CN-GELFrEE - eluida-gel transparente nativo fracción líquida atrapamiento de electroforesis

Rafael D. Melani; Henrique S. Seckler; Owen S. Skinner; Luis H. F. Do Vale; Adam D. Catherman; Pierre C. Havugimana; Marcelo Valle de Sousa; Gilberto B. Domont; Neil L. Kelleher; Philip D. Compton

doi:10.3791/53597

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Artículo de método

CN-GELFrEE - eluida-gel transparente nativo fracción líquida atrapamiento de electroforesis

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DOI:

10.3791/53597

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29 de febrero de 2016

Rafael D. Melani^*¹^,² , Henrique S. Seckler^*¹ , Owen S. Skinner¹ , Luis H. F. Do Vale¹^,³ , Adam D. Catherman¹ , Pierre C. Havugimana¹ , Marcelo Valle de Sousa³ , Gilberto B. Domont² , Neil L. Kelleher¹ , Philip D. Compton¹

¹Departments of Chemistry and Molecular Biosciences, Chemistry of Life Processes Institute, Proteomics Center of Excellence, Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center, Northwestern University, ²Institute of Chemistry, Proteomics Unit, Federal University of Rio de Janeiro, ³Department of Cell Biology, Brazilian Center for Protein Research, Laboratory of Biochemistry and Protein Chemistry, University of Brasilia

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe cómo preparar y realizar la electroforesis de atrapamiento de fracción líquida clara nativa eluida en gel (CN-GELFrEE), una técnica de separación nativa para ensamblajes biomoleculares no covalentes y proteínas de muestras heterogéneas que es compatible con varias técnicas de análisis de proteínas posteriores.

Resumen

complejos de proteínas desempeñan una serie de funciones celulares esenciales. Elucidar sus interacciones no covalentes y dinámicas es de suma importancia para la comprensión del papel de los complejos en los sistemas biológicos. Mientras que la caracterización directa de conjuntos biomoleculares se ha convertido cada vez más importante en los últimos años, las técnicas de fraccionamiento nativos que son compatibles con técnicas de análisis de aguas abajo, incluyendo la espectrometría de masas, son necesarias para ampliar aún más estos estudios. Sin embargo, el campo carece de una, de amplio rango, método de separación de alta recuperación de alto rendimiento para ensamblajes de proteína nativa. A continuación, presentamos clara fracción líquida de gel eluida electroforesis nativa atrapamiento (CN-GELFrEE), que es una modalidad novedosa para la separación de proteínas asambleas no covalentes. rendimiento de separación CN-GELFrEE fue demostrado por los complejos de fraccionamiento extraídos del corazón de ratón. Las fracciones se recogieron durante 2 hr y se muestran bandas discretas que van desde ~ 30 a 500 kDa. Una estafase observó patrón consistente de aumentar los anchos de banda de peso molecular, cada uno que van ~ 100 kDa. Además, la posterior reanálisis de fracciones nativas a través de SDS-PAGE mostró peso molecular se desplaza de acuerdo con la desnaturalización de los complejos de proteínas. Por lo tanto, CN-GELFrEE se demostró que ofrecer la posibilidad de realizar de alta resolución y alta recuperación de separaciones nativos en los complejos de proteínas de una gama amplia de peso molecular, proporcionando fracciones que son compatibles con los análisis de proteínas aguas abajo.

Introducción

La mayoría de los procesos biológicos que ocurren dentro de una célula se cree que ser llevado a cabo por los conjuntos de proteínas en lugar de proteínas individuales ^1. En consecuencia, con el fin de elucidar el papel biológico específico de una subunidad de la proteína en una célula que es necesaria para entender sus interacciones estructurales con otras proteínas o ligandos en los complejos ^2. Sin embargo, el estudio de las proteínas de forma nativa, el mantenimiento de sus interacciones y la actividad no covalentes, sigue siendo un reto. Una de las deficiencias de los estudios de proteína nativa es una técnica de separación nativa adecuado ....