Artículo de método

Ensayo de toxicidad dependiente de la salinidad del Plata nanocoloides Usando Medaka huevos

DOI:

10.3791/53550

⸱

18 de marzo de 2016

 , 
1Graduate School of Life Sciences, Toyo University, 2Research Center for Life and Environmental Sciences, Toyo University

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las etapas embrionarias son las más susceptibles a los xenobióticos. Aunque la toxicidad química depende de la salinidad, no existe ningún método para probar la dependencia de la salinidad de la toxicidad para los organismos acuáticos. Aquí, describimos un método nuevo y de alto rendimiento para determinar la dependencia de la salinidad de la toxicidad para los embriones acuáticos.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La salinidad es una característica importante del medio acuático. Para los organismos acuáticos que define los hábitats de agua dulce, agua salobre y agua de mar. Análisis de la toxicidad de los productos químicos y la evaluación de sus riesgos ecológicos para los organismos acuáticos se realizan con frecuencia en agua dulce, pero la toxicidad de los productos químicos para los organismos acuáticos depende del pH, la temperatura y la salinidad. , No hay ningún método, sin embargo para probar la dependencia de la salinidad de la toxicidad para los organismos acuáticos. En este caso, hemos utilizado medaka (Oryzias latipes), ya que pueden adaptarse al agua dulce, agua salobre y agua de mar. Diferentes concentraciones de medio de embrión de cría (MTC) (1x, 5x, 10x, 15x, 20x y 30x) se emplearon para probar la toxicidad de las partículas nanocolloidal plata (SNCs) a Medaka huevos (MTC 1x y 30x MTC tienen presiones osmóticas equivalente de agua dulce y salada, respectivamente). En placas de seis pocillos de plástico, 15 huevos de medaka, por triplicado fueron expuestos a SNC a 10 mg / L &# 8722; 1 en diferentes concentraciones de ERM a pH 7 y 25 ° C en la oscuridad.

Se utilizó un microscopio de disección y un micrómetro para medir la frecuencia cardíaca por 15 seg y el ojo de diámetro en el día 6 y la longitud de todo el cuerpo de las larvas en el día de nacimiento (sección 4). Se observaron los embriones hasta la eclosión o el día 14; a continuación, nos contó el porcentaje de eclosión todos los días durante 14 días (sección 4). Para ver la acumulación de plata en los embriones, hemos utilizado acoplado inductivamente espectrometría de masas con plasma para medir la concentración de plata de soluciones de ensayo (sección 5) y embriones dechorionated (sección 6) .La toxicidad de las conexiones de subred a los embriones de medaka obviamente incrementado con el aumento de la salinidad. Este nuevo método nos permite probar la toxicidad de los productos químicos en diferentes salinidades.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Desde el establecimiento de la Organización para la Cooperación y el Desarrollo directrices de ensayo (OCDE) para las sustancias químicas de prueba en 1979, 38 directrices de ensayo se han publicado en la Sección 2 de las directrices, los efectos sobre los sistemas bióticos 1. Todos los organismos acuáticos objeto de ensayo han sido de hábitats de agua dulce, es decir, plantas de agua dulce; algas; invertebrados como las dafnias y quironómidos; y peces como el pez cebra, medaka, y la trucha arco iris. En comparación con los entornos de agua salada, ambientes de agua dulce están más directamente afectados por las actividades económicas e industriales humanos. Por lo tanto, ambientes de agua dulce se han priorizado para la prueba, ya que están en mayor riesgo de contaminación.

En las zonas costeras, incluidos los estuarios, salinidades varían entre las condiciones del agua y el agua de mar salobre, y estas áreas son contaminados por la actividad industrial 2. Las zonas costeras y sus humedales asociados se caracterizan por hIGH biodiversidad ecológica y la productividad. Por lo tanto, los ecosistemas costeros deben ser protegidos de la contaminación química. Sin embargo, se ha limitado la investigación ecotoxicológico en hábitats de agua y agua de mar salobre.

Sakaizumi 3 estudió las interacciones tóxicas entre el mercurio de metilo y la salinidad en los huevos de medaka japoneses y se encontró que el aumento de la presión osmótica de la solución de prueba aumentó la toxicidad del mercurio de metilo. . Sumitani et al 4 utilizaron huevos de medaka para investigar la toxicidad de los lixiviados de vertedero; encontraron que la equivalencia osmótica de los lixiviados de los huevos fue la clave para la inducción de anomalías durante la embriogénesis. Además, Kashiwada 5 informó que las nanopartículas de plástico (39,4 nm de diámetro) fácilmente permeado a través del corion medaka huevo en condiciones salobres (15x embrión crianza media (MTC)).

Un típico modelo pequeño pescado, el medaka japoneses (Oryzias latipes ) se ha utilizado en biología básica y ecotoxicología 6. Medaka japoneses pueden vivir en condiciones que van desde agua dulce al agua de mar debido a sus células de cloruro altamente desarrollados 7. Son por lo tanto probable que sea útil para probar en condiciones con una amplia gama de salinidades.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los medaka japoneses utilizados en este estudio fueron tratados con humanidad de acuerdo con las directrices institucionales de la Universidad de Toyo, con la debida consideración para el alivio de la angustia y el malestar.

1. La plata nanocoloides (SNC)

  1. Compra SNC purificada (20 mg / L -1, 99,99% de pureza, partícula significa diámetro de aproximadamente 28,4 ± 8,5 nm en suspensión en agua destilada).
  2. Validar la pureza y la concentración de la plata por espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente (ICP-MS) análisis según el manual de funcionamiento 8. El método de pretratamiento para ICP-MS análisis se describe en la sección 7.

2. Preparación de Soluciones (SNC mezclas de plata de Coloides y Ag +) con diferentes salinidades

  1. Preparar 60 × ERM que consiste en 60 g de NaCl, 1,8 g KCl, 2,4 g de CaCl2 · 2H 2 O, y 9,78 g MgSO4 · 7H 2 O en 1 L de ULTrâpure agua; ajustar el pH a 7,0 con 1,25% de NaHCO3 en agua ultrapura.
  2. Se agita la solución ERM a 25 ° C durante la noche.
  3. Mezclar SNC con el MTC diluida. Preparar 40 ml de cada solución mixta SNC-MTC. La concentración final es de 10 mg / L -1 de SNC en diferentes concentraciones de ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, 30x o).
  4. Ajustar el pH de la solución mixta SNC-ERM a 7,0 con 0,625% de NaHCO3 en agua ultrapura. ajuste de pH es muy importante en la preparación de la solución de SNC, porque la liberación de Ag + es facilitado por las condiciones ácidas 9.
  5. Utilice AgNO 3 como compuesto de referencia para SNC.
    1. Mezclar AgNO3 con el MTC diluido. Preparar 40 ml de AgNO 3 -ERM solución mixta a una concentración de AgNO 3 de 15,7 mg / L -1 (10 mg / L -1 plata) en diferentes concentraciones de ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, o 30x) .
      Nota: Para examinar la toxicidad coloide de plata, AgNO3solución, que es una fuente de plata soluble, se utiliza como compuesto de referencia para SNC, que son una mezcla de coloides de plata y plata soluble.

3. Cultura Medaka y la recolección de huevos

  1. Obtener el medaka (O. latipes) (cepa de color naranja-rojo) (60 machos y 60 hembras).
  2. Cultura medaka como grupos (20 hombres y 20 mujeres como un grupo) en ERM 1x en 3 tanques L mediante el uso de un sistema de cultivo de flujo a través medaka.
    1. Cultura en las siguientes condiciones:
      intervalo de pH del medio de cultivo: 6.2 a 6.5
      ciclo de luz: oscuridad: 16: 8 hr
      la temperatura del medio de cultivo: 24 ± 0,5 ° C
      la presión osmótica del medio de cultivo: 257 mOsm
  3. Alimentar medaka en nauplios de Artemia salina a las 10:00 (una vez al día) y alimentar a una dieta artificial pescado seco a las 09:00, 11:00, 13:00, 15:00, 17:00 (cinco veces al día).
    1. Obtener A. nauplios salina.
    2. Prepare 5 L de una solución de sal de 3,0% en un vaso de precipitados de plástico.
    3. Añadir 30 g de huevos de camarón de salmuera a la solución de sal en el vaso de precipitados.
    4. Incubar los huevos a 25 ° C durante 48 horas con burbujeo (4 L / min -1) utilizando una bomba de aireación.
    5. Después de 48 horas, detener la propagación.
    6. Deje reposar la solución durante 5 a 10 minutos para separar el tramado A. nauplios salina (parte baja de la solución) de los huevos no eclosionados y cáscaras de huevo (parte superior de la solución).
    7. Eliminar la capa superior de la solución por decantación.
    8. Se filtra la parte inferior de la solución a través de un tamiz con aberturas de 283 micras, y recoger los nauplios que pasan a través de una red con aberturas de 198 micras.
    9. Alimentar a los nauplios de los medaka dentro de 6 horas.
  4. Tras el medaka femeninos han dado lugar, retire las masas de huevos externos suavemente de los cuerpos de las hembras o recoger los huevos de la parte inferior del tanque de peces mediante el uso de un smtodo neta (net tamaño de 5 cm x 5 cm, tamaño de orificio de 0,2 mm x 0,2 mm).
  5. Enjuague el cúmulo de huevo con un chorro de agua del grifo durante 5 seg.
  6. Añadir todas las masas de huevos enjuagados con solución ERM 30x.
  7. Retire los racimos de la solución después de 1 min y colocar las masas de huevos entre toallas de papel secas y girar suavemente.
  8. Poner los huevos de nuevo en el MTC 30x.
  9. Seleccionar huevos fecundados bajo un microscopio de disección.
  10. Lugar seleccionado 810 huevos en el MTC 1x en seis pocillos de plástico mediante el uso de fórceps.
  11. Se incuban los huevos a 25 ± 0,1 ° C en una incubadora hasta la etapa de desarrollo 21. (Etapas de desarrollo de los embriones medaka se definen a partir de la obra de Iwamatsu 10).
  12. Escoja huevos incubados a 21 etapa de desarrollo bajo un microscopio de disección.
  13. Enjuague los huevos seleccionados por el MTC 1x.
  14. Someter los huevos enjuagados a experimentos de exposición (sección 4).

4. Ensayos de Toxicidad SNC o AgNO3 A diferentes salinidades ERM

  1. Enjuague huevos de medaka (etapa 21) tres veces con solución de ensayo [SNC (10 mg / L -1) o AgNO 3 (15,7 mg / L -1 como 10 mg / L -1 plata) en cada concentración de ERM (1x, 5x , 10x, 15x, 20x, o 30x) a pH 7]. Como controles, utilice huevos en 1 × a 30 × MTC a pH 7.
  2. Añadir 15 huevos enjuagados con 5 ml de cada solución de ensayo en seis pocillos de plástico. (Realizar los experimentos de exposición a tres veces por SNC o AgNO3 toxicidad pruebas utilizando cada solución de ensayo).
  3. Envolver las placas en papel de aluminio.
  4. Se incuban las placas envueltas a 25 ° C en la oscuridad hasta su nacimiento o durante 14 días.
  5. Observar los huevos expuestos cada 24 horas para los cambios biológicos y los huevos muertos (Figuras 1 y 2).
  6. Intercambiar las soluciones de ensayo cada 24 horas.
  7. Realizar observaciones de la siguiente manera.
    1. En el día 6 de la exposición, contar el ritmo cardíaco (por 15 sec) of embriones medaka bajo un microscopio de disección mediante el uso de un cronómetro (Figura 3a).
    2. En el día 6 de la exposición, medir el tamaño de los ojos (diámetro) de embriones de medaka bajo un microscopio de disección usando un micrómetro (Figura 3b).
    3. En el día de la eclosión, medir las longitudes de cuerpo completo de larvas bajo un microscopio de disección usando un micrómetro (Figura 3c).
    4. Contar el número total de huevos que eclosionan expuestos durante los 14 días (Figura 3d).

5. Aislamiento de solubles de plata de la solución SNC, y Análisis de plata

  1. Aislar plata soluble a partir de cada solución de SNC (una mezcla de coloides de plata y plata soluble) por filtración a través de un filtro de membrana de 3 kDa a 14.000 x g y 4 ° C durante 10 min. Use un filtro de membrana de 3 kDa para aislar la plata soluble a partir de las segundas comunicaciones nacionales, debido a que el diámetro medio de conexiones de subred informado agregados en el MTC 1x es de 67,8 nm 11 unand la de Ag + es 0,162 nm 12; la membrana 3 kDa excluye partículas con diámetros de 2 nm o más 13.
  2. Medir la concentración de plata en 50 l de solución filtrada (= la concentración de plata soluble) por ICP-MS análisis (Figura 3e) de acuerdo con el manual operativo ICP-MS 8. El método de pretratamiento para la ICP-MS análisis se describe en la sección 7.

6. Medición de la plata de bioacumulación en medaka embriones

  1. Exponer los huevos de medaka (etapa 21) para conexiones de subred o AgNO3 como se describe en la sección 4.
  2. En el día 6 de exposición, retire corion del huevo (es decir, dechorion) mediante el uso de medaka incubar enzima de acuerdo con el protocolo descrito en el libro Medaka 14.
  3. Medir la concentración de plata de los huevos dechorioned por análisis ICP-MS de acuerdo con la ICP-MS Manual de instrucciones 8 (Figura 3f). El pretratamientométodo para la ICP-MS análisis se describe en la sección 7.

7. Medición de la concentración de plata por ICP-MS Análisis

  1. Añadir muestras [50 l de solución de plata (para la validación de la concentración de plata, la sección 1); tres embriones dechorionated (sección 5); o 50 l de solución filtrada (sección 5)] a un vaso de precipitados de teflón de 50 ml.
  2. Añadir 2,0 ml de ácido nítrico ultrapura al vaso de precipitados de 50 ml.
  3. Se calienta la mezcla sobre una placa caliente a 110 ° C hasta justo antes de que se seque (aproximadamente 3 horas).
  4. Para disolver la materia orgánica por completo, añadir 2,0 ml de ácido nítrico ultrapura y 0,5 ml de peróxido de hidrógeno al vaso de precipitados.
  5. Se calienta la mezcla de nuevo en el plato caliente hasta justo antes de que se seque (aproximadamente 3 horas).
  6. Disolver el residuo en 4 ml de solución de ácido nítrico 1,0% ultrapura.
  7. Transferencia de 4 ml de solución a un tubo de centrífuga.
  8. Repita 07/06 a 07/07 dos veces (un total de tres veces). El volumen final es 12,0ml.
  9. Medir la concentración de plata de la muestra (disuelto en ácido nítrico ultrapuro 1,0%) mediante el uso de análisis ICP-MS de acuerdo con el manual de funcionamiento 8.
    1. Utilice una interna y una solución de patrón externo (Ver Lista de Materiales) para cuantificar la concentración de plata. La solución estándar interna y externa está acreditado por la Asociación Americana para la Acreditación de Laboratorios (A2LA). Los límites de detección de la plata eran 0,0018 ng / ml-1 (solución) y 0,016 ng mg peso -1 (el cuerpo del embrión).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El efecto de la salinidad sobre la toxicidad SNC era muy evidente: la inducción de la deformidad o la muerte dependía de salinidad (Figuras 1 y 2). Medimos biomarcadores fenotípicas (frecuencia cardíaca, el tamaño del ojo, la longitud de todo el cuerpo, y la tasa de eclosión) en el SNC (10 mg / L -1) -exposed embriones. Estos biomarcadores fenotípicas revelaron toxicidad SNC salinidad-dependiente.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Medaka es un pez de agua dulce que es altamente tolerante al agua de mar; no es bien sabido que el hábitat natural original de este pez era agua salada de la costa japonesa 6. Por lo tanto, los peces medaka tienen bien desarrollado células de cloruro de 7. Esta propiedad única proporciona a los científicos una nueva manera de probar la toxicidad de los productos químicos en el medio ambiente como una función de la salinidad (agua dulce al agua de mar) mediante el uso de una sola especie de pescado....

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Estamos agradecidos a la Sra. Kaori Shimizu y al Sr. Masaki Takasu de la Escuela de Graduados de Ciencias de la Vida de la Universidad de Toyo, por su apoyo técnico. Este proyecto contó con el apoyo de becas de investigación de la Fundación Especial de Investigación y el Centro de Investigación de Bio-Nano Electrónica de la Universidad de Toyo (a SK); por el Fondo de Promoción de la Investigación Científica de la Corporación de Promoción y Ayuda Mutua para las Escuelas Privadas de Japón (a SK); por el Fondo de Nuevos Proyectos para Evaluaciones de Riesgos, del Ministerio de Economía, Comercio e Industria (a SK); por una Beca de Ayuda para la Investigación Exploratoria Desafiante (23651028 de adjudicación a SK); mediante una subvención para la investigación científica (B) y (C) (adjudicación 23310026 y 26340030 a SK); y por una subvención para un proyecto estratégico de base de investigación para universidades privadas (adjudicación S1411016 a SK) del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Nanocoloides de plataUtopía Suplementos de
NaClNacalai Tesque, Inc.31319-45Para la fabricación de ERM
KClNacalai Tesque, Inc.28513-85Para hacer ERM
CaCl2· 2H2ONacalai Tesque, Inc.06730-15Para hacer ERM
MgSO4· 7H2ONacalai Tesque, Inc.21002-85Para la fabricación de ERM
NaHCO3 Nacalai Tesque, Inc.31212-25Para la fabricación de ERM
AgNO3Nacalai Tesque, Inc.31018-72
Medidor de pHHORIBA, Ltd.F-51S
BalanceMettler-Toledo International Inc.MS204S
medaka (Oryzias latipes) cepa de color rojo anaranjadoInstituto Nacional de Estudios
sistema de cultivo de flujo intermedio mekataMeito Suien Co.MEITOsystem
Huevos de nauplii de Artemia salinaJapan pet design Co. Ltd4975677033759
bomba de aireaciónpet design Co. Ltdsin ruido w300
Larva de Otohime β-1Marubeni Nissin Feed Co. LtdLarva de Otohime β-1de dieta de peces secos
artificialesLeica microsystemsM165FC
micrómetroFujikogaku, Ltd.incubadora de 10450023
NksystemTG-180-5LB
agitadorELMI Ltd.Aizkraukles 21-136
placas de plástico de 6 pocillosGreiner CELLSTARM8562-100EA
papel de aluminioAS ONE Co.6-713-02
cronómetroDRETEC Co. Ltd.SW-111YE
Filtro de membrana de 3 kDaEMD Millipore CorporationFiltro centrífugo de 0,5 ml
Estándar de claritas personalizadoSPEXertificadoZSTC-538Para estándar interno
Estándar de claritas personalizadoSPEXertificadoZSTC-622Para
ácido nítrico ultrapuroKanto Chemical Co.28163-5B
peróxido de hidrógeno Kanto Chemical Co.18084-1Bpara espectrometría de absorción atómica
ICP-MSThermo ScientificThermo Scientific X Series 2 
placa calienteTiger Co.CRC-A300
plataAmbientales Japan Microscopio de disección Vaso de precipitados de teflón de 50 ml AS ONE Co.33431097 estándar externo

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2 Effects on Biotic Systems. , OECD. Available from: http://www.oecd-ilibrary.org/environment/oecd-guidelines-for-the-testing-of-chemicals-section-2-effects-on-biotic-systems_20745761 (2015).
  2. National Coastal Condition Report. , Environmental Protection Agency, Office of Water and Office of Research and Development. Washington, DC. (2001).
  3. Sakaizumi, M. Effect of inorganic salts on mercury-compound toxicity to the embryos of the Medaka, Oryzias latipes. J. Fac. Sci. Univ. Tokyo. 14 (4), 369-384 (1980).
  4. Sumitani, K., Kashiwada, S., Osaki, K., Yamada, M., Mohri, S., Yasumasu, S., et al. Medaka (Oryzias latipes) Embryo toxicity of treated leachate from waste-landfill sites. J. Jpn. Soc. Waste Manage. Exp. 15 (6), 472-479 (2004).
  5. Kashiwada, S. Distribution of Nanoparticles in the See-through Medaka (Oryzias latipes). EHP. 114 (11), 1697-1702 (2006).
  6. Iwamatsu, T. The Integrated Book for the Biology of the Medaka. , University Education Press. Japan. (2006).
  7. Miyamoto, T., Machida, T., Kawashima, S. Influence of environmental salinity on the development of chloride cells of freshwater and brackish-water medaka, Oryzias latipes. Zoo. Sci. 3 (5), 859-865 (1986).
  8. XSERIES 2 ICP-MS Getting Started Guide Revision B - 121 9590. , Thermo Fisher Scientific Inc.. Available from: http://202.127.146.37/eWebEditor/uploadfile/20130314161434190.pdf (2007).
  9. Kashiwada, S., Ariza, M. E., Kawaguchi, T., Nakagame, Y., Jayasinghe, B. S., Gartner, K., et al. Silver nanocolloids disrupt medaka embryogenesis through vital gene expressions. ES & T. 46 (11), 6278-6287 (2012).
  10. Iwamatsu, T. Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes. Mech. Dev. 121, 605-618 (2004).
  11. Kataoka, C., Ariyoshi, T., Kawaguchi, H., Nagasaka, S., Kashiwada, S. Salinity increases the toxicity of silver nanocolloids to Japanese medaka embryos. Environ. Sci.: Nano. 2, 94-103 (2014).
  12. Shannon, R. D. Revised effective ionic radii and systematic studies of interatomic distances in halides and chalcogenides. Acta Cryst. 32, 751-767 (1976).
  13. Pore size chart. , Spectrum Laboratories, Inc.. Available from: http://jp.spectrumlabs.com/dialysis/PoreSize.html (2015).
  14. Wakamatsu, Y. Medaka Book, 6.1: Preparation of hatching enzyme. , National BioResource Project (NBRP) Medaka. Available from: [cited 2015] https://shigen.nig.ac.jp/medaka/medakabook/index.php?6.1%20preparation%20of%20hatching%20enzyme (2015).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Ensayo de toxicidad por salinidadMedio de cr a de embrionesMedici n de la frecuencia card acaMedici n del di metro del ojoMedici n de la longitud corporalAn lisis por ICP MSBioacumulaci n de plataTasa de eclosi n

Artículos relacionados