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Artículo de método

Au-Interacción de SLP1 Polímeros y Monocapa de

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DOI:

10.3791/53572

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19 de enero de 2016

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En este artículo

Resumen

Para obtener información básica sobre la sorción y el reciclaje de oro de sistemas acuosos, se investigó la interacción de las nanopartículas de Au(III) y Au(0) en las proteínas de la capa S. La sorción de polímeros proteicos se investigó por ICP-MS y la de monocapas proteicas por QCM-D. El AFM posterior permite la obtención de imágenes de las nanoestructuras.

Resumen

En esta publicación se describe el comportamiento de sorción de oro de las proteínas de la capa superficial (capa S) (Slp1) de Lysinibacillus sphaericus JG-B53. Estas biomoléculas se disponen en matrices bidimensionales paracristalinas en las superficies, se unen a los metales, por lo que son interesantes para varias aplicaciones biotecnológicas, como los materiales biosorptivos para la eliminación o recuperación de diferentes elementos del medio ambiente y los procesos industriales. La deposición de nanopartículas de Au(0) en capas S, ya sea por síntesis dirigida a la capa S 1 o por adsorción de nanopartículas, abre nuevas posibilidades para diversas aplicaciones sensoriales. Aunque numerosos estudios han descrito las propiedades biosorptivas de las capas S 2-5, una comprensión más profunda de la interacción proteína-proteína y proteína-metal sigue siendo un desafío. En el siguiente estudio, se utilizó la espectrometría de masas acoplada inductivamente (ICP-MS) para la detección de la sorción de metales por capas S en suspensión. Esto se correlacionó con las mediciones de la microbalanza de cristal de cuarzo con monitoreo de disipación (QCM-D), que permite la detección en línea de la formación de monocapas proteicas y la deposición de metales y, por lo tanto, una comprensión más detallada de la unión de metales.

Los resultados de ICP-MS indicaron que la unión de Au(III) a los polímeros de la capa S en suspensión depende del pH. La unión máxima de Au(III) se obtuvo a pH 4.0. Las investigaciones de QCM-D permitieron la detección de la sorción de Au(III), así como la deposición de Au(0)-NPs en tiempo real durante los experimentos in situ. Además, este método permitió estudiar la influencia de la unión de metales en la estabilidad de la red de proteínas de Slp1. Las propiedades estructurales y la estabilidad de la capa de proteínas se pudieron visualizar directamente después del experimento QCM-D utilizando microscopía de fuerza atómica (AFM). En conclusión, la combinación de estos diferentes métodos proporciona una comprensión más profunda de la unión de metales por parte de las proteínas bacterianas de la capa S en suspensión o como monocapas en células bacterianas o superficies recristalizadas.

Introducción

Debido al creciente uso del oro para diversas aplicaciones como la electrónica, catalizadores, biosensores, o instrumentos médicos, la demanda de este metal precioso ha crecido en los últimos pocos años 6-9. Oro, así como muchos otros metales preciosos y pesados ​​se liberan en el medio ambiente a través de efluentes industriales en concentraciones diluidas, a través de las actividades mineras, y la eliminación de residuos 7,8,10, aunque la mayor contaminación ambiental por metales pesados ​​o preciosos es un proceso en curso causado principalmente por las actividades tecnológicas. Esto conduce a una interferencia significativa de los ecosistema....

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Protocolo

1. Los microorganismos y Condiciones de cultivo

Nota:. Todos los experimentos se realizaron en condiciones estériles L. sphaericus JG-B53 se obtuvo de una cultura crio-conservado 29,30.

  1. Cultura (1,5 ml) en la mesa de trabajo limpia Transferencia crio-conservados a 300 ml de caldo nutriente estéril (NB) medios de comunicación (extracto de carne 3 g / l, 5 g / L de peptona, 10 g / L de NaCl). Después se agita la solución durante al menos 6 horas a 30 ° C para obtener el pre-cultivo para el cultivo.
  2. Cultivar las bacterias en condiciones aeróbicas en medios NB a pH = 7,0, 30 ° C en un 70 L escalado biorr....

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Resultados

Cultivo de Microorganismos y SLP1 Caracterización

Los datos registrados del crecimiento bacteriano indica el final de la fase de crecimiento exponencial en alrededor de 5 hr. Investigaciones anteriores han demostrado que SLP1 se puede aislar desde este punto de cosecha (4,36 g / L biomasa húmeda (≈ 1,45 g / L (BDW)) con un rendimiento máximo 19. Sin embargo, la optimización del cultivo mediante el u.......

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Discusión

En este trabajo estudiado la unión de Au a las proteínas de la capa S se investigó usando una combinación de diferentes métodos analíticos. En particular, la unión de Au es muy atractivo no sólo para la recuperación de Au de las aguas de minería o las soluciones del proceso, sino también para la construcción de materiales, por ejemplo, superficies sensoriales. Para los estudios de la interacción Au (Au (III) y Au (0) -NPs) con suspensión y monocapa de SLP1 recristalizado, la proteína tuvo que aislarse........

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

El presente trabajo fue parcialmente financiado por el IGF-proyecto "S-tamiz" (490 ZBG / 1), financiado por el BMWi y BMBF-proyecto "Aptasens" (BMBF / DLR 01RB0805A). Un agradecimiento especial a Tobias J. Günther por su valiosa ayuda durante los estudios de AFM y a Erik V. Johnstone por leer el manuscrito como un hablante nativo de Inglés. Además, el autor de este trabajo quiere agradecer a Aline Ritter y Sabrina Gurlit (del Instituto de Ecología de Recursos para la asistencia en las mediciones de ICP-MS), Manja Vogel, Nancy Unger, Karen E. Viacava y el Grupo de Biotecnología del Instituto Helmholtz- Freiberg de Tecnología de Recursos.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
fuerte y software
Biorreactor, Vapor en el lugar 70L Sistema pilotoApplikon Biotechnology, Países BajosZ6XIncluyendo dO2, sensores de pH de Applikon Biotechnology y BioXpert software V2 Monitor de
biomasa no invasivo BugEye 2100BugLab, Concord (CA), EE. UUEspectrómetro Z9X---
Ultrospec 1000Amersham Pharmacia Biotech, Gran Bretaña80-2109-10Empresa ahora GE Healthcare Life Sciences
Microcentrífuga MiniStarVWR, Alemania521-2844Para la centrifugación de muestras de cultivo
Microscopio para sistema de investigación BX-61Olympus Germany LLC, Alemania037006Microscopio en combinación con el software de imagen
Cell^P (versión 3.1)Olympus Soft Imaging Solutions LLC, Mü nster, Alemania---junto con el microscopio
Powerfuge Pilot sistema de separación Serie 9010-SCarr Centritech, Florida, EE. UU.9010PLTPara la recolección de biomasa
T18 basic Ultra TurraxIKA Labortechnik, Alemania431-2601Para la eliminación de flagelos y la homogeneización de muestras
Sorvall Evolution RC Centrífuga SuperspeedThermo Fisher Scientific, EE. UU728411Utilizado en el aislamiento
de proteínas Procesador móvil de fluido de alto cizallamiento, M-110EH-30 PilotMicrofluidics, Massachusetts, EE. UU.M110EH30KUtilizado para la ruptura celular
Liofilizador Alpha 1-4 LSCMartin Christ Freeze dryers LLC, Osterode, Alemania102041---
Espectrofotometría UV-VIS (NanoDrop 2000c)Thermo Fisher Scientific, EE. UU91-ND-2000C-LPara la determinación de proteínas concentración
Mini-PROTEAN cámara de electroforesis verticalBio-Rad Laboratories GmbH, Múnich, Alemania165-3322Para SDS-PAGE
VersaDoc Imaging System 3000Bio-Rad Laboratories GmbH, Múnich, Alemania1708030Se utiliza para la obtención de imágenes de geles SDS-PAGE
ICP-MS Elan 9000PerkinElmer, Waltham (MA), EE. UU.N8120536Para la determinación de la concentración
de metalesZetasizer Nano ZSMalvern Instruments, Worcestershire, Reino UnidoZEN3600Para la determinación del tamaño de las nanopartículas
dispositivo Q-Sense E4 Q-Sense AB, Gotemburgo, SueciaQS-E4pedido a través de LOT quantum design (software incluido con la plataforma E4)
Q-Soft 401 (registro de datos)Q-Sense AB, Gotemburgo, Suecia
Q-Tools 3 (evaluación y modelado de datos)Q-Sense AB, Gotemburgo, Suecia
Módulos de flujo QCM-D QFM  401 y nbsp;Q-Sense AB, Gotemburgo, SueciaQS-QFM401pedido a través de LOT quantum design
QSX  Sensores piezoeléctricos de cuarzo de corte AT 303 SiO2Q-Sense AB, Gotemburgo, SueciaQS-QSX303solicitado a través de LOT quantum design
Cámara de limpieza de ozonoBioforce Nanoscience, Ames (IA), EE. UU.QS-ESA006ordenado a través de LOT Quantum
Design Microscopio de fuerza atómica MFP-3D Bio AFMAsylum Research, Santa Bárbara (CA), EE. UU.MFP-3DBioSoftware de medición e imagen AFM
Asylum Research AFM Software AR Versión 120804+1223Asylum Research, Santa Bárbara (CA), EE. UUsoftware de imágenes incluido en Cat. No. MFP-3DBio
Igor Versión Pro 6.3.2.3 SoftwareWaveMetrics, Inc., EE. ---el software de imagen incluido en el nº de cat. No. MFP-3DBio
BioHeaterAsylum Research, Santa Bárbara (CA), EE. UUBioheaterCalentador de muestra para mediciones AFM
Biolever mini voladizo,  BL-AC40TS-C2Olympus Alemania LLC, Alemania  BL-AC40TS-C2Voladizo preferido para mediciones de AFM
WSxM 5.0 Develop 6.5 (2013)Nanotec Electronica S.L. , Españagratuitopara el análisis de AFM
NameCompanyNúmero de catálogoComments
>Detergentes y otros equipos
ácido ácido, 100 %, P.A.CARL ROTH GmbH+CO. KG3738.5Líquidos y vapores peligrosos, inflamables y corrosivos. Causa quemaduras graves en la piel y daño ocular.
Antiespumante 204Sigma-Aldrich Co. LLC.A6426Para supresión de espuma
, azul de bromofenol, sal de sodioSigma-Aldrich Co. LLC.B5525---
Coomassie Azul Brillante R (C45H44N3NaO7S2)CARL ROTH GmbH+CO. KG3862.1---
Desoxirribonucleasa II del bazo porcinoSigma-Aldrich Co. LLC.D4138Tipo IV, 2.000 - 6.000  Etanol de Kunitz unidades/mg de proteína
, 95%VWR, Alemania20827.467Peligro,
glicerina inflamable, p.A.CARL ROTH GmbH+CO. KG3783.1---
Clorhidrato de guanidina (GuHCl)CARL ROTH GmbH+CO. KG0037.1---
Hellmanex IIIHellma GmbH & Co. KG9-307-011-4-507---
Ácido clorhídrico (HCl) (37%)CARL ROTH GmbH+CO. KG4625.2Peligro; Corrosivo, utilizado para el ajuste
del pH Lisozima de clara de huevo de gallinaSigma-Aldrich Co. LLC.L6876 Polvo liofilizado, proteína = 90 %, = 40.000 unidades/mg de proteína (Sigma) 
Agitador magnético con calentamiento,  MR 3000KHeidolph Instruments GmbH & Co.KG, Alemania504.10100.00Agitador estándar dentro
del experimento NB-Media DM180Mast Diagnostica GmbH121800---
Ácido nítrico (HNO3)CARL ROTH GmbH+CO. KGHN50.1Peligro; Oxidante, corrosivo
PageRuler Escalera de proteínas sin teñirThermoScientific-Pierce26614---
Poly(4-estirenosulfonato de sodio) (PSS)Sigma-Aldrich Co. LLC.243051Mw promedio ~ 70,000
Polietilenimina (PEI), ramificadaSigma-Aldrich Co. LLC.408727Advertencia; Nocivo, irritante, peligroso para el medio ambiente; promedio Mw ~25,000
Carbonato de potasio anhidro (K2CO3)Sigma-Aldrich Co. LLC.60108Advertencia;
Ribonucleasa A dañina del páncreas bovino Sigma-Aldrich Co. LLC.R5503Tipo I-AS, 50 - 100 unidades Kunitz/mg de proteína 
Azida de sodio (NaN3)Merck KGaA106688 Peligro; muy tóxico y peligroso para el medio ambiente
Cloruro de sodio (NaCl)CARL ROTH GmbH+CO. KG3957.2---
Dodecil sulfato de sodio (SDS)Sigma-Aldrich Co. LLC.L-5750Peligro; tóxico
Hidróxido de sodio (NaOH)CARL ROTH GmbH+CO. KG6771.1Peligro; Corrosivo, utilizado para la regulación del pH dentro del cultivo y el ajuste del pH
Spectra/Por 6, Membrana de diálisis, MWCO 50,000 CARL ROTH GmbH+CO. KG1893.1---
Ácido sulfúrico (H2SO4)CARL ROTH GmbH+CO. KGHN52.2Peligro; Corrosivo, utilizado para la regulación del pH en el cultivo
Ácido tánico (C76H52O46)Sigma-Aldrich Co. LLC.16201---
TRIS HCl (C4H11NO3HCl)CARL ROTH GmbH+CO. KG9090.2---
Triton X-100CARL ROTH GmbH+CO. KG3051.3Advertencia; Nocivo, peligroso para el medio ambiente
VIVASPIN 500, 50.000 MWCO Tubos de ultrafiltraciónSartorius AGVS0132---
β-mercaptoetanolSigma-Aldrich Co. LLC.M6250Peligro, tóxico
. . . , ---. software

Referencias

  1. Merroun, M. L., Rossberg, A., Hennig, C., Scheinost, A. C., Selenska-Pobell, S. Spectroscopic characterization of gold nanoparticles formed by cells and S-layer protein of Bacillus sphaericus JG-A12. Mater. Sci. Eng. C. 27 (1), 188-192 (2007).
  2. Raff, J., Soltmann, U., Matys, S., Selenska-Pobell, S., Bottcher, H., Pompe, W.

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