Este protocolo describe cómo preparar y realizar la electroforesis de atrapamiento de fracción líquida clara nativa eluida en gel (CN-GELFrEE), una técnica de separación nativa para ensamblajes biomoleculares no covalentes y proteínas de muestras heterogéneas que es compatible con varias técnicas de análisis de proteínas posteriores.
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Artículo de método
CN-GELFrEE - eluida-gel transparente nativo fracción líquida atrapamiento de electroforesis
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Resumen
Resumen
complejos de proteínas desempeñan una serie de funciones celulares esenciales. Elucidar sus interacciones no covalentes y dinámicas es de suma importancia para la comprensión del papel de los complejos en los sistemas biológicos. Mientras que la caracterización directa de conjuntos biomoleculares se ha convertido cada vez más importante en los últimos años, las técnicas de fraccionamiento nativos que son compatibles con técnicas de análisis de aguas abajo, incluyendo la espectrometría de masas, son necesarias para ampliar aún más estos estudios. Sin embargo, el campo carece de una, de amplio rango, método de separación de alta recuperación de alto rendimiento para ensamblajes de proteína nativa. A continuación, presentamos clara fracción líquida de gel eluida electroforesis nativa atrapamiento (CN-GELFrEE), que es una modalidad novedosa para la separación de proteínas asambleas no covalentes. rendimiento de separación CN-GELFrEE fue demostrado por los complejos de fraccionamiento extraídos del corazón de ratón. Las fracciones se recogieron durante 2 hr y se muestran bandas discretas que van desde ~ 30 a 500 kDa. Una estafase observó patrón consistente de aumentar los anchos de banda de peso molecular, cada uno que van ~ 100 kDa. Además, la posterior reanálisis de fracciones nativas a través de SDS-PAGE mostró peso molecular se desplaza de acuerdo con la desnaturalización de los complejos de proteínas. Por lo tanto, CN-GELFrEE se demostró que ofrecer la posibilidad de realizar de alta resolución y alta recuperación de separaciones nativos en los complejos de proteínas de una gama amplia de peso molecular, proporcionando fracciones que son compatibles con los análisis de proteínas aguas abajo.
Introducción
La mayoría de los procesos biológicos que ocurren dentro de una célula se cree que ser llevado a cabo por los conjuntos de proteínas en lugar de proteínas individuales 1. En consecuencia, con el fin de elucidar el papel biológico específico de una subunidad de la proteína en una célula que es necesaria para entender sus interacciones estructurales con otras proteínas o ligandos en los complejos 2. Sin embargo, el estudio de las proteínas de forma nativa, el mantenimiento de sus interacciones y la actividad no covalentes, sigue siendo un reto. Una de las deficiencias de los estudios de proteína nativa es una técnica de separación nativa adecuado que sea compatible con diversas técnicas de análisis de proteínas aguas abajo. Por lo tanto, un interés reciente en las técnicas de separación capaz de caracterizar conjuntos no covalentes de biomoléculas ha aumentado considerablemente 3.
técnicas de separación de proteínas son imprescindibles para la bioquímica, la biofísica y varios otros estudios. técnicas de separación nativos actuales tienen intrinsic deficiencias que reducen la compatibilidad con los análisis posteriores, como la baja resolución, de bajo rendimiento, pérdida de la precipitación, y la exigencia de grandes cantidades de muestra inicial. Purificación por afinidad en tándem se utiliza comúnmente para estudios de interacción de proteínas, pero tiene que ser llevado a cabo por separado para cada proteína diana, provocando que sea incompatible con el análisis de alto rendimiento 4. Cromatografía de exclusión de tamaño 5, precipitación selectiva con cromatografía de afinidad por iones y 5 en gradiente de densidad de separación 6 todos se han proporcionado separaciones nativas, sino que son inherentemente técnicas de baja resolución y requieren altas cantidades iniciales de la muestra.
Alternativamente, las técnicas a base de gel, como el azul nativo (BN) y Clear Native PAGE (CN) (ya sea 1-D o 2-D), muestran la separación de alta resolución. Por otra parte, en contraste con otras técnicas mencionadas, ambas separaciones PAGE nativos mantienen la solubilidad y la conformación nativa de un amplio range de especies de macromoléculas, incluyendo proteínas hidrófobas. Esta capacidad amplía aún más la cobertura proteoma alcanzado por estos métodos 7,8 y se logra a través de diferentes química entre CN y BN-PAGE. NC-PAGE se basa comúnmente en detergentes cargados suave como moléculas portadoras, en sustitución del colorante azul de Coomassie en BN-PAGE. BN-PAGE, aunque asociado con una resolución más alta, tiene advertencias, tales como reducción de la actividad enzimática en las proteínas separadas 8 y la formación de aductos molécula de Coomassie, siendo este último muy perjudicial para MS aguas abajo análisis 9. Ambos métodos, sin embargo, están asociados tradicionalmente con baja recuperación y la cobertura proteoma estrecha debido a las manchas y las limitaciones de extracción de gel 7.
Para el estudio de las proteínas desnaturalizadas, hay varias técnicas que mantienen la solubilidad macromolécula en el desempeño de alta resolución de fraccionamiento con alta recuperación de proteínas y que son compatibles con diVerse técnicas de análisis de proteínas después de la separación. Gel-eluido fracción líquida atrapamiento de electroforesis (GELFrEE) es una de las técnicas de fraccionamiento que se ajustan a todas estas características. Este método se aplica en gran medida en los estudios de alto rendimiento proteómica de arriba hacia abajo, lo que indica que es rápido y versátil. En GELFrEE, las proteínas se desnaturalizan y se separó basan en el peso molecular a través de una matriz de gel tubular, la porosidad de los cuales se puede variar basado en los requisitos de la muestra y los resultados de fraccionamiento deseados. Las fracciones que se eluyen en fase líquida, reduciendo así las limitaciones de recuperación asociados con SDS-PAGE, mientras que se mantiene una alta resolución. Alícuotas de fracciones pueden ser analizados por PAGE 1-D para la selección de ancho de banda de peso molecular 11. Hay una gran demanda de las ventajas asociadas a GELFrEE en técnicas de separación nativas. El método descrito en este documento, Claro nativo GELFrEE (CN-GELFrEE), es una adaptación natural de GELFrEE. Con el fin de ser compatible con una amplia spectrum de macromoléculas en su estado nativo, este método se basa no sólo en la química CN-PAGE suave, pero también en una separación en gradiente de porosidad, lo que reduce la precipitación de proteínas mediante la eliminación de la dura transición entre porosidades presentes en los sistemas de gel discontinuos 9. Cuando se aplica a fraccionar complejos de proteínas extraídas de corazón de ratón, fracciones eluidas muestran alta recuperación y una separación de alta resolución de una amplia gama de pesos moleculares se obtuvo. Además, las fracciones resultantes son compatibles con la mayoría de los análisis de proteínas bioquímicas y biofísicas de aguas abajo.
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Protocolo
Nota: este protocolo de vídeo se basa en una publicación asociada 9. reactivos específicos, materiales y equipos necesarios para llevar a cabo todos los pasos descritos en este protocolo se enumeran en la sección de materiales. Las recetas e información para la preparación de todas las soluciones requeridas se detallan en la Tabla 1.
1. Verter de Gel tubo de gradiente
- Montaje del sistema de reparto
- Utilizando una hoja de afeitar de llama calentado o bisturí, cortar una pipeta serológica de 20 ml a lo largo de una sección ortogonal de 10 cm desde la parte superior de la punta de dispensación. Asegúrese de que la superficie de corte es suave. Mantenga la pieza inferior (con la punta) y desechar la pieza superior. Sujetar la pieza inferior de la pipeta verticalmente (punta cónica hacia abajo) en un soporte de apoyo.
PRECAUCIÓN: No toque el metal cuchilla caliente, utilizar mangos adecuados o una pinza para evitar quemaduras. - Cortar 3 cm de tubo flexible y conectarlo a la pipeta corte por estirarla por encimala punta dispensadora. Conectar la válvula de control de flujo en el otro extremo del tubo.
- Vincular la parte inferior de la válvula a la punta dispensadora del mezclador de gradiente utilizando un trozo de tubo. Mantenga la válvula abierta.
- Para mezclar gradiente en la parte superior de un agitador magnético. Colocar barras magnéticas en el interior de las cámaras de mezcla.
- Coloque la punta dispensadora de la mezcladora gradiente de 5-10 cm más alto que la parte superior de la pieza de pipeta para permitir que el gel se puede verter por gravedad.
- Probar el sistema en busca de fugas con agua desionizada. Si no se encuentran fugas, secar el sistema soplando aire en su interior antes de continuar.
- Cubra la parte superior de la pieza de la pipeta con dos o más capas de cinta. Perforar un agujero a través de las capas de cinta en el centro de la abertura circular. Asegúrese de que la punción es lo suficientemente grande para que el tubo de vidrio herméticamente para pasar a través.
- Deslice el tubo de vidrio, donde será lanzado el gel, a través del agujero perforado, que se extiende la cinta por lo que el vidrio se ajusta con firmeza. yonsert el tubo de vidrio de modo que la parte inferior del tubo es de 2 mm por encima de la parte inferior de la pipeta.
- Compruebe si el tubo de vidrio se lleva a cabo y centralizada y no está en contacto con la pared de la pipeta una vez que el sistema está preparado. El sistema está listo para la fundición.
- Utilizando una hoja de afeitar de llama calentado o bisturí, cortar una pipeta serológica de 20 ml a lo largo de una sección ortogonal de 10 cm desde la parte superior de la punta de dispensación. Asegúrese de que la superficie de corte es suave. Mantenga la pieza inferior (con la punta) y desechar la pieza superior. Sujetar la pieza inferior de la pipeta verticalmente (punta cónica hacia abajo) en un soporte de apoyo.
- Gel de reparto
- Preparar tampón de gel, APS y soluciones de Coomassie (soluciones 1-3, Tabla 1).
- Preparar 12% T (solución 4, Tabla 1) y 1% T (solución 5, Tabla 1) la separación de las soluciones de gel. Añadir 10 l de solución de Coomassie en la solución de separación T gel 12%. Añadir APS y TEMED en ambas soluciones inmediatamente antes de verter en el mezclador de gradiente.
PRECAUCIÓN: poliacrilamida es altamente neurotóxico y los guantes deben ser usados. - Asegúrese de que la válvula de distribución del mezclador de gradiente está cerrado. Agregar el 12% T solución de gel a la cámara de mezcla más alejado de la punta dispensadora de separación. Abra la válvula entre las dos cámaras y dejar que el flujo de la solución ire a la siguiente cámara.
- Cierre la válvula y la pipeta la solución de gel de separación T dislocada 12% de nuevo a la cámara anterior. Esto se hace para evitar burbujas de aire entre las cámaras.
- Añadir el 1% T solución de gel a la cámara de mezcla más cerca de la punta dispensadora de separación. Encienda el agitador magnético.
- válvulas mezcladoras abrir ambos gradiente al mismo tiempo para permitir que las soluciones de gel de separación para ser mezclados y fluyan en el tubo de pipeta y de vidrio.
- Una vez que se agotan las soluciones de gel de separación en el mezclador de gradiente, desacoplar el tubo del mezclador y acoplarlo a una jeringa de 10 ml. Asegúrese de que el extremo del tubo permanece por encima del nivel de líquido en la pipeta hasta que la jeringa se une firmemente.
- Utilice la jeringa para empujar suavemente la solución de gel de separación restante del tubo en el tubo de pipeta y de vidrio. Cierre la válvula de la pipeta antes de permitir que las burbujas de aire en él.
- añadir con cuidado una capa de aproximadamente 0,25 ml de butano saturado de agual (solución 6, Tabla 1) en la parte superior de la solución de gel en el interior del tubo de vidrio para sellar la reacción de polimerización de oxígeno en el aire y para aplanar el menisco superior.
- Limpiar el aparato vierte inmediatamente con agua desionizada (no utilice detergente).
- Espere durante la noche para la polimerización de gel completa a temperatura ambiente.
- Desmontaje tubo de gel de dispositivos y almacenamiento
- Al día siguiente, la cáscara con cuidado la cinta de la parte superior del dispositivo.
- Desconectar la válvula de la tubería bajo la pipeta. Liberar la pipeta de la pinza y realizar los pasos 1.3.3. y 1.3.4. sobre un fregadero.
- Pareja una jeringa de 10 ml llena de agua desionizada al tubo flexible. Empujar el agua a través de la tubería en la pipeta, deslizando lentamente el gel polimerizado de la pipeta.
- Mantener la pipeta en posición horizontal y fije cuidadosamente el gel se deslice fuera del extremo abierto.
- Corte el exceso de poliacrilamida debajo y around el tubo de vidrio usando una cuchilla de afeitar. Asegúrese de crear un extremo liso en el gel dentro del tubo, por lo que es a nivel con la punta del tubo de vidrio.
- Dispensar cualquier butanol restante desde el lado superior del gel y fijar el tubo de gel en un tubo de centrífuga de destapado de 15 ml. Mezclar 0,5 ml de tampón de gel (solución 1, Tabla 1) con 4,5 ml de agua ultra-pura y añadir alrededor de 2 ml de la solución a tanto en el lado superior (dentro del tubo de vidrio) y el lado inferior (en tubo de centrífuga) del tubo de gel.
- Cubra la parte superior completa del tubo de centrífuga, incluyendo la abertura del tubo de vidrio, con parafilm para evitar la evaporación de amortiguamiento. Los geles se pueden almacenar a 4 ° C durante aproximadamente 2 semanas.
Preparación 2. Muestra
- Pesa dos corazones de ratón y picar en una placa de Petri utilizando una hoja de afeitar.
- Añadir el tejido procesado a un mortero y añadir suficiente nitrógeno líquido para cubrir la muestra. Pulverizar el tejido con una mano de mortero, añadiendo másnitrógeno líquido cuando se evapora.
- Una vez que el tejido se muele a fondo, dejar que se evapore de nitrógeno y añadir 1 ml de tampón de lisis (solución 7, Tabla 1) a 4 ° C por cada 100 mg de tejido. Mueva solución en un tubo de centrífuga.
- Centrifugar a 2000 xg durante 5 min a 4 ° C. Recoger cuidadosamente el sobrenadante en un nuevo tubo y desechar el sedimento. Cuantificar la concentración de proteína en el sobrenadante mediante el método del ácido bicinconínico 12, o como se prefiere. Nota: Los lisados celulares nativas o fracciones subcelulares se pueden preparar como se prefiera. CN-GELFrEE es compatible con varios diferentes preparaciones de muestras nativas.
- Preparar la solución tampón de solubilización y la solución de carga (soluciones 8 y 9, Tabla 1).
- Si la muestra es una pastilla, resuspender en 50 a 150 l de tampón de solubilización. Mantenga la muestra en hielo durante 15 min.
- Intercambio de tampón de la muestra se volvió a suspender o el lisado celular con solubilizattampón de ion usando un filtro centrífugo de ultra 30 kDa-MWCO.
- Centrifugar la muestra de proteína a 4 ° C y 10.000 xg durante 5 a 10 min o hasta que el volumen fracción retenida se ha reducido a aproximadamente 20 l. Desechar el flujo continuo.
- Añadir 400 l de tampón de solubilización a la fracción retenida y mezclar mediante pipeteo. Centrifugar a 4 ° C y 10.000 xg durante 5 a 10 min o hasta que la fracción retenida se ha reducido a aproximadamente 20 l. Desechar el flujo continuo.
- Repita el paso 2.9 dos veces más.
- Diluir la muestra filtrada (aproximadamente 20 l) en 100 l de tampón de solubilización.
- Añadir 20 l de solución de carga de probar.
3. Dispositivo CN-GELFrEE
- Para llevar a cabo CN-GELFrEE fraccionamiento, la fabricación de las piezas del dispositivo, haciendo referencia a un taller mecánico. Fabricar las piezas del dispositivo de teflón. Por favor refiérase a la Figura 1 para toda la información necesaria para la fabricación de las piezas y to Tabla 2 para el número de piezas necesarias para un dispositivo.
Consideraciones de seguridad: Usar el equipo de protección personal adecuado. Se debe tener cuidado en torno a las fuentes de alimentación de alta tensión, y todas las uniones se debe montar correctamente. No toque el dispositivo o en cualquier zona húmeda adyacente, mientras que la tensión está en los alrededores y mantener seca el área de banco durante la electroforesis. Por otra parte, la fuente de alimentación debe estar completamente apagado al manipular el dispositivo y / o recolección de fracciones. - Preparar el tampón de ánodo y cátodo (tampón soluciones 10-11, Tabla 1) y mantenerlos a 4 ° C o en hielo.
- Ajuste el extremo superior del tubo de gel (final sin gel) a través de un espaciador, una junta tórica y un segundo separador, en forma de "sandwich".
- Añadir la cámara intermedia (cátodo) después del segundo separador, pasar los tornillos completamente a través de los orificios laterales, añadir y apretar las tuercas a ambos lados. Asegúrese de que el extremo superior de los glass tubo se fija antes de la abertura superior de la cámara de amortiguación, que no están directamente debajo de ella o pasado.
- Montar el extremo inferior del tubo de gel a través de un espaciador, una junta tórica, la cámara de recogida, y un segundo espaciador.
- Añadir la cámara intermedia (ánodo) después del segundo separador, pasar los tornillos completamente a través de los orificios laterales, añadir y apretar las tuercas a ambos lados. Asegúrese de que el extremo inferior del tubo de gel se fija más allá de la abertura superior de la cámara tampón, cerca pero sin tocar la pared posterior.
- Permite configurar el dispositivo NC-GELFrEE verticalmente con la cámara tampón de cátodo hacia arriba con un soporte de apoyo con las abrazaderas.
- Añadir tampón de ánodo a la cámara tampón del ánodo (fondo) y tampón de cátodo a la cámara de tampón de cátodo (parte superior). Mantenga todos los tampones a 4 ° C.
- Eliminar las burbujas de aire desde el interior del tubo de vidrio golpeando suavemente el tubo de cristal y controlar el sistema de fugas.
- Asegúrese de que los electrodos de platino están en contacto con los amortiguadores en las cámaras y que tantoextremos de los tubos de gel se sumergen en la memoria intermedia dentro de cada cámara.
- Conectar los cables de alimentación de la fuente de alimentación a los enchufes de plátano respectivos: negativa en la cámara tampón del cátodo (parte superior) y positiva en la cámara tampón de ánodo (parte inferior).
- Cargar la muestra utilizando una punta de carga de gel a la superficie superior del gel, en el interior del tubo de gel.
- Correr el gel a 1 W constante, para evitar el sobrecalentamiento, hasta que el frente de colorante rojo se encuentra en la parte inferior del tubo de gel.
PRECAUCIÓN: Apague la fuente de alimentación antes de continuar. - Desechar de ánodo y cátodo buffers.
- Aflojar las tuercas de la cámara tampón de ánodo y desmontar el separador inferior y la cámara, el mantenimiento de un espaciador y la junta tórica. Coloque el extremo inferior del tubo de gel dentro de la cámara de recogida, antes de la abertura de la parte superior, no pasado o directamente debajo de ella. Empuje el espaciador y la junta tórica cerca de la cámara de recogida.
- Cortar un trozo de membrana de diálisis de celulosa y rehidratar sumergiéndola en un tampón de ánodo. Cubrir el apaber- entre la cámara de recogida y el espaciador inferior utilizando la membrana de diálisis.
- Montar la cámara tampón de ánodo después del segundo separador, añadir y apretar los tornillos y pernos.
- Coloque el dispositivo en posición horizontal sobre un cubo de hielo. Añadir tampones de ánodo y cátodo frescas a las cámaras de amortiguación y comprobar el sistema de fugas.
- Añadir 150 l de tampón de ánodo en la cámara de recogida. Vuelva a conectar los cables de alimentación a los enchufes de plátano respectivos.
- Encienda la fuente de alimentación a 3 mA de corriente constante. El frente de colorante debe entonces empezar a eluir en la memoria intermedia en la cámara de recogida.
- Cuando se eluye todo el frente de colorante, apague la fuente de alimentación y recoger la primera fracción (0 min) y se la transfiere a un tubo de microcentrífuga de unión baja en proteínas.
- Vuelva a llenar la cámara de recogida con 150 l de tampón de ánodo. Mantenga todas las fracciones recogidas en el hielo.
- Recoger las fracciones después de los siguientes intervalos de tiempo de la colección de laprimera fracción: 2 min, 4 min, 6 min, 8 min, 10 min, 15 min, 20 min, 25 min, 30 min, 45 min y 60 min. No tienen en cuenta el tiempo, mientras que la fuente de alimentación está apagada. No se olvide de apagar la fuente de alimentación antes de recoger las fracciones y para volver a llenar la cámara de recogida con 150 l de tampón de ánodo entre las muestras. Cortar el suministro eléctrico de nuevo después de la recolección para iniciar la elución de la siguiente fracción.
- Prescindir de los tampones de ánodo y cátodo y añadir nuevas soluciones a las cámaras de amortiguación después de 60 minutos. Recoger fracciones en 90 min y 120 min.
- Cambiar de ánodo y cátodo buffers cada hora.
- Ejecutar una clara nativa o una página nativa azul con las fracciones y mancharlo como se prefiera. Siga las instrucciones del fabricante o protocolo preferido.
- Ejecutar una reducción de SDS-PAGE y mancharlo como preferidos. Siga las instrucciones del fabricante o protocolo preferido.
- Limpiar las fracciones GELFrEE y someterse a análisis de espectrometría de masas nativa como se describe previously 9.
Figura 1:. CN-GELFrEE dispositivo (A) del dispositivo GELFrEE piezas de dibujos y (B) fotografía de piezas fabricadas; (C) CN-GELFrEE esquema de conjunto del dispositivo: (1) cámara intermedia, (2) espaciador, (3) O-anillo, (4) Tubo de gel, (5) la cámara de recogida, y (6) de la membrana de diálisis.
Tabla 1: Tabla de soluciones.
Tabla 2: Tabla de las piezas del dispositivo GELFrEE.
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Resultados
200 g de proteínas extraídas de criogénicamente corazones ratón de tierra se fraccionaron de forma nativa en 14 fracciones de 150 ml cada uno, utilizando el método de CN-GELFrEE en un tubo de gel T 1-12%. Una parte alícuota de 10 l de cada fracción se ejecuta en un gel de placa CN-PAGE y teñido con plata. Una clara representación del fraccionamiento y resolución obtenida con el fraccionamiento CN-GELFrEE se muestra en la Figura 2A. Las fracciones se recogieron más de dos...
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Discusión
CN-GELFrEE se deriva del sistema de tampón PAGE nativa claro (CN) que usa una mezcla de detergentes aniónicos y neutros como moléculas portadoras 9 para el fraccionamiento de proteínas basado en el peso molecular a través de una matriz de gel. La aplicación de CN-GELFrEE a un extracto de proteína de corazón de ratón nativo generado fracciones de baja complejidad con anchos de banda discretos, mientras que el mantenimiento de las interacciones no covalentes de los ensamblajes biomoleculares. Comparación de fra...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
El WM Keck Foundation proporcionó generosamente fondos para este trabajo. Este material está basado en trabajo apoyado por una beca de investigación FAPERJ 100.039 / 2014 del gobierno de Río de Janeiro Estado - Brasil por RDM, Ciencia sin Fronteras beca 88888.075416 / 2013-00 de la Coordinación de Perfeccionamiento de Personal de Nivel Superior, bajo el gobierno de Brasil, para el FSS, la Fundación de Ciencias de becas de Postgrado Nacional de investigación con el número 2014171659 beca para OSS, y por una beca de investigación CNPq 202011 / 2012-7 por parte del gobierno de Brasil por LHFDVPCH es un receptor de Química de la vida de una Universidad Northwestern Procesos Instituto Postdoctoral Beca.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| acrilamida al 30%/bis fuerte, 37.5:1 | Bio-Rad | 161-0158 | Esta solución es neurotóxica. |
| Ácido 6-aminohexanoico (ε-ácido aminocaproico) | Sigma-Aldrich | A2504 | Este producto químico es irritante. |
| Persulfato de amonio (APS) | Fisher Scientific | 7727-54-0 | Este producto químico es inflamable, tóxico y corrosivo. |
| Coomassie blue G250 | Bio-Rad | 161-0406 | |
| Dodecilmaltósido | Sigma-Aldrich | D4641 | Este producto químico es irritante. |
| Ácido etilenglicol tetraacético (EGTA) | FLUKA | 3777 | Este producto químico es tóxico. |
| Ácido etilendiamina tetraacético (EDTA) | Fisher Scientific | BP120 | Este producto químico es tóxico. |
| Glicerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| Imidazol | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Nitrógeno líquido | Cualquier proveedor | n/a | Almacene nitrógeno líquido en contenedores diseñados para líquidos a baja temperatura |
| Corazón de ratón | Bioreclamation LLC | MSE-HEART | |
| n-butanol | Fisher Scientific | 71-36-3 | Este producto químico es inflamable y tóxico. |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | BP103 | |
| Cóctel de inhibidores de proteasa | Thermo Fisher Scientific | 78430 | Este producto químico es tóxico. |
| Desoxicolato de sodio | Sigma-Aldrich | 30970 | Este producto químico es irritante. |
| Sacarosa | JTBaker | 4097 | |
| Tetrametiletilendiamina (TEMED) | Bio-Rad | 161-0800 | Este producto químico es inflamable e irritante. |
| Tris-HCl | Amresco | M151 | |
| Trycine | Bio-Rad | 161-071 | |
| Equipment | |||
| Gradiente mezclador | Hoefer | SG15 | |
| Agitación magnética | Cualquier proveedor | n/a | |
| Barras magnéticas | Cualquier proveedor | n/a | Lo suficientemente pequeño como para caber dentro de las cámaras mezcladoras de gradiet. |
| Fuente de alimentación | Bio-Rad | 164-5056 | Tensión hasta 1.500 V |
| Centrífuga refrigerada | Eppendorf | 022622552 | Hasta 15.000 x g |
| Materiales | |||
| 15 ml tubo cónico | Cualquier proveedor | n/a | |
| Filtro ultracentrífugo de 30 kDa-MWCO | Millipore | UFC503096 | |
| Tubo flexible | Saint-Gobain | B000FOV1J0 | Aproximadamente 1 m de longitud |
| Cubitera | Cualquier proveedor | n/a | |
| Líquido/aire Válvula metálica o de plástico. (p. ej. válvula de palanca de control de flujo de aire/agua para acuarios) | Cualquier proveedor | n/a | Las válvulas de acuario son compatibles. |
| Mortero y maja | Cualquier proveedor | n/a | |
| Nativo PÁGINA 3-12% T slab gel | Invitrogen | BN1003 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Placa de Petri | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Tubo de baja unión de proteínas 1.5 ml | Eppendorf | 022431081 | |
| Cuchilla de afeitar | IDL Tools | TE05-091C | |
| Tubo de diálisis de celulosa regenerada 3.500 MWCO | Fisher Scientific | 21-152-9 | |
| SDS-PAGE gel de losa para cualquier kDa | Bio-Rad | 456-9036 | |
| Pipetas serológicas (25 ml) | VWR | 89130-900 | |
| Jeringa (10 ml) | Cualquier proveedor | n/a |
Referencias
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- Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (8), 645-654 (2007).
- Gavin, A. C., Bösche, M., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
- Puig, O., Caspary, F., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
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