelectrónica de Receptores de Membrana en la retina cinta sinapsis

DOI:

10.3791/53547

⸱

18 de febrero de 2016

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1Synaptic Physiology Section, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Advanced Imaging Core, National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El método de inmunogold postincrustado es una de las formas más efectivas de proporcionar análisis de alta resolución de la localización subcelular de moléculas específicas. En este trabajo describimos un protocolo para analizar cuantitativamente los receptores de glutamato en las sinapsis de la cinta retiniana.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las células ganglionares de la retina (RGCs) reciben información glutamatérgica excitatoria de las células bipolares. La excitación sináptica de las CGR está mediada postsinápticamente por los receptores NMDA (NMDAR) y los receptores AMPA (AMPAR). Los datos fisiológicos han indicado que los receptores de glutamato en las CGR se expresan no solo en los compartimentos de membrana postsináptica sino también en los perisinápticos o extrasinápticos. Sin embargo, no se han determinado ubicaciones anatómicas precisas para los receptores de glutamato en las sinapsis de RGC. Aunque se emplea ampliamente un análisis cuantitativo de alta resolución de los receptores de glutamato en las sinapsis centrales, este enfoque solo ha tenido un éxito limitado en la retina. Desarrollamos un método de inmunogold post-incrustación para el análisis de receptores de membrana, lo que permite estimar el número, la densidad y la variabilidad de estos receptores en las sinapsis de la cinta de la retina. Aquí describimos las herramientas, los reactivos y los pasos prácticos que se necesitan para: 1) la preparación exitosa de la fijación de la retina, 2) la sustitución por congelación, 3) la inmunocitoquímica del microscopio electrónico (EM) posterior a la incorporación de immunogold y, 4) la visualización cuantitativa de los receptores de glutamato en las sinapsis de cinta.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El glutamato es el principal neurotransmisor excitatorio en la retina 1. Las células ganglionares de la retina (CGR), que reciben la entrada sináptica glutamatérgica a partir de células bipolares 2, son las neuronas de salida de la retina que envían información visual al cerebro. Los estudios fisiológicos mostraron que la excitación sináptica de CGR está mediado por los receptores NMDA postsináptico (NMDAR) y los receptores de AMPA (AMPAR) 3,4,5. Aunque las corrientes postsinápticas excitatorias (EPSCs) en CGR están mediados por AMPAR y NMDAR EPSCs 3,5,6,7,8, miniatura espontáneas (mEPSCs) en CGR exhiben solamente un componente mediada por AMPAR 4,5,9. Sin embargo, la reducción de la captación de glutamato reveló un componente NMDAR EPSCs en 5 espontáneas, lo que sugiere que los NMDAR en las dendritas de CGR, pueden estar situados fuera de las sinapsis excitatorias. guanilato quinasas asociadas a la membrana (MAGUKs) como PSD-95 que los receptores de neurotransmisores clúster, incluidos los receptores de glutamato y del canal iónicos en los sitios sinápticos, también presentan distintos patrones de expresión subsináptica 10,11,12,13,14.

En las últimas décadas, la inmunohistoquímica confocal y pre-incrustación de microscopio electrónico de inmunohistoquímica (EM) se han empleado para estudiar la expresión del receptor de membrana. Aunque inmunotinción confocal revela patrones amplios de la expresión del receptor, su resolución más baja hace que sea imposible utilizar para distinguir localización subcelular. EM estudios pre-incrustación en la retina de mamíferos indican que las subunidades NMDAR están presentes en elementos postsinápticos en el cono bipolares sinapsis cinta celular 15,16,17. Esto está en contraste con aparente evidencia fisiológica. Sin embargo, la difusión de producto de reacción es un artefacto bien conocido en el método de inmunoperoxidasa pre-incrustación. Por lo tanto, este enfoque no suele dar datos estadísticamente fiables y puede excluir distinción entre la localización en la membrana sináptica frente 18,19,20,21 membrana extrasynaptic. EnPor otro lado, los datos fisiológicos y anatómicos son consistentes con una localización sináptica de AMPARs en CGR 3,5,7,9,22. Por lo tanto, los receptores de glutamato y MAGUKs en sinapsis cinta de la retina se localizan no sólo a la postsináptica, pero también a los compartimentos de membrana perisynaptic o extrasinápticos. Sin embargo, aún es necesario un análisis cuantitativo de alta resolución de estas proteínas de membrana en una sinapsis cinta de la retina.

Aquí, hemos desarrollado una técnica postembedding EM inmunoelectrónica para examinar la localización subsináptica de subunidades NMDAR, subunidades de AMPAR y PSD-95, seguido de la estimación del número, la densidad y la variabilidad de estas proteínas en las sinapsis Onto CGR de rata marcado utilizando la toxina del cólera subunidad B (CTB) métodos de rastreo retrógrado.

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Protocolo

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El cuidado y manejo de los animales estaban en conformidad con el NIH Cuidado de Animales y directrices del Comité de Uso. el día postnatal (P) 15-21 ratas Sprague-Dawley, inyectados con 1-1,2% CTB bilateral a través del colículo superior, se mantuvieron en un 12: 12 horas de luz: oscuridad ciclo.

1. Fijación tejido de la retina

  1. Reúna los siguientes materiales y herramientas: un microscopio de disección, 2 fórceps con puntas muy finas, tijeras, papel de filtro de celulosa, pipeta de plástico y un portaobjetos de microscopio.
  2. Anestesiar la rata en una cámara cerrada con 2,0 ml halotano (un anestésico por inhalación). Determinar la anestesia adecuada por estos métodos: la falta de retirada de la pata trasera después pizca dedo del pie, o la falta de reflejo de parpadeo. Entonces decapitar inmediatamente con una guillotina. Quitar los ojos con un par de tijeras de iris y colocar en un recipiente de vidrio que contenía paraformaldehído al 4% en tampón fosfato 0,1 M (PB) a pH 7,4.
  3. Utilizando el microscopio de disección, retire el maízea cortando la parte frontal del globo ocular. Retire la lente y el vítreo de la superficie de la retina interna con fórceps.
  4. Pelar la esclerótica con las dos pinzas hasta que la retina se aísla de la copa ocular.
  5. Cortar la retina inmediatamente en 100 - 200 tiras micras de espesor con una navaja de afeitar, y sujeto a la fijación cambio de pH.
  6. Fijar tiras retina en 4% de paraformaldehído en 0,1 M PB a pH 6,0 para 20 - 30 min y después en paraformaldehído al 4% más 0,01% de glutaraldehído a pH 10,5 para 10 a 20 min a TA.
  7. Después de varios lavados en PB con 0,15 mM CaCl 2 (pH 7,4 a 4 ° C), cryoprotect las tiras de la retina con glicerol (60 min cada uno en 10%, 20%, 30%, a continuación, O / N en 30%) en 0,1 M PB antes de congelar sustitución.

2. Congelación de sustitución

NOTA: Este método de congelación-sustitución es una modificación de un protocolo publicado anteriormente 19,20. Además, es fundamental que los instrumentos son muy fríos (use guantes); otherwise, el tejido puede descongelarse parcialmente cuando se toca con los instrumentos. Todos estos pasos se ejecutan dentro de la cámara de AFS y los instrumentos no se les permite moverse por encima del borde de la cámara. Del mismo modo, una refrigeración adecuada de todos los productos químicos utilizados en la AFS es necesario.

  1. Sumir a congelar las tiras en la retina de propano líquido a -184 ° C en un instrumento de EM criopreservación (CPC). Usando un pincel fino, colocar las muestras en pequeños trozos de cinta adhesiva de doble cara unidos a los trozos de metal que van en el extremo de las barras se hunden (absorbe y expulsa fuera de amortiguación adicional con el pincel).
  2. Sumir las varillas en el propano líquido y mantenerlo allí durante aproximadamente 5 segundos, y luego transferir al instrumento de congelación-sustitución automática (AFS), utilizando una pequeña cámara de transporte que se llena con nitrógeno líquido ( 'LN 2 enfrió recipiente de transferencia crio').
  3. Después de colocar la muestra congelada e instrumentos (fórceps y bisturí) en el AFS, enfriar los instrumentos en la cámara para SEminutos Veral antes de tocar el tejido, o enfriarlas mediante la colocación de las puntas de los instrumentos durante unos segundos en la cámara de transporte pequeño (lleno de nitrógeno líquido ( 'LN 2 enfrió recipiente de transferencia crio')).
  4. Una vez en la AFS, retire la muestra y el precinto de la colilla utilizando un bisturí fino. Además, mantener el control de flujo de gas de nitrógeno, TF (TF se describe como un "control regulador de LN 2 vaporizador ') abierta durante estos procedimientos.
  5. Antes de colocar el tejido congelado en los soportes-incrustación planas (es decir, antes de configurar el AFS), cortar un círculo delgada de una hoja de plástico transparente y colocarlo en la parte inferior del soporte de manera que se cubra el fondo de cada pocillo. Esto permite la eliminación relativamente fácil de los bloques de muestras polimerizadas cuando haya terminado.
    NOTA: Anteriormente, hemos utilizado un método alternativo a los titulares de incrustación planas, y el empleo de dobles cápsulas de gelatina + Reichert (véase Petralia y Wenthold, 1999) 20.
  6. Utilice la siguiente secuencia automática en el AFS (usando la terminología de instrumentos): T1 = -90 ° C durante 32 h, S1 = aumento de la temperatura en un 4 ° C / h (11,3 horas), T2 = -45 ° C durante 50 h, S2 = aumento de la temperatura en 5 ° C / h (9 horas), T3 = 0 ° C durante 40 horas (total = 142,3 horas). Se puede tomar de 2 - 4 horas para colocar muestras en el AFS (a -90 ° C) antes de comenzar la secuencia cronometrada.
  7. Sumergir las secciones congeladas en acetato de uranilo al 1,5% en metanol a -90 ° C durante> 32 h en la AFS. Coloque dos piezas de tejidos (por lo general) en cada uno de los siete pozos en el soporte de aluminio-incrustación plana (tres encajar en el AFS).
    1. Coloque el tejido + cinta en la uranilo de etilo / metanol en los pocillos y se retire la cinta más tarde, justo antes de comienzo medio de inclusión (tales como Lowicryl HM20) infiltración, si es demasiado difícil de eliminar el tejido de la cinta.
  8. A continuación, aumentar la temperatura por etapas a -45 ° C (+ 4 ° C por hora; en la secuencia automática).
  9. Lavar las muestras tres veces en metanol preenfriada, mediante el uso de una pipeta de plástico de punta fina para eliminar la solución de edad de cada soporte de la incrustación de plano, y a continuación, utilizando otra pipeta de plástico estándar de añadir el metanol fresco enfriado previamente.
  10. Luego, utilizando el mismo método, infiltrarse en las muestras progresivamente con resinas incrustación de baja temperatura como medio de inclusión (HM20 / metanol a 1: 1 y 2: 1, cada uno por 2 hr, seguido de resina pura durante 2 horas y a continuación, cambiar las resinas y mantener O / N).
  11. Cambie la resina de nuevo el día siguiente, el ajuste del nivel de la resina para alcanzar sólo para el borde superior de los pocillos.
  12. Polimerizar las muestras (-45 ° C a 0 ° C en secuencia automática; + 5 ° C por hora) con luz UV durante 40 h.
  13. A continuación, retire las muestras de la AFS. Normalmente, los bloques de muestras todavía muestran cierta coloración rosada en color. Colocar las muestras cercanas a la luz fluorescente en la campana de humos química, a TA S / N o más tiempo hasta que la aplicaciónoído del todo claro.

3. Postembedding EM Inmunoelectrónica La inmunocitoquímica

NOTA: inmunocitoquímica Postembedding se lleva a cabo como se describe 23,24,25.

  1. Cortar 1 micras secciones con ultramicrotomo, secciones de la mancha con un 1% de toluidina-azul, y examinarlas para la orientación de la sección; orientar el bloque de tejido para alcanzar el plano transversal óptima de corte.
  2. Cortar 70 cortes ultrafinos nm de grosor con ultramicrotomo y recogerlos en rejillas de ranura de níquel recubiertas de Formvar-carbono.
  3. Lavar las rejillas una vez en H2O destilada seguido de una solución salina tamponada con Tris (TBS tres veces, tampón Tris 0,05 M, NaCl al 0,7%, pH 7,6) de lavado.
  4. Incubar rejillas en 20 gotas mu l de BSA al 5% en TBS durante 30 min, y después en 20 gotas mu l de una mezcla que contiene de cabra anti-CTB (1: 3.000) y un anticuerpo para GluN2A una subunidad NMDAR (anti-conejo de 1:50 , GluN2B 1:30), o un anti-conejo GluA2 / 3 (1:30)en TBS-Triton (TBST, 0,01% de Triton X-100, pH 7,6) con 2% de BSA y 0,02 M NaN 3 O / N a TA.
  5. rejillas de lavado en tres gotas separadas (20 l) de TBS (pH 7,6) para 10, 10, y 20 min, seguido de TBS (pH 8,2) durante 5 min.
  6. Incubar rejillas durante 2 horas en gotas (20 l) de una mezcla que contiene IgG anti-conejo de burro (01:20) acoplado a 10 partículas nm de oro y IgG de burro anti-cabra (1:20) acoplados a partículas de oro 18 nm en TBST (pH 8,2) con 2% de BSA y 0,02 M NaN 3.
  7. Lávese las rejillas en 20 gotas l de TBS (pH 7,6) durante 5, 5 y 10 minutos, a continuación, en agua ultrapura y luego secarlos.
  8. Rejillas contratinción con acetato de uranilo al 5% y 0,3% de citrato de plomo en H 2 O destilada para 8 y 5 min en condiciones de oscuridad, respectivamente.
  9. Para los experimentos de etiquetado triple, incubar las redes de O / N a TA con 20 gotas mu l de una mezcla de anti-cabra de CTB (1: 3.000), anti-ratón de PSD-95 (1: 100) y anti-conejo GluN2A (1 : 50). A continuación se incuban las redes durante 2 horas el 2 de0 gotas mu l de una mezcla de IgG acoplado a 18, 10, y 5 partículas de oro nm en TBST (pH 8,2) con 2% de BSA y 0,02 M NaN 3. Mantener los mismos procedimientos que el doble etiquetado para el lavado y tinción de contraste entre y después de la incubación del anticuerpo.
  10. Los controles se realizaron en el que los anticuerpos secundarios se aplicaron solos.
  11. Ver cuadrículas en una EM y digitalizar imágenes. Procesar cifras finales en Adobe Photoshop 6.0 ​​sólo por el brillo y el contraste si es necesario 24.

4. Cuantificación

  1. Seleccione manualmente las zonas de la capa plexiforme interna (IPL) y sin agujeros o grietas en la ampliación 8,000X, a continuación, el fotomontaje al azar en toda la profundidad del IPL con una ampliación 25,000X.
  2. Identificar las dendritas de RGC en diadas cono bipolares cuando a) contienen la señal CTB retrógradamente transportado (partículas de oro de gran tamaño), b) las membranas exhiben bien definido, hendiduras, y las densidades postsinápticas, c) contienen al menos dos pequeña parte del oroicles dentro del PSD, o más de una partícula de oro a pequeña a lo largo de la membrana plasmática extrasináptico.
  3. Recoger 45 - 55 dendritas de CGR, en base a criterios anteriores, para el análisis cuantitativo.
  4. Medir las longitudes de la PSD y la membrana plasmática de las dendritas extrasynaptic RGC individuales con software ImageJ NIH. Contar partículas de oro dentro de 10 nm de la membrana como asociada a membrana, en base a un espesor promedio de 7-9 nm para la membrana de plasma 26.
  5. Calcular la densidad de partícula como el número de partículas de oro por micrómetro lineal (oro / m). Medir la distancia entre el centro de cada partícula de oro y el centro de la PSD (para la localización sináptica) o el borde de la PSD (para la ubicación extrasynaptic).
  6. Realizar análisis estadísticos mediante el software. Utilice dos colas pruebas t para comparar las medias. La conclusión de significación de p <0,05. A menos que se indique lo contrario, los valores del informe como media ± SEM 18.

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Resultados

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Los resultados presentados aquí demuestran sorprendentemente diferentes patrones de localización subsináptica de GluA 2/3 y NMDARs en dendritas de CGR en retina de rata, como se describe previamente 24,25. 77% de GluA 2/3 partículas de inmunomarcaje en los perfiles dendríticas RGC se encuentra dentro de la PSD (Figura 1A), similar a la mayoría de las sinapsis centrales. Sin embargo, NMDARs estaban ubicadas sinápticamente o extrasynaptically. 83% de las partícu...

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Discusión

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Hemos descrito cuatro técnicas para el éxito post incrustar inmunoelectrónica EM cuantitativa: 1) la fijación corta y débil, 2) congelación-sustitución, 3) 4) la cuantificación posterior a la incorporación de tinción inmunoelectrónica, y.

EM inmunoelectrónica permite la detección de proteínas específicas en las secciones de tejido ultrafinas. Anticuerpos marcados con partículas de oro se pueden visualizar directamente mediante EM. Mientras potente en la detección de la localización subsinápt...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen divulgaciones.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por los programas internos del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (NINDS) y el Instituto Nacional de la Sordera y Otros Trastornos de la Comunicación (NIDCD), de los Institutos Nacionales de Salud (NIH). Agradecemos a la instalación NINDS EM y el núcleo NIDCD avanzada de imagen (código # ZIC DC 000081-03) para obtener ayuda.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
ParaformaldehídoEMS15710
GlutaraldehídoEMS16019
NaH2PO4SigmaS9638
Na2HPO4Sigma7782-85-6
CaCl2SigmaC-8106
BSASigmaA-7030
Triton X-100SigmaT-8787
NaOHSigma221465
NaN3JT BakerV015-05
GlicerolGibco BRL15514-011
Lowicryl HM 20Polysciences15924-1
Tris-BaseFisherBP151-500
TrisFisher04997-100
Anti-GluN2AMilliporeAB1555PDilución 1/50
Anti-GluN2BMilliporeAB1557P Dilución 1/30
Anti-GluA2/3MilliporeAB1506Dilución 1/30
Anti-PSD-95MilliporeMA1– 046Dilución 1/100
Burro anti-conejo IgG-10 nm partículasde oro EMS25704Dilución 1/20
Burro anti-ratón IgG-10 nm partículas de oroEMS25814Dilución 1/20
Burro anti-ratón IgG-5 nm partículasde oro EMS25812Dilución 1/20
Burro anti-cabra IgG-18 nm partículas de oroJackson ImmunoResearch705-215-147Dilución 1/20
Rejillas de ranura de níquel recubiertas de Formvar-Carbon.EMSFCF2010-Ni Acetato
uraniloEMS22400-1
MetanolEMS67-56-1
Citrato de plomoLeica
Leica EM AFSLeica Leica
EM CPCLeica
UltramicrotomoLeica
JEOL 1200 EMNitrógeno líquido JEOL
 Roberts Oxygen
PropanoRoberts Oxygen
CTBLista Laboratorios Biológicos1041 - 1.2%
Lista Anti-CTBLaboratorios Biológicos703Dilución 1/4,000
de

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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