Culturas Generación de fibroblastos primarios de mouse de oreja y rabo tejidos

Resumen

Se describe un procedimiento experimental sencillo y rápido para la generación de fibroblastos primarios de las orejas y la cola de los ratones. El procedimiento no requiere una formación especial de los animales y se puede utilizar para la generación de cultivos de fibroblastos de los oídos almacenados a temperatura ambiente durante hasta 10 días.

Resumen

Las células primarias se derivan directamente de tejidos y se cree que son más representativa del estado fisiológico de las células in vivo que las líneas celulares establecidas. Sin embargo, cultivos de células primarias por lo general tienen una vida finita y deben ser restablecido con frecuencia. Los fibroblastos son una fuente fácilmente accesible de células primarias. En este caso, hablamos de un procedimiento experimental simple y rápida para establecer cultivos de fibroblastos primarios de las orejas y la cola de los ratones. El protocolo puede ser utilizado para establecer cultivos de fibroblastos primarios de los oídos almacenados a temperatura ambiente durante hasta 10 días. Cuando el protocolo se sigue cuidadosamente, las contaminaciones son poco probable que ocurra a pesar de la utilización de tejido no estéril almacenada por un tiempo prolongado en algunos casos. Los fibroblastos proliferan rápidamente en la cultura y se puede ampliar a un número considerable antes de someterse a la senescencia replicativa.

Introducción

Las células primarias se derivan de tejido y se cultivaron viven bajo condiciones in vitro. Se asume generalmente que las células primarias se asemejan más el estado fisiológico y el fondo genético del tejido del que se derivan de líneas celulares inmortalizadas o tumorales ^1. Por esa razón, las células primarias representan un modelo útil para el estudio de cuestiones biológicas ^2,3. Sin embargo, a diferencia de las líneas celulares establecidas que crecen indefinidamente, células primarias, finalmente, se someten a la senescencia en la cultura y necesitan ser restablecido con frecuencia.

Células primarias ....

Protocolo

Los animales fueron alojados en condiciones libres de patógenos en el cumplimiento de las directrices institucionales hasta la eutanasia (El Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión (IACUC) directrices de la Universidad Nacional de Singapur y el Comité Nacional Asesor para el Laboratorio de Investigación Animal (NACLAR) directrices).

1. Los ratones

1. Ordene un ratón del fondo genético apropiado. Este protocolo se basa en el tejido derivado de un ratón C57BL / 6.

2. Preparación de medio completo

1. Preparar medio completo mediante la adición de los siguientes componentes a Roswell Park Memorial ....

Resultados

Extracción de fibroblastos de resultados de tejidos en una cantidad significativa de restos de tejido (Figura 1). En contraste con restos de tejido, los fibroblastos se adhieren a las superficies de plástico de cultivo de tejido entre el día 1 y 3 de la cultura. El medio de cultivos de fibroblastos se puede cambiar de forma segura en el día 3 de la cultura, lo que debería reducir significativamente los niveles de residuos presentes en la cultura (Figura 2). Los fibroblastos muestran una.......

Discusión

Aquí le ofrecemos un procedimiento experimental simple, barato y rápido para establecer cultivos de fibroblastos primarios de las orejas y la cola de los ratones. La extracción debe resultar en fibroblastos en división adherentes y rápidamente dentro de 3 días post-aislamiento del tejido. Una limitación importante de células primarias es la senescencia, una detención del crecimiento permanente ^15. Utilizando el protocolo, cultivos de fibroblastos se pueden pasaron durante 5 a 6 veces antes de fibroblastos sen.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
RPMI-1640	HyClone	SH30027.01
Suero de ternera fetal	HyClone	SV30160.03
2-mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M3148
Asparagina	Sigma-Aldrich	A4159
Glutamina	Sigma-Aldrich	G8540
Penicilina/Estreptomicina	HyClone	SV30010
Etanol	Merck Millipore	107017	Absolute para análisis
Colagenasa D	Roche Diagnostics	11088866001	De Clostridium histolyticum, liofilizado, no estéril
Pronase proteasa	Merck Millipore	53702	De Streptomyces griseus  Tampón
Tris (pH 8)	1ª BASE	1415	Grado ultrapuro
0,5M EDTA (pH 8)	1ª BASE	BUF-1053	Grado biotecnológico
10X Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	1ª BASE	BUF-2040-10X4L
tripsina-EDTA	Sigma-Aldrich	59418C-100ML	0,5% tripsina, 0,2% EDTA, tripsina gamma irradiada por el proceso SER-TINA, sin rojo fenol, en solución salina
Anfotericina B	Sigma-Aldrich	A2492-20ml	250 μ g/ml en agua desionizada, estéril filtrada
Tijeras	Pinza Aesculap Aesculap
		AE-BD312R
0,2 μ M filtro de jeringa	Sartorius Stedim	16534
70 μ M filtro de células	SPL	93070
Émbolo de jeringa	Terumo	SS+10L
Tubo criovial	NUNC 368362
tubo de microcentrífuga de 1,7 ml	Axygen	MCT-175-C
Placa de cultivo celular de 10 cm	Greiner	664160	Placa tratada con cultivo celular
Tubo de fondo cónico de 15 ml	Greiner	188271
tubo de fondo cónico de 50 ml	Greiner	227261
Baño de agua	GFL	1002
Centrífuga	Eppendorf	5810R
Agitador de incubación	Sartorius Stedim		Certomat-BS1
Zeiss Axiovert 25	Carl Zeiss AG

Solución de de grado ultrapuro 10X Microscopio óptico Zeiss