Un ensayo de PCR digital de dos vías para la cuantificación simultánea de la<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; Y el marcador asociado HF183-fecal humana en las aguas

Resumen

Este manuscrito describe un ensayo de teléfono digital de dos PCR que se puede utilizar para cuantificar simultáneamente Enterococcus spp. Y los marcadores genéticos HF183 como indicadores de contaminación fecal general y asociada a humanos en aguas de recreo.

Resumen

Este manuscrito describe un ensayo de PCR duplex digitales (EntHF183 dPCR) para la cuantificación simultánea de Enterococcus spp. Y el marcador HF183-fecal asociada humano. El EntHF183 dúplex dPCR (denominado en adelante como EntHF183 dPCR) ensayo utiliza las mismas secuencias de cebadores y sondas como sus homólogos individuales publicados por PCR cuantitativa (qPCR). Del mismo modo, las mismas de filtración de agua y extracción de ADN procedimientos que se realiza antes de la qPCR se siguen antes de ejecutar dPCR. Sin embargo, el ensayo dPCR duplex tiene varias ventajas sobre los ensayos de qPCR. Lo más importante, el ensayo dPCR elimina la necesidad para el funcionamiento de una curva estándar y, por tanto, el sesgo y la variabilidad asociada, mediante la cuantificación directa de sus objetivos. Además, mientras que a doble cara (es decir, la cuantificación simultánea) Enterococcus y HF183 en qPCR a menudo conduce a una subestimación grave del objetivo menos abundantes en una muestra, dPCR proporciona cuantificación coherente de ambos objetivos, amolasu cuantificó individualmente o simultáneamente en la misma reacción. El ensayo dPCR también es capaz de tolerar concentraciones de inhibidor de PCR que son de uno a dos órdenes de magnitud mayores que las toleradas por qPCR. Estas ventajas hacen que el ensayo EntHF183 dPCR particularmente atractivo, ya que al mismo tiempo proporciona información precisa y repetible en tanto la contaminación fecal general y asociada humano en aguas ambientales sin la necesidad de ejecutar dos ensayos de qPCR separadas. A pesar de sus ventajas sobre qPCR, el límite de cuantificación superior del ensayo dPCR con instrumentación disponible actualmente es de aproximadamente cuatro órdenes de magnitud más baja que la que puede conseguirse por qPCR. En consecuencia, se necesita dilución para la medición de altas concentraciones de organismos diana tales como los observados típicamente siguiente derrames de aguas residuales.

Introducción

Los métodos cuantitativos de PCR (qPCR) han sido ampliamente utilizados para el seguimiento de recreo calidad del agua y aplicaciones de seguimiento de fuente microbiana porque son más rápidos, más flexible y específica en comparación con los métodos tradicionales basadas en el cultivo. En consecuencia, la qPCR se recomienda para lograr rápidos resultados de monitoreo de aguas fecales para los indicadores generales, tales como Enterococcus spp., En los criterios de calidad del agua recreativa USEPA ¹ revisado. Muchos ensayos de qPCR también se han desarrollado y validado para la identificación de las fuentes de contaminación fecal en las aguas amb....

Protocolo

1. Ensayo de la preparación de mezclas

1. Hacer concentraciones de 100 mmol / L de existencias para todos los cebadores en el agua de grado molecular y sondas en TE pH 8. [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ ^12; HF183-1, BthetR1, BthetP1 ^3].
   Nota: Las sondas para los dos objetivos se marcaron con fluorescencia diferentes fluoróforos ^7, como se indica en la Lista de Materiales / Equipos.
2. Preparar la mezcla maestra mezclando, por reacción planificada, 12 l digital de mezcla de PCR (2x madre, véase Lista de Materiales / Equipos), 0.216 l cada uno hacia adelante y el cebador, 0,06 l cada una sonda fluorescente inversa....

Resultados

Un buen centro EntHF183 duplex dPCR debe dar lugar a relativamente alto número de gotitas aceptados (ca. 10,000-17,000) y diferencia relativamente grande (ca. 5000) entre los valores de fluorescencia para las gotitas de negativos y positivos ^7. Inusualmente bajo número de gotitas probablemente indica problemas en el proceso de generación de las gotas, y un punto de corte de 10.000 gotitas se sugiere a partir de datos empíricos del sistema dPCR gotita utilizad.......

Discusión

Hay unos pocos pasos críticos en el protocolo. En primer lugar, la mezcla de las mezclas de ensayo puede ser difícil porque la mezcla maestra es más viscoso que las mezclas convencionales maestros qPCR. agitación simple puede conducir a una mezcla insuficiente, que a su vez conduce a una distribución no uniforme de moldes de ADN en las mezclas de ensayo y, posteriormente, en las gotitas. La técnica de mezcla por pipeteado se describe en el protocolo se debe seguir para asegurar la cuantificación precisa dPCR. En segundo.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Microtubos de baja unión	Costar	3207	Para el almacenamiento de reactivos, muestras/producción de mezclas maestras
Agua sin nucleasas	FisherSci	BP2484-50
Tampón TE pH 8	FisherSci	BP2473-100
Hardshell Placa de 96 pocillos	BioRad	HSP-9601	Para la mezcla maestra inicial y la inoculación de muestras
Película	de sellado de aluminioBioRad	359-0133	Para sellar la placa de muestra
Generador de gotas	BioRad	186-3002
Generación de gotas Aceite	BioRad	186-3005
Cartucho	BioRad	186-4008
DG8 Soporte de cartucho	BioRad	186-3051
Junta	BioRad	186-3009
20 μ l puntas de pipeta	Rainin	GP-L10F	para tansferring de muestra/mezcla maestra a cartidge
200 μ l puntas de pipeta	Rainin	GP-L200F	Para transferir las gotas a la placa Twin.Tec
Placa Twin.Tec de 96 pocillos	Eppendorf	951020320	Para el ciclo térmico y la lectura de las gotas finales
Lámina de sellado térmico perforable	BioRad	181-4040	Para sellar la placa Twin.Tec antes del ciclo térmico
Selladora de placas PX1 PCR	BioRad	181-4000
CFX96 Termociclador	BioRad	CFX96 y C1000	Solo se necesita el termociclador, sin óptica
QX100 Lector de gotas	BioRad	186-3001
Aceite Lector de gotas	BioRad	186-3004
Gota PCR Supermix	BioRad	186-3024	i.e. la mezcla de PCR digital en el software
QuantaSoft manuscrito (v1.3.2)	Quantasoft	QX100	Para visualizar, analizar y exportar datos de ddPCR
Entero Forward Primer (Ent F1A)	Operon	GAGAAATTCCAAACGAACTTG	Se puede utilizar un proveedor alternativo
Entero Reverse Primer (Ent R1)	Operon	CAGTGCTCTACCTCCATCATT	Se puede utilizar un proveedor alternativo
Entero Probe (GPL813TQ)	Operon	[6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1]	Se puede utilizar un proveedor alternativo, pero el floróforo tiene que ser FAM
HF183 Forward Primer ( HF183-1)	Operón	ATCATGAGTTCACATGTCCG	Se puede utilizar un proveedor alternativo
HF183 Cebador inverso (BthetR1)	Operón	CGTAGGAGTTTGGACCGTGTGT	Se puede utilizar un proveedor alternativo
Sonda HF183 (BthetP1)	Operón	[6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1]	Se puede utilizar un proveedor alternativo, pero el floróforo tiene que ser HEX (si se utiliza VIC, se debe elegir la compensación matricial adecuada.
Control positivo			Mezcla de ADN genómico E. faecalis y plásmido estándar HF183 (pedido de IDT). Para conocer los métodos detallados de cultivo de E. faecalis y las secuencias del plásmido HF183 ordenado, véase Cao et al. 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008). Los estándares de ADN Enterococcus disponibles comercialmente (ATCC 29212Q-FZ) también se pueden utilizar en el control positivo en lugar del ADN genómico preparado en laboratorio E. faecalis.

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