La migración de células T CD4 obtener imágenes intersticial en la dermis inflamadas

La función efectora de las células T CD4 depende críticamente de su capacidad para entrar y atravesar rápidamente una amplia variedad de tejidos periféricos para detectar daños, localizar focos de infección o causar patología a partir de una infección crónica o autoinmunidad. Si bien los procesos de localización de los sitios inflamados^1-4 y de extravasación^5-7 de la vasculatura a los tejidos han sido bien caracterizados, los factores que impulsan y regulan la motilidad intersticial de las células T siguen sin definirse. La migración de linfocitos T en entornos 3D complejos se ha estudiado in vitro mediante el uso de matrices artificiales^8-10 o dispositivos microfluídicos^11,12, pero estos no logran recapitular el entorno complejo y dinámico de un sistema in vivo. Solo recientemente, con el advenimiento de las imágenes intravitales multicolor de alta resolución, se ha hecho posible estudiar el comportamiento dinámico de las células inmunitarias in situ, lo que permite una mejor comprensión de las respuestas inmunitarias intactas.

Hace más de una década, se publicaron varios estudios influyentes que utilizaron por primera vez la microscopía multifotónica para abordar cuestiones inmunológicas. Los primeros estudios se centraron en el comportamiento de las células inmunitarias dentro de los órganos linfoides explantados^13-16, que pronto fueron seguidos por técnicas para obtener imágenes de los ganglios linfáticos expuestos en ratones anestesiados¹⁷. Las imágenes permitieron nuevas observaciones fundamentales sobre las etapas de cebado de los ganglios linfáticos de las células T¹⁸, los mecanismos por los cuales las células T migran en los órganos linfoides secundarios¹⁹, las interacciones de las células T con otras células inmunitarias^20,21 y el posicionamiento dinámico de las células T dentro del ganglio linfático²². Aunque muchos de los primeros estudios se centraron en la dinámica de los ganglios linfáticos, desde entonces se han utilizado imágenes intravitales para obtener imágenes de la respuesta inmunitaria en muchos tejidos periféricos, como el cerebro^23-25, el hígado²⁶, el pulmón²⁷ y la piel^28-30.

La dermis del oído del ratón está particularmente bien preparada para la obtención de imágenes, debido a la delgadez de la piel del oído, una relativa falta de pelo y la facilidad con la que se puede aislar de los movimientos respiratorios³¹. De hecho, la dermis del oído se ha utilizado para obtener imágenes del comportamiento intersticial de las células dendríticas^32,33, las células T^28,29,34,35 y los neutrófilos^36,37, y es un sitio bien establecido para estudiar la inflamación dérmica. Cada vez más, los procedimientos no invasivos han reemplazado las preparaciones quirúrgicas de la piel, incluidos los modelos de dermis dividida^38,39, flanco^39,40 o ventana de colgajo dorsal de piel^39,41, que pueden inducir cambios en el medio inflamatorio local. El uso de linfocitos T efectores CD4 específicos de antígeno transferidos, preparados in vitro, permite el estudio de una población homogénea de células en el contexto de una respuesta inflamatoria dérmica³⁰. Aquí describimos un procedimiento de imagen no invasivo que permite la visualización de células T CD4 efectoras específicas de antígeno en el intersticio dérmico del oído de ratón inflamado, y la capacidad de manipular estas células en tiempo real mediante la introducción de anticuerpos bloqueantes a través de un catéter venoso. Demostramos que este modelo es eficaz para rastrear el movimiento de las células T CD4 en la dermis y para indagar en los mecanismos que gobiernan esta motilidad.

Todos los procedimientos que implican los ratones fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Rochester, y llevaron a cabo en estricta conformidad con la Ley de Bienestar Animal y la Política de Servicio de Salud Pública sobre la Integridad Personal Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio administrado por los Institutos Nacionales de Salud, Oficina de Bienestar de Animales de Laboratorio.

1. Preparación de las células T efectoras CD4

NOTA: BALB / c ratones transgénicos TCR DO11.10 que reconocen específicamente un péptido de la ovoalbúmina de huevo de gallina (Pova: ISQAVHAAHAEINEAGR). Otros sistemas de TCR transgénicos pueden ser sustituidos, utilizando el péptido cognado apropiado en lugar del Pova donde se indica.

1. Purificar las células T CD4 vírgenes
   1. La eutanasia a un 6-8 semanas de edad / c hembras de ratón BALB DO11.10 mediante la exposición a 2 L / min de CO ₂ hasta que el ratón no muestra signos de movimiento o respiración durante 1 min, seguido por dislocación cervical, o de acuerdo con ladirectrices del comité local institucional Cuidado de Animales y el empleo. Pulverizar el ratón con una solución de etanol al 70% y hacer una incisión de aproximadamente 7 cm en la piel de la barbilla del ratón a 2/3 del camino hacia abajo el abdomen. Hacer 2-3 incisiones cm de la piel desde el extremo de la incisión en el abdomen hacia las patas traseras. Tenga cuidado de no cortar el peritoneo.
   2. Con cuidado, separar la piel del peritoneo tirando suavemente con fórceps. Los ganglios linfáticos inguinales se encuentran en la piel cerca de la unión de las patas traseras con el cuerpo. Eliminar agarrando y tirando con fórceps y lugar en 8 ml de HBSS suplementado con suero de ternera recién nacida al 2% (NCS).
   3. Cosechar los ganglios axilares y braquial nodos del ratón agarrando y tirando suavemente con fórceps. Colocar en el HBSS + 2% NCS con los ganglios linfáticos inguinales.
   4. Cosechar las profundas y superficiales ganglios linfáticos cervicales localizadas en el cuello del ratón con fórceps y el lugar en el HBSS + 2% NCS con el otsus ganglios linfáticos.
   5. cortar suavemente en el peritoneo, teniendo cuidado de no cortar ninguno de los intestinos. Agarre el ciego y el colon con unas pinzas y exponer a los ganglios linfáticos mesentéricos que están ubicadas justo a lo largo del colon. Retirar con cuidado los ganglios linfáticos mesentéricos con una pinza y coloque con el resto de los ganglios linfáticos.
   6. Busque el bazo en la cavidad peritoneal y quitar con cuidado, sosteniendo con unas pinzas y cortar el tejido conectivo de distancia con un par de tijeras quirúrgicas. Coloque el bazo con los ganglios linfáticos.
   7. Preparar una suspensión de células individuales mediante el vertido de los + 2% NCS HBSS que contenía el bazo y los ganglios en un colador de metal colocado en una placa de cultivo de 60 x 15 mm. puré suavemente el bazo y los ganglios a través del colador de metal con el émbolo de una jeringa de 10 ml en el + 2% NCS HBSS.
   8. Con una pipeta, proponer la suspensión celular en un tubo de centrífuga limpio de 50 ml. Enjuague el colador de metal y placa de cultivo con 10 ml adicionales de HBSS + 2% NCS, ucantar una pipeta, y colocar esta solución en el mismo tubo de centrífuga de 50 ml como la suspensión celular.
   9. Girar las células a 600 xg durante 5 min para sedimentar las células y resuspender en 10 ml de HBSS + 2% NCS pipeteando suavemente. A menos que se especifique lo contrario, todos centrifugación debe realizarse a 600 xg durante 5 min.
   10. Diluir 10 l de la suspensión de células en 90 l de 0,1% de azul de tripano en PBS para una dilución 1:10. Colocar 10 l de las células en azul de tripano en un hemocitómetro pipeteando la solución en la ranura en el borde de la hemocitómetro. Contar las células blancas de la sangre en la cuadrícula centro del hemocitómetro, haciendo caso omiso de los eritrocitos que aparecen como un poco más pequeña, redonda, glóbulos rojos de tonos y las células azules muertas / moribundos. Multiplicar el número de células contadas por 10 ^4, por el factor de dilución (10), y por el volumen de las células (10 ml) para determinar el número total de células recogidas en el tubo de centrífuga de 50 ml.
   11. Para enriquecer en células T CD4, centrifugar lacélulas para sedimentar y resuspender las células en 2x10 ⁷ células / ml en una solución que contiene aproximadamente 1 mg / ml anti-CD8 (clon 3.155), 1 mg / ml anti-MHC de clase II (clon M5 / 114), y 1 g / ml anticuerpos anti-CD24 (clon J11d) en HBSS + 2% NCS pipeteando suavemente.
       NOTA: Los anticuerpos utilizados en este paso se derivan de la casa a partir de líneas celulares de hibridoma y las concentraciones son aproximadas. La concentración y el volumen de estos anticuerpos ideales para la lisis del complemento se determinaron empíricamente y varían dependiendo del laboratorio. Alternativamente, varios kits disponibles en el mercado están disponibles para la purificación de las células CD4 T ingenuas y pueden ser sustituidos por la lisis de complemento y el proceso de purificación CD62L + representado aquí. Si se utiliza otro método para purificar las células T CD4 vírgenes, este protocolo se puede continuar desde el paso 1.2.
   12. Incubar en hielo durante 30 min. Al final de esta incubación, descongelar rápidamente complemento de cobaya mediante la colocación en un 37 ° C el agua bath durante aproximadamente 2 min. Añadir 100 l de complemento para cada 1 ml de células en la solución de anticuerpo pipeteando el complemento directamente en la suspensión celular. Se incuban las células en un baño de agua a 37 ° durante 30 min.
   13. Añadir HBSS + 2% NCS para llevar las células a un volumen total de 20 ml en el tubo de centrífuga. Capa en 8 ml de RT medios centrifugación de densidad (densidad 1,086 g / ml) por debajo de las células. Inmediatamente centrifugar las células a 1400 xg a TA durante 15 min con el freno de la centrífuga fuera.
   14. Recoger las células en la interfase utilizando una pipeta serológica células y la transferencia a un nuevo tubo de centrífuga de 50 ml. Se lavan las células por lo que el volumen en el tubo de centrífuga de 50 ml con HBSS + 2% NCS y la centrifugación.
   15. Resuspender las células en tampón MACS (PBS suplementado con 2% de NCS y EDTA 2 mM) pipeteando y contar como anteriormente, en el paso 1.1.10 suavemente.
   16. Para enriquecer en células T CD4 vírgenes, volver a suspender las células a 2x10 ⁷ células / ml en una soluciónde / ml de anticuerpo anti-CD62L conjugado con biotina 2,5 mg en tampón MACS, basado en el número contado en el paso 1.1.16. Incubar durante 30 minutos en hielo.
   17. Se lavan las células por adición de 10 ml de tampón MACS, y luego centrifugación de las células. Resuspender las células en 10 ⁷ células / 100 l en tampón MACS y añadir perlas de separación magnética con estreptavidina conjugada a una dilución 1:10 directamente a las células. Incubar en hielo durante 20 min.
   18. Lavar las células como antes, en el paso 1.1.17, y resuspender las células en 2x10 ⁸ células / ml en tampón de MACS, en un volumen mínimo de 500 l.
   19. Coloque una columna de separación magnética en el soporte de imán y lavar la columna dejando que fluya tampón MACS 3 ml a través. Aplicar las células a la columna con una pipeta.
   20. Lavar la columna para eliminar las células no unidas por la columna magnética pipeteando 3 ml de tampón MACS a la columna y permitiendo que el tampón MACS fluya a través de, y repetir 3 veces. Desechar el flujo a través de fracción.
   21. Remove la columna del soporte magnético y mantenga sobre un nuevo tubo de centrífuga de 50 ml. Pipeta de 5 ml de tampón MACS a la columna y utilizar el émbolo cerrado con la columna para empujar el búfer de MACS a través de la columna para liberar las células unidas de la columna y recoger el flujo a través que contiene las células CD4 T ingenuas enriquecido.
   22. Centrifugar las células y resuspender en 10 ml de RPMI suplementado con 10% de suero de ternera fetal (FCS), 100 UI / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 2 mM L-glutamina, y 50 mM 2-mercaptoetanol (RPMI-10). Contar las células como antes, en el paso 1.1.10.
   23. Ajustar la concentración final de las células CD4 T ingenuas a 6x10 ⁵ / ml en RPMI-10.
2. Purificar T esplénicas APCs empobrecido células
   1. La eutanasia a un 6-8 semanas de edad, hembra de tipo salvaje ratón BALB / c como en el paso 1.1.1.
   2. Pulverizar el ratón con una solución de etanol al 70% y exponer el bazo al hacer una incisión de aproximadamente 3 cm en el lado izquierdo de abdome del ratónnorte. Cortar abrir la capa peritoneal y extirpar el bazo agarrando suavemente con fórceps y se corta lejos del tejido de conexión subyacente con unas tijeras quirúrgicas.
   3. Coloque el bazo en 8 ml de HBSS + 2% NCS.
   4. Preparar una suspensión de células individuales por maceración el bazo, lavado, y contar las células, como antes, en los pasos 1.1.7-1.1.10
   5. Agotar las células T haciendo girar las células a 600 xg durante 5 min para sedimentar y resuspender las células en 2x10 ⁷ en una solución de aproximadamente 1 mg / ml de anticuerpo anti-Thy1.2 (clon J1J) pipeteando suavemente. Se incuban las células en hielo durante 30 min.
      NOTA: Este anticuerpo se deriva de la casa de una línea celular de hibridoma y la concentraton se aproxima. La concentración y el volumen de este anticuerpo ideal para lisis de complemento se determinó empíricamente y variarán entre laboratorios. Otros métodos para la purificación de APC a partir de esplenocitos pueden ser sustituidos si se desea. células T vírgenes y las CPA deben estar preparados en el cultoure desde el paso 1.3.
   6. Añadir complemento de cobaya, incubar, y separar las células en un gradiente de densidad de los medios de comunicación de la centrifugación como antes, en los pasos 1.1.13-1.1.14.
   7. Resuspender las células en 10 ml de RPMI-10 e irradiar las APC mediante la colocación de las células en un tubo de centrífuga de 50 ml en un irradiador gamma de una longitud de tiempo que va a exponer las células a 25 Gy de radiación. Este período de tiempo puede variar en función del irradiador y tendrá que ser calculado cada vez que se irradian las células.
   8. Contar las células en un hemocitómetro como antes, en el paso 1.1.10, y ajustar las células APC a una concentración final de 2.4x10 ⁶ células / ml en RPMI-10.
3. Estimular las células y diferenciar las células T CD4 a un fenotipo Th1 en un cultivo de 5 días.
   NOTA: A pesar de que aquí se presenta un protocolo para la preparación y formación de imágenes efectores Th1 generadas a partir de células T CD4 vírgenes, este protocolo se puede ajustar para diferenciar las células de los animales a un fenotipo diferente, o to utilizar otros tipos de células, como las células T CD8. Condiciones para el cebado y la diferenciación tendrán que ser determinado empíricamente.
   1. En cada pocillo de una placa de cultivo de 24 pocillos, se combinan 500 l de las células T CD4 vírgenes y 500 l de las APC irradiadas en cada pocillo, para un total de 3x10 ⁵ células T y 1.2x10 ⁶ APC por pocillo.
   2. Preparar una solución en RPMI-10 que contiene 2 mM de péptido cognado OVA, 20 U / ml IL-2 recombinante, 80 mg / ml anti-IL-4 (clon 11B11) y 40 ng / ml IL-12 recombinante y el filtro utilizando un 0,2 filtro de jeringa de micras. Añadir 1 ml de esta solución a cada pocillo de células, para un volumen total de 2 ml en cada pocillo.
   3. Se incuban las células en una incubadora a 37 ° en 5% de CO ₂ durante 3 días.
   4. El día 3, dividir las culturas pipeteando suavemente para resuspender las células y en movimiento 1 ml de cada pocillo a una nueva cultura también. Llevar cada pocillo para un volumen final de 2 ml por la adición de 1 ml / pocillo de RPMI-10 + 20 U / ml recombinante IL-2. </ Li>
   5. Volver las placas a la incubadora y permitir que las células se expanden hasta día 5.

2. La transferencia de células y la inducción de la inflamación

NOTA: Para obtener el número de células óptimas para la formación de imágenes, 5x10 ⁶ células Th1 marcados con fluorescencia deben ser transferidos a cada ratón en un volumen total de 200 l de PBS. Las células que aquí se etiquetan con la CFSE tinte verde o el tinte CMTMR casi rojo, aunque se pueden usar otros tintes rastreador celular. CFSE y células marcadas con CMTMR pueden co-transferidos a permitir el seguimiento de dos poblaciones CD4 distinto efectoras.

1. Las células T efectoras etiqueta con CFSE
   1. Recoger las células de las placas de cultivo pipeteando enérgicamente las células en cada pocillo y transferir a un tubo de centrífuga de 50 ml estéril con una pipeta. Contar las células como en el paso 1.1.10, después centrifugar y resuspender las células en 10 ⁷ células / ml en PBS + 5% NCS.
   2. Diluir 5 mM solución madre CFSE 1: 100 enPBS. Añadir 110 l solución CFSE por cada 1 ml de las células mediante la colocación de una gota de solución de CFSE en el lado del tubo y luego rápidamente de oscilación del tubo hacia atrás y adelante para mezclar a fondo.
   3. Se incuban las células durante 5 min a RT, a continuación, enfriar rápidamente la CFSE mediante la adición de 5 ml de suero de ternera fetal (FCS) directamente al tubo de las células. Llevar el volumen a 50 ml con PBS + 5% NCS.
   4. Centrifugar las células y resuspender el precipitado en 20 ml de PBS + 5% NCS. Repetir este proceso dos veces más para lavar las células 3 veces en total. Contar las células en un hemocitómetro, como antes, en el paso 1.1.10, y resuspender las células en PBS estéril a 2,5 x 10 ⁷ células / ml para la transferencia a ratones.
2. Las células T efectoras etiqueta con CMTMR
   1. Recoger las células como anteriormente en la etapa 2.1.1, a continuación, contar, centrifugar y resuspender las células en 10 ⁷ células / ml en RPMI-10.
   2. Añadir CMTMR mM solución madre 10 directamente a las células para una concentración final de 10 mM. º rápidamente pipetacélulas e para mezclar a fondo en el CMTMR y evitar la precipitación del colorante.
   3. Incubar 30 minutos en un baño de agua a 37 °. Lavar las células 3 veces en PBS + 5% NCS como antes, en el paso 2.1.3-2.1.4. Contar y resuspender las células en PBS estéril a 2.5x10 ⁷ células / ml para la transferencia a ratones.
3. las células T efectoras de transferencia de ingenua de edad ratones hembra de 6-8 semanas BALB / c.
   1. Dibujar la suspensión de células (paso 2.1.4 o 2.2.3) en una jeringa, teniendo cuidado de eliminar todas las burbujas manteniendo la jeringa de la aguja lado plano, agitando suavemente el lado de la jeringa y mover el émbolo hacia arriba y abajo, si es necesario .
   2. Coloque los ratones en una jaula limpia y calentar suavemente bajo una lámpara de calor hasta que la vena de la cola aparece vasodilatados. Coloque el ratón en un dispositivo de retención y limpie la cola con un algodón con alcohol. inyectar lentamente 200 l de la suspensión celular en la vena lateral de la cola. No debería haber ninguna resistencia a la inyección o burbujeo visible bajo la piel.
4. Inducir la inflamación dérmica mediante la inmunización con adyuvante completo de Freund (CFA)
   NOTA: En este protocolo, la inflamación es inducida por inyección intradérmica de CFA emulsiona con el antígeno, ya sea afín o no afines. Otros modelos inflamatorios pueden ser sustituidos, aunque tendrá que ser ajustado empíricamente el número de células necesarias para la transferencia y el momento de formación de imágenes.
   1. Preparar una solución de 200 mM de péptido OVA en PBS estéril en un tubo de microcentrífuga. Pipet un volumen equivalente de CFA en la parte superior de la solución de péptido.
   2. Emulsionar la solución dibujando en una jeringa / 2 insulina 28 G1 y luego sumergirse la solución de nuevo en el tubo de microcentrífuga, a continuación, repetir esta acción de aproximadamente 20 veces. Cuando está completamente emulsionado, el CFA y solución de péptido formarán una mezcla espesa y opaca.
      NOTA: es esencial utilizar una jeringa de insulina con aguja fija para formar la emulsión, ya que la emulsión se perderá en el espacio muerto en una needl no fijoe jeringa.
   3. Prueba de la emulsión dejando caer una pequeña cantidad en agua colocada en una placa de Petri. La emulsión debe permanecer intacto y no dispersarse en el agua.
   4. Dibuje la emulsión en una jeringa G1 / 2 300 l de insulina 28 y presione hacia abajo con fuerza el émbolo para eliminar grandes burbujas de aire.
   5. Inmediatamente después de la transferencia de la etiqueta fluorescente las células T efectoras, anestesiar a los ratones mediante inyección ip de 2,2,2-tribromoetanol a 240 mg / kg. Evaluar la anestesia por una pizca dedo del pie suave, la administración de más de 2,2,2-tribromoetanol en incrementos de 1 mg, si es necesario.
      NOTA: otros anestésicos aprobados puede ser sustituido por el 2,2,2-tribromoetanol.
   6. Coloque un dedal en el dedo índice izquierdo y agarrar con cuidado la oreja del ratón entre el pulgar y el dedo índice izquierdo con la oreja ventral hacia arriba. Asegúrese de no ejercer una presión excesiva en el oído, lo que puede causar daños mecánicos en la piel.
   7. Deslice la aguja que contiene el correo CFAemulsión en la dermis, con el lado cónico hacia arriba, e inyecte lentamente 10 l de la emulsión en el oído. La colocación de la inyección debe estar en el exterior 1/3 del pabellón auricular, ligeramente fuera del centro para permitir la formación de imágenes óptima.
   8. Monitorear los ratones hasta que la anestesia ha desaparecido y los ratones son capaces de enderezarse y son ambulatorios. los ratones de imagen de 3 días después de la inmunización, proporcionando tiempo para la inflamación y para desarrollar las células T transferidas al tráfico a la dermis del oído.
      NOTA: Los ratones no pueden ser dejados solos en ningún momento mientras está bajo anestesia.

3. Preparación del ratón de la Imagen

1. Preparar un catéter
   1. Retire cuidadosamente la aguja de metal de un / 2 tuberculina (TB) de la aguja de la jeringa 30 G1 con pinzas y limpie cualquier exceso de pegamento, usando un microscopio de disección para visualizar que el pegamento se elimina por completo.
   2. Corte la punta de aguja de la jeringa de otro / 2 TB 30 G1, asegurándose de que la aguja restante sigue siendo patent mediante inspección visual. Slip una pieza 18 cm de PE-10 tubos médicos en la aguja recortado, y se coloca cuidadosamente la aguja de metal desnudo aproximadamente 5 mm en el otro extremo de la tubería, la creación de un catéter.
2. Enjuague el catéter por llenar una jeringa TB 1 ml con PBS estéril, la eliminación de las burbujas de aire. colocar suavemente el catéter en la punta de la jeringa y empuje PBS suavemente pesar de que el catéter para eliminar las burbujas en el tubo.
   NOTA: al empujar fluido a través del catéter, es esencial para mantener el catéter en la jeringa para evitar que la presión del fluido de empujar el catéter fuera de la jeringa.
3. Coloque los ratones en una jaula limpia y calentar suavemente bajo una lámpara de calor hasta que la vena de la cola aparece vasodilatados. Anestesiar al ratón con una mezcla de aire de la habitación y isoflurano (5% de inducción, mantenimiento 1-2%, en 2 L / min velocidad de flujo), entregada a través del conjunto del cono de nariz que se ha unido al vaporizador de isoflurano. Asegúrese de que el ratón se anestesia with una pizca dedo del pie suave. Incrementalmente aumentar la tasa de flujo de isoflurano por 0,1% si se observa el movimiento. Cubra los ojos con pomada oftálmica para evitar el secado y la lesión, mientras que el ratón se anestesia.
   NOTA: Es esencial que los ratones no dejar desatendidos mientras están anestesiadas. Los ratones se debe supervisar con frecuencia para la anestesia suficientes por pizca dedo del pie suave.
4. Inmovilizar la cola en la base con un par de pinzas, y luego limpie la cola con un algodón con alcohol. deslice con cuidado el catéter en la vena lateral de la cola y comprobar la permeabilidad empujando suavemente el émbolo de la jeringa. No debería haber ninguna resistencia al movimiento y sin burbujeo visible de PBS debajo de la piel si se coloca adecuadamente. Colocar el catéter a la cola mediante la aplicación de 1-2 gotas de adhesivo tisular de cianoacrilato al sitio de inyección y dejar secar, aproximadamente 30 seg.
5. Con cuidado, recortar el pelo de la parte posterior y los lados de la oreja con un par de tijeras, teniendo cuidado de no dañar el sken. Recortar los bigotes también. El uso de un hisopo de algodón, humedezca la superficie interior de la oreja con PBS.
6. Girar el ratón y el oído en un cubre de vidrio Nº 1.5 24 x 50 mm. Con unas pinzas, aplanar un poco la oreja sobre la hoja de la cubierta, mover el ratón, si es necesario para asegurar que el oído esté al ras con el vidrio. Eliminar el exceso de PBS desde el oído secando suavemente con un pañuelo de papel limpia.
   NOTA: Asegúrese de no presionar demasiado firmemente en el oído, como la piel fina puede dañarse fácilmente con una presión excesiva.
7. El uso de dos pares de pinzas curvas, agarre una de aproximadamente 20 mm de largo trozo de cinta de tela longitudinalmente en las esquinas superiores. Coloque la parte inferior de la cinta en el cubreobjetos en la parte superior de la oreja del ratón y rodar la cinta adhesiva sobre el resto de la oreja, empujando el exceso de pelo fuera del camino con las pinzas si es necesario para colocar la oreja para el cubreobjetos. Presione suavemente en la cinta alrededor de la oreja con un hisopo de algodón seco para asegurar un sello hermético, teniendo cuidado de no presionar sobre el propio oído.
8. Fije la plataforma de imágenes a un bloque de calentamiento 37 ° C con cinta adhesiva. Aplicar grasa de vacío a ambos lados de la zona del oído de la plataforma de formación de imágenes. Girar el ratón para colocar el cubreobjetos sobre la plataforma de formación de imágenes, teniendo cuidado de alinear el oído en el centro del fieltro.
   NOTA: Evite que la grasa de vacío en la cinta, ya que esto hará que venga separada de la hoja de la cubierta de vidrio.
9. Encaje la ojiva isoflurano en el soporte de la plataforma de imágenes, asegurando que la ojiva es seguro y que cubre por completo la nariz del ratón. Corre la grasa de vacío bajo el cubreobjetos, presionando firmemente pero con cuidado el cubreobjetos sobre la plataforma de imágenes con un hisopo de algodón limpio y seco.
10. Colocar el cubreobjetos a la plataforma con dos 20 mm trozos de cinta y dos piezas más largas de cinta envuelta alrededor de la parte superior de la plataforma. Si las burbujas de aire están presentes entre el oído y el cubreobjetos, que se pueden eliminar suavemente pulsando en la oreja desde abajo with un pedazo de papel doblado.
    NOTA: Es muy importante no utilizar papel demasiado grueso o para presionar con firmeza, ya que esto puede causar daños en los tejidos y el escaldado, lo que complica los resultados.
11. Mover el ratón a la platina del microscopio y asegure la plataforma con cinta adhesiva. Pipe una doble capa de grasa de vacío en el cubreobjetos alrededor de la oreja para servir como un depósito para el objetivo de inmersión en agua.
12. Envuelva una manta eléctrica llena de agua alrededor del ratón a través de la plataforma de imágenes. Llene el depósito con agua a 37ºC destilada. Asegúrese de que todo lo que se asegura a la etapa con cinta adhesiva y que la jeringa del catéter es de fácil acceso.

4. En vivo de imágenes de lapso de tiempo y la administración del anticuerpo intravenosa

NOTA: Este protocolo requiere el uso de un microscopio multifotónica equipado con un Ti: Sa sistema láser. El objetivo utilizado es una lente de aumento 25x con 1,05 NA, puesta con un objetoive calentador ajustado a 40 ° C. Se determinó la temperatura óptima para este calentador empíricamente a ser la temperatura adecuada para mantener la dermis del oído a 37 ° C, y puede ser necesario ajustar para su uso en otros sistemas de formación de imágenes. El software de adquisición utilizado puede variar entre los instrumentos y ajustes al protocolo puede tener que ser hecho para trabajar en sistemas configurados de forma diferente. Asegúrese de que las imágenes se pueden guardar en un formato que es compatible con cualquier software de análisis deseado.

1. Ubicar la dermis a través de los oculares mediante el posicionamiento del objetivo sobre el centro de la oreja y bajar el objetivo justo hasta que hace contacto con la superficie del agua en el depósito. El uso de una fuente de luz externa, mirar a través de los oculares y continúe bajando lentamente el objetivo hasta que la superficie de la oreja entra en el foco. Bajar las cortinas interiores y exteriores alrededor de la platina del microscopio.
2. Determinación de la configuración de microscopio y localizar un área para la formación de imágenes
   1. antes imaging, configurar el láser para la excitación máxima y la detección de los fluoróforos deseados mediante el ajuste de la longitud de onda de láser a 900 nm en la ventana de controlador de láser MP, la potencia del láser en el Marco de adquisición: ventana de láser, y las tensiones PMT en la ventana de control de adquisición de Image .
      NOTA: Este procedimiento utiliza una longitud de onda de excitación de 900 nm con filtros para detectar la generación de segundo armónico (420-460 nm), CFSE (495-540 nm), y CMTMR (575-630 nm). Otras configuraciones se pueden utilizar para detectar diferentes fluoróforos como deseado.
   2. Ajuste el microscopio a 512 x 512 píxeles de resolución, con un tiempo de permanencia de 2 microsegundos / pixel en el Marco de adquisición: El tamaño y el modo de Windows. Activar un modo de imágenes en directo para permitir la exploración a través del tejido de un área de imagen haciendo clic en "repetir XY". Idealmente, el área debe ser relativamente uniforme, sin burbujas de aire, y evitar las zonas de los folículos pilosos densos.
      NOTA: La emulsión de CFA es autofluorescent brillantes en el verde y necanales de ar-rojo y debe ser evitado. Un campo óptima se puede encontrar generalmente aproximadamente 3 mm desde el borde de la emulsión. Aproximadamente el 10 - 100 células pueden ser rastreados en una sola imagen. Si hay demasiadas células están presentes, software de seguimiento generalmente no se produzcan problemas al tratar de separar las células situadas cerca, lo que lleva a las pistas de células acortados y / o inexactas.
   3. Una vez que un campo de la imagen apropiada ha sido localizado, determinar la región Z que será reflejada por la localización de la célula "más alto" en la dermis, estableciendo la posición Z a 0 haciendo clic en el botón "Set 0", y el desplazamiento hacia abajo de la Z dirección para medir el grado de profundidad de la célula. Una profundidad de formación de imágenes de 35 a 75 micras es típica. Establecer las posiciones de inicio y fin en el Marco de adquisición: Microscopio ventana. Ajustar el PMT voltajes y potencia del láser en la ventana de "brillante Z" para optimizar la visualización de las células en toda la profundidad del campo de la imagen.
      NOTA: Evitar la formación de la Laser el poder por encima de 25 mW a la muestra, los niveles de potencia de hasta puede causar daño por calor y lesiones estéril a la dermis. El nivel máximo de potencia adecuado para cada microscopio variará y tendrá que ser medida. Debe tenerse en cuenta que el aumento de la potencia del láser o voltajes PMT con la profundidad de tejido no permite la comparación cuantitativa de brillo de la imagen a diferentes profundidades en el análisis post-adquisición.
   4. Compruebe los botones "Time" "Profundidad" y por debajo el botón "Scan" en la ventana de Control de Adquisición de imágenes. Establecer un filtro de Kalman para escanear la imagen 3 veces por línea en la adquisición de imágenes de control: la ventana del modo de filtro y ajustar la profundidad de Z-rebanada en la Adquisición de archivo: Ventana del microscopio de modo que tarda aproximadamente 1 minuto para capturar una pila completa, como se ha señalado en la ventana TimeView.
      NOTA: El intervalo entre las pilas no debe tardar más de aproximadamente 1 min, como los intervalos más largos evitan que el seguimiento de las células que migran rápidamente. Dependiendo de THe tipo de células que se explora, puede necesitar ser ajustado para permitir el seguimiento adecuado de las células por el software de análisis de este intervalo. Z-rebanadas deben ser no más de 5 micras. Generalmente 15-18 Z-rebanadas entre 2-5 micras de espesor son apropiadas para un intervalo de imágenes 1 min.
3. Capturar una imagen de lapso de tiempo pre-anticuerpo
   1. Capturar una imagen de lapso de tiempo de 5 minutos de la zona para evaluar la estabilidad del tejido estableciendo el número de repeticiones de "5" en el ajuste de adquisición: TimeScan ventana y haciendo clic en el botón "Scan".
      NOTA: Tejido "deriva" puede ser causada por no permitir suficiente tiempo para que el oído alcance el equilibrio térmico, la mala preparación del oído, o puede ser debido a la deriva local en una región de la oreja. Si la imagen de 5 minutos no es estable, una nueva imagen de la región en la dermis. Si una segunda imagen en una nueva región sigue siendo inestable, lo mejor es repetir cuidadosamente la preparación del oído y de imagen desde el paso 3.6 con una fresca coverslip.
   2. Si el tejido es estable la imagen de 5 min en, recoger la imagen de lapso de tiempo de un 30-45 min estableciendo el número de repeticiones de entre 30 y 45 en la configuración de Adquisición: Ventana TimeScan, el seguimiento de cualquier deriva del tejido de menor importancia que la imagen es recogido. Guarde el archivo en un formato que es compatible con el software de análisis que se utilizará.
      NOTA: En este punto en el protocolo, los pasos 4.2.2 - 4.3.2 se puede repetir reproducir varias ubicaciones en el mismo oído. Un solo ratón no deben ser mantenidos anestesiado durante más de 4 horas, ya que es más probable que ocurra la muerte.
4. Inyectar anticuerpos bloqueantes y capturar una imagen post-anticuerpo.
   1. Dibuje la mezcla de anticuerpos en una jeringa de 1 ml de TB y retirar la aguja, teniendo cuidado de eliminar todas las burbujas de aire. Pulse en el émbolo de manera que la solución de anticuerpo forma un "gotita" al final de la jeringa.
   2. Levantar las cortinas alrededor del escenario y localizar el catéter. Retire el original PBS-contajeringa caniza del catéter. Sin fijar el catéter hacia abajo, con cuidado colocar la nueva jeringa que contiene los anticuerpos. Mantenga el extremo del catéter a la jeringa e inyecte lentamente la mezcla de anticuerpos en el catéter. Asegúrese de que no hay resistencia a la inyección.
   3. Ajuste el catéter hacia abajo y bajar las cortinas que rodeaban la platina del microscopio. Tenga en cuenta el momento de la inyección y de inmediato comenzar a recoger una nueva secuencia de imágenes 20-40 min en el mismo lugar con la misma configuración de instrumentos como la imagen pre-anticuerpo. Guarde el archivo en un formato apropiado para el software de análisis para ser utilizado.
      NOTA: Entre las imágenes con lapso de tiempo, observar el ratón para la anestesia y respiración suficiente. No se recomienda a la imagen más de un campo después de la administración de anticuerpos, ya que puede haber tasas variables de eliminación del anticuerpo.
5. Se inyecta dextrano marcado con fluorescencia para localizar los vasos sanguíneos, evaluar la permeabilidad del catéter, y medir bpermeabilidad de los vasos lood
   1. Preparar una solución / ml 2 mg de dextrano fluorescente conjugado (70.000 MW) en 100 l de PBS estéril y dibujar en una jeringa, la eliminación de las burbujas de aire.
   2. Usando la misma técnica que en el paso 4.4.1-4.4.2, coloque la jeringa sobre el catéter y se inyecta la solución de dextrano por vía intravenosa.
   3. Capturar una sola pila en 1024 x 1024 píxeles de resolución al cambiar la resolución en el Marco de adquisición: Modo ventana, con la misma configuración de PMT y láser como para las imágenes con lapso de tiempo. Para recoger la imagen, desactive el botón "Time" debajo del botón "Scan" y haciendo clic en el botón "Scan". Esta imagen 3D permitirá que las células T de exclusión situadas en la vasculatura y mostrar que el catéter era de patentes y ha insertado correctamente. La difusión de dextrano fluorescente de los vasos puede ser también utilizado para evaluar la permeabilidad vascular local.
      NOTA: Este de alta resolución (1024 x 1024) imagen estática se utiliza para presentation fines y, además, pueden ser utilizar para el análisis de la arquitectura de los tejidos en la misma zona que las imágenes con lapso de tiempo. Por otra parte, una imagen de 512 x 512 se puede tomar, que se pueden combinar con las imágenes con lapso de tiempo utilizando el software de análisis de imágenes. También puede ser deseable Tiempo de formación de imágenes lapso de la administración de dextrano, dependiendo de las necesidades de investigación de laboratorios individuales. En este caso, la imagen debe ser configurado como en los pasos 4.2.3-4.3.2.
6. Una vez completada la imagen, retire con cuidado el ratón de debajo del objetivo y desenvolver la manta de agua. Retire el cubre desde la plataforma de imágenes mediante la reducción de la cinta y levantar suavemente el vaso hasta que se separe. Mientras que el ratón está todavía anestesiado, separar el oído del cubreobjetos. Si esto es ser un procedimiento terminal, la eutanasia el ratón por dislocación cervical. Si el ahorro de este ratón para obtener imágenes repetidas, devuélvalo a una jaula limpia separada de otros ratones y observar hasta que el ratón puede enderezarse y esambulatorio. Una vez recuperado de la anestesia, el ratón puede ser devuelto a una jaula con otros animales.
7. Importar los archivos de imagen en un programa de análisis de imagen y realizar las correcciones deseadas. Se recomienda evitar de mejoras no lineales y programas y algoritmos automatizados de reducción de suavizado o de ruido. Por lo general, las imágenes sólo necesitan una corrección de fondo menor al aumentar manualmente el punto negro de la imagen antes del análisis. Analizar los datos de imagen mediante el uso de un programa de seguimiento de la célula automatizada con corrección manual, como en Overstreet, Gaylo et al ^30.
   NOTA: Hay muchas suites de análisis de imágenes disponibles, tanto en código abierto y propietario, que se pueden utilizar para cuantificar la dinámica celular de las imágenes multifotónica derivados de este protocolo. El método exacto de análisis de imágenes y los paquetes de software óptimas para ser utilizados dependerá de las necesidades de investigación de los laboratorios individuales.

La capacidad para estudiar las respuestas inmunes in situ, sin alterar el entorno inmunológico es esencial en el estudio de las interacciones en tiempo real de las células T efectoras con un tejido inflamado. Obtención de imágenes de la dermis del oído intactos mediante este protocolo, se indica en la Figura 1A y B, permite la visualización de las células efectoras T marcados con fluorescencia transferidos en el intersticio dérmica. Esto permite tanto de alta resolución (Figura 1C) y de lapso de tiempo (Figura 1D, Película 1) imágenes de la dinámica de células T efectoras en la dermis inflamadas.

Figura 1. alta resolución e imágenes 4D de las células T efectoras en el intersticio dérmica intacta. (A) Esquema experimental. (B) Fotografía de un prepar oídoed para la formación de imágenes con el sitio de la emulsión (negro línea discontinua) y el área óptima para la formación de imágenes (línea roja) indicó. Proyección (C) Maximal 3D de una pila de alta resolución que muestra marcado con CFSE Th1 células (verde), segunda señal armónica de colágeno fibrilar (azul) y Texas Red-dextrano marcado vasculatura (rojo). La flecha blanca indica uno de varios folículos pilosos autofluorescentes. Las barras de escala representan 50 micras (D) rutas migratorias de las células Th1 seguidos durante 30 minutos en la dermis inflamados por CFA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Este protocolo de formación de imágenes requiere el uso de una plataforma de imágenes especializado que se construyó en la casa, así como un cono de nariz adaptado para la liberación de la anestesia de inhalación mientras que las imágenes. La plataforma de imágenes (Figura 2A-B) consiste en Of una placa base de aluminio con una sección central elevada. Esta sección elevada tiene una porción de inserción revestido con acrílico sentía para proporcionar apoyo a la oreja sin comprimir y potencialmente dañar el tejido delgado. La geometría de nuestra configuración requiere la construcción de un cono de nariz flexible y ajustable para entregar la anestesia inhalada durante la exploración. Este cono de nariz, que consiste en un tubo de microcentrífuga modificado conectado a una sección de 50 mm de tubo flexible (Figura 2C), se fija en su lugar con un soporte compuesto por tubos de microcentrífuga modificados (Figura 2D) y se fija a la plataforma de formación de imágenes a través de cierre de gancho y bucle . El uso de gancho y bucle permite el reposicionamiento del conjunto de cono de nariz de modo que cualquiera de los oídos de un ratón se pueden obtener imágenes, y puede ser posicionado de manera óptima para los ratones individuales.

Figura 2. Equillo de intravital de imágenes. plataforma de imagen hecha a la medida en la parte superior (A) y lateral (B). Ojiva para la administración de isoflurano (C) y el soporte del cono de nariz (D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La cateterización de la vena de la cola permite el acceso continuo a la circulación para administrar anticuerpos y otras moléculas pequeñas que pueden difundirse fuera de la vasculatura, o moléculas fluorescentes más grandes, tales como dextrano de alto peso molecular para etiquetar los vasos sanguíneos. Después de la administración de 100 mg de anti-β 1 y anti-β 3 integrina anticuerpos de bloqueo a través del catéter, la detención células previamente móviles dentro de la dermis (Película 2). Estas células tienen una velocidad media se redujo después de anticuerpos administración (Figura 3A), así como una disminución significativa en el índice de meandros, la relación entre el desplazamiento total a la longitud total de pista (Figura 3B).

Figura 3. Administración de anti-β 1 y anti-β 3 anticuerpos inhibe Th1 la migración de células en la piel inflamada-CFA. (A) la velocidad media de las células Th1 antes y después de la administración de 100 mg anti-β 1 y anti-β 3 integrina el bloqueo de anticuerpos. (B) Índice de serpenteo de las células Th1, antes y después del bloqueo de anticuerpos. Aproximadamente 100 células orugas son de imágenes antes y después del bloqueo de anticuerpos a partir de un solo ratón en un experimento representativo. Estadísticas de Mann Whitney.en / ftp_upload / 53585 / 53585fig3large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Dado que el cabello no se elimina de la superficie de la oreja, los artefactos de imagen de los cabellos son comunes. Autofluorescencia de los folículos pilosos (Figura 4A) y el sombreado y la autofluorescencia de pelo suprayacente (Figura 4B) debe evitarse siempre que sea posible, ya que pueden oscurecer las células T e interferir con el software automatizado de análisis de imágenes. Del mismo modo, las burbujas de aire atrapadas entre la superficie de la oreja y el cubreobjetos pueden dar lugar a artefactos de imagen (Figura 4C). La preparación adecuada de la oreja debe minimizar el número y tamaño de las burbujas restantes.

Figura 4. Artefactos comunes de autofluorescencia cabello y pobres pre oídoparation. folículos pilosos (A) autofluorescent. (B) autofluorescent pelo y los folículos pilosos (verde) y colágeno (blanco) con sombras superpuestas de pelo, causando líneas oscuras en la imagen. (C) Artefacto de una burbuja de aire, mostrando el borde de la epidermis, queratinizadas autofluorescent desplazados (línea de puntos). Las barras de escala representan 50 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Además, el uso de múltiples fuentes de calor puede conducir a problemas con la estabilidad del tejido debido a la expansión y contracción térmica. Configuración del termostato incorrectas, por ejemplo, pueden dar lugar a grandes oscilaciones durante la exploración que puede hacer difícil interpretación de los resultados (Película 3). Es esencial para determinar los ajustes óptimos para cualquier sistema que proporciona una temperatura constante y maximiza la estabilidad. ultimatEly, una cámara de imágenes de temperatura controlada es la mejor manera de eliminar la variabilidad de los cambios en la temperatura.

1. Película células Th1 que migran en la dermis inflamadas-CFA (clic derecho para descargar). Imagen 30 minutos de lapso de tiempo que muestra células Th1 (verde) que migran en la red de colágeno dérmico (segunda generación armónica, azul).

2. Película Th1 células detenidas si el bloqueo de β 1 y ß 3 integrinas (clic derecho para descargar). Las células (verde) se obtuvieron imágenes durante 30 minutos antes de la administración de anticuerpos de bloqueo, y luego fotografiado durante otros 20 minutos en la misma ubicación.

Película 3. Las oscilaciones de una placa de calentamiento mal controlada (Haga clic derecho para descargar). 30 min imagen de lapso de tiempo de células Th1 (verde) y la generación de segundo armónico (azul). Después se recogió esta imagen, la placa de calentamiento utilizado se encontró que tenía un termostato defectuoso, causando oscilaciones en la temperatura de la plataforma de formación de imágenes y la expansión térmica y la contracción posterior.

Los autores no tienen nada que revelar.