Este protocolo describe los pasos necesarios para ejecutar ensayos de desacetilación in vitro e in vivo con el fin de establecer el papel de las proteínas como sustratos de desacetilación específicos para las sirtuinas y estudiar más a fondo el papel de la acetilación reversible de lisina como modificación postraduccional.
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Artículo de método
Ensayos de desacetilación para desentrañar la interacción entre las sirtuinas (SIRT2) y proteína-sustratos específicos
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Resumen
Resumen
La acetilación ha surgido como una importante modificación postraduccional (PTM) que regula una gran cantidad de procesos y funciones celulares. Esto está respaldado por hallazgos recientes en proteómica basada en espectrometría de masas de alta resolución que muestran que muchas proteínas nuevas y sitios dentro de estas proteínas pueden acetilarse. Sin embargo, a menudo se desconoce la identidad de las enzimas que regulan estas proteínas y sitios. Entre estas enzimas, las sirtuinas, que pertenecen a la clase III de histonas lisina desacetilasas, han atraído un gran interés como enzimas reguladoras del acetiloma en diferentes condiciones fisiológicas o fisiopatológicas. En este trabajo describimos métodos para unir SIRT2, la sirtuina citoplasmática, con sus sustratos, incluyendo ensayos de desacetilación in vitro e in vivo. Estos ensayos se pueden aplicar en estudios centrados en otros miembros de la familia de las sirtuinas para desentrañar el papel específico de las sirtuinas y son necesarios para establecer la interacción reguladora de las desacetilasas específicas con sus sustratos como primer paso para comprender mejor el papel de la acetilación de proteínas. Además, estos ensayos pueden utilizarse para distinguir los sitios de acetilación funcionales de una proteína de lo que pueden ser lisinas acetiladas no reguladoras, así como para examinar la interacción entre una desacetilasa y su sustrato en un contexto fisiológico.
Introducción
Las modificaciones postraduccionales (PTM) regulan las redes de señalización celular, permitiendo que las células respondan rápidamente a las señales internas y externas. En las últimas décadas, se han identificado muchos PTM diferentes que desempeñan un papel fundamental en diversos procesos, pero solo unos pocos se han estudiado ampliamente, como la fosforilación, la acetilación y la ubiquitinación 1-3. Centrándose en la acetilación, Allfrey et al. fueron los primeros en proponer un papel para la acetilación de histonas en la regulación de la transcripción génica hace unos 50 años 4. La investigación en este campo ha revelado que la ac....
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Protocolo
1. In Vitro Ensayo de desacetilación
- Purificación de SIRT2
- Preparar una placa de cultivo de 10 cm de células HEK 293T cultivadas en 8 ml de DMEM con 10% de FBS y antibióticos y se cultivaron en un 37 ° C, 5% CO incubador de cultivo de tejido 2 en alrededor de 70% de confluencia el día siguiente.
- Al día siguiente, co-transfectar 4 mg Pcdh-puro-GFP-SIRT2-Flag (lentivirus realizado en nuestro laboratorio), 4 mg pCMV dR8.2 dvpr (embalaje vector) y 0,5 g de pCMV-VSV-G (vector sobre) 18 utilizando polietilenimina (PEI) en una proporción de 3 l PEI de ADN / mg.
- Cambiar los medios de comunicación después ....
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Resultados
Para que una proteína para ser considerado como un objetivo desacetilación legítimo para cualquier enzima con actividad de desacetilación, tanto in vitro como in vivo en ensayos de desacetilación se tienen que realizar para establecer la interacción entre la desacetilasa y su sustrato. Para el ensayo de desacetilasa in vitro, se requiere la purificación tanto de la desacetilasa y el sustrato de proteína acetilado antes del ensayo se puede hacer. Aquí s.......
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Discusión
Estudios proteómicos recientes de alto rendimiento han establecido la acetilación como un PTM generalizado que se encuentra no solo en el núcleo sino también en el citoplasma y las mitocondrias 7,8,21-23. Teniendo en cuenta la probabilidad de que no se hayan detectado muchas más proteínas y sitios acetilados debido a varias razones, como la especificidad de los anticuerpos anti-Ac-K utilizados, la baja abundancia de proteínas acetiladas y la naturaleza transitoria del PTM, es seguro predecir que aún quedan más.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
El proyecto descrito aquí fue apoyado por una subvención del NIH / NCI (NCI-R01CA182506-01A1), así como por el H. Lurie Centro Integral del Cáncer Robert - La Fundación Familia Lefkofsky / Liz y Premio de Investigación Eric Lefkofsky Innovación a AV Quisiéramos agradecer a los miembros del laboratorio (Carol O'Callaghan y Elizabeth Anne Wayne) para la lectura crítica y la edición de este manuscrito.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| placas de cultivo celular | Denville Scientific Inc. | T1110 y T1115 | |
| pCDH-puro-GFP vector lentiviral | System Biosciences | CD513B-1 | |
| pCMV- dR8.2 dvpr (vector de empaquetamiento) | Addgene | 8455 | |
| pCMV-VSV-G (vector de envoltura) | Addgene | 8454 | |
| polietilenimina (PEI) | Policiencias, Inc. | 24885 | otros reactivos de transfección. El PEI es rentable y muy eficiente en la transfectación de células 293T |
| 0,22 μ m filtros | Denville Scientific Inc. | F5512 | |
| polibrene | Sigma | H9268 | |
| microscopio fluorescente | Carl Zeiss MicroImaging Inc. | Axiovert 200 | |
| puromicina | Invivogen | A11138-03 | |
| PBS | Corning | 21-031-CM | |
| anticuerpo anti-bandera | Sigma | F3165 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Glicerol | Sigma | G5516 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| MgCl2 | Sigma | M9272 | |
| EGTA | Sigma | 34596 | |
| inhibidores de la proteasa coctail 100x | Biotool | B14001 | |
| Tricostatina A (TSA) | Sigma | T8552 | inhibidor selectivo de histonas desacetilasas de clase I y II (HDAC) pero no de HDAC de clase III (sirtuinas) |
| perlas de agarosa anti-Flag | Sigma | A2220 | |
| centrífuga | Eppendorf | 5417R | |
| rotador | Thermo Scientific | 415220Q | |
| de filtro | Millipore | UFC30HV00 | |
| Péptido de bandera | Sigma | F3290 | |
| Concentradora centrífuga Vivaspin | Sartorius Stedim Biotech S.A. | VS0102 | |
| Solución SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | |
| NuPAGE LDS tampón de muestra (4x) | Life Techologies | NP0007 | |
| Tris-HCl pH 7.5 | Sigma | T5941 | |
| NAD+ | Sigma | N0632 | cofactor requerido para sirtuinas |
| nicotinamida (NAM) | Sigma | 72340 | inhibidor selectivo de clase III HDAC (sirtuinas) |
| pLKO.1 vector lentiviral | Addgene | 8453 | |
| SIRT2 si RNA | Qiagen | GS22933 | |
| anticuerpo anti-SIRT2 | Proteintech | 15345-1-AP | |
| Bradford ensayo de proteínas | BIO-RAD | 500-0006 | |
| anti Ac-K perlas de agarosa | Immunechem | ICP0388 |
Referencias
- Hunter, T. The age of crosstalk: phosphorylation, ubiquitination, and beyond. Molecular Cell. 28, 730-738 (2007).
- Gao, M., Karin, M. Regulating the regulators: control of protein ubiquitination and ubiquitin-like modificat....
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