La exposición a teratógenos puede causar defectos de nacimiento. El pez cebra son útiles para determinar el potencial teratogénico de productos químicos. Se demuestra la utilidad de pez cebra mediante la exposición de los embriones a diferentes niveles de nitrito y también en diferentes momentos de exposición. Se demuestra que el nitrito puede ser tóxico y causar graves defectos de desarrollo.
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Artículo de método
El pez cebra como modelo para evaluar el potencial teratogénico de nitrito
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Resumen
Resumen
Los altos niveles de nitrato en el medio ambiente pueden causar defectos congénitos o abortos involuntarios en los seres humanos. Presumiblemente, esto es debido a la conversión de nitrato a nitrito por las bacterias intestinales y salivales. Sin embargo, en otros estudios de mamíferos, los altos niveles de nitrito no causan defectos de nacimiento, aunque pueden conducir a resultados reproductivos pobres. Por lo tanto, el potencial teratogénico de nitrito no está claro. Sería útil disponer de un sistema modelo de vertebrados para evaluar fácilmente efectos teratogénicos de nitrito o cualquier otro producto químico de interés. Aquí, se demuestra la utilidad de pez cebra (Danio rerio) para detectar compuestos de toxicidad y defectos embrionarios. embriones de pez cebra son fertilizados externamente y tienen un desarrollo rápido, por lo que un buen modelo para los estudios teratogénicos. Se demuestra que el aumento del tiempo de exposición a nitrito afecta negativamente a la supervivencia. El aumento de la concentración de nitrito también afecta negativamente a la supervivencia, mientras que el nitrato no lo hace. Para tha embrionest sobrevivir a la exposición nitrito, varios defectos pueden ocurrir, incluyendo pericárdico y la yema de un edema salida, nadar noninflation vejiga, y la malformación craneofacial. Nuestros resultados indican que el pez cebra es un sistema conveniente para estudiar el potencial teratogénico de nitrito. Este enfoque puede ser fácilmente adaptado para probar otros productos químicos por sus efectos sobre el desarrollo de vertebrados temprano.
Introducción
Teratogénesis es un proceso que altera el desarrollo normal de un embrión o feto, causando anomalías estructurales y funcionales permanentes, retraso del crecimiento, o aborto involuntario en casos graves 1. Puede ser causada por ciertos agentes naturales (teratógenos), que interfieren con el desarrollo embrionario de múltiples maneras 2. Durante el desarrollo fetal humano, se han reportado teratógenos común, tales como la radiación, agentes infecciosos, metales tóxicos y productos químicos orgánicos para causar defectos en los pliegues epicánticos (el pliegue de piel en el párpado superior) y clinodactilia (dedo curvado o en el pie) a través de los errores morfogenéticos 1.
La comprensión del mecanismo molecular de teratogénesis es el primer paso hacia el desarrollo de tratamiento y prevención. Varios modelos de vertebrados tales como la rana de uñas africana (Xenopus laevis) y el pez cebra (Danio rerio) se han utilizado para determinar las vías moleculares afectadas por teratOgens. Estudios anteriores han utilizado el pez cebra como modelo para la epidemiología, toxicología y teratogénesis 3-7. Scholz et al. considerado el pez cebra como un "estándar de oro" para la evaluación de la toxicidad ambiental. Esto se debe, en parte, a la transparencia del embrión de pez cebra, que permite a los investigadores visualizar el defecto de desarrollo, ya que se produce 8. Aproximadamente el 70% de los genes humanos tienen ortólogos en el pez cebra, por lo que el pez cebra un modelo vertebrado deseable para el estudio de los defectos humanos 9.
Algunos estudios epidemiológicos han sugerido que el nitrato y el nitrito, comúnmente presentes en los alimentos agrícolas y agua, están asociados con defectos de nacimiento y abortos espontáneos 10,11, mientras que otros estudios no apoyan esta asociación 12. El nitrato (NO 3 -) y nitrito (NO 2 -) están presentes de forma natural en el suelo y el agua. Ellos son una fuente de nitrógeno para las plantas y son una parte de la nciclo itrogen 13. Los alimentos como las judías verdes, zanahorias, calabaza, espinaca, remolacha y de las granjas que utilizan fertilizantes con alto contenido de nitrato han aumentado significativamente los niveles de nitrato y nitrito 7. La leche de vacas alimentadas con alimentos altos de nitratos y peces en agua de alta nitrato (principalmente de la salida del suelo 30) puede conducir a los seres humanos que consumen grandes cantidades de nitratos y nitritos 14. El nitrato y el nitrito también se utilizan comúnmente en la conservación de alimentos, lo que aumenta drásticamente la cantidad ingerida por los seres humanos 12.
Los niveles óptimos de nitrato y nitrito desempeñan papeles fundamentales en los procesos fisiológicos como la homeostasis vascular y la función, la neurotransmisión y los mecanismos de defensa del huésped inmunológicos 13-15. Sin embargo, la exposición a altos niveles de nitrato y nitrito puede dar lugar a efectos adversos, especialmente en lactantes y niños de 16. nitrato ingerido se convierte después en nitrito en la cavidad oral por la microflora y en THe tracto gastrointestinal por la microflora intestinal 17.
El nitrato pone bebés en un alto riesgo para el síndrome del bebé azul por la oxidación de la hemoglobina en metahemoglobina, deteriorando la hemoglobina de su capacidad de oxígeno 18 que lleva. Esto da como resultado el color azul de la piel que se extiende a los tejidos periféricos en los casos más graves. La oxigenación de los tejidos inhibido resultados en otros síntomas, más severa que conduce a coma y muerte 19,20. Síntomas similares se observan en los bebés y adultos en concentraciones más altas de nitrato de 21. Los niveles elevados de metahemoglobina en los adultos debido a los resultados de intoxicación de nitritos en la cianosis, dolor de cabeza, trastornos de la respiración 31, y la muerte si no se trata, debido a complicaciones relacionadas con la hipoxia tejido vital 32,33.
El nitrato ingerido en los niveles superiores también puede resultar en diversas complicaciones de salud. La diabetes infantil, la diarrea recurrente, e infecciones recurrentes del tracto respiratorioen los niños se han relacionado con una alta ingesta de nitrato de 11,17,22. La exposición crónica a un alto nivel de nitrato se asocia con la micción y la hemorragia del bazo. La exposición a altas dosis aguda de nitratos puede conducir a una amplia gama de condiciones médicas como dolor abdominal, debilidad muscular, sangre en las heces y la orina, desmayos, y la muerte 11. La exposición prenatal a nitrato en niveles altos se ha asociado con defectos del tubo neural y músculo-esquelético 11.
Un informe reciente mostró que el tratamiento con nitrito de embriones de pez cebra condujo a la yema edema salida, malformaciones craneofaciales y axial, y nadar noninflation vejiga 5. En este estudio, se demuestra un método para el tratamiento de embriones de pez cebra con nitrato y nitrito para determinar su potencial teratogénico. Los embriones fueron expuestos a nitrito a diferentes concentraciones y diferentes periodos de tiempo. El etanol se utiliza como un control positivo, ya que es un teratógeno establecido 23. Our método mostró que ambas altas concentraciones y tiempos de exposición largos a nitrito eran perjudiciales para la supervivencia y dieron lugar a diversos fenotipos, que van desde leve (edema) a graves defectos de desarrollo (brutos). Por lo tanto, el pez cebra es un modelo útil para explorar directamente los posibles efectos teratogénicos de nitrato y nitrito en embriones para complementar estudios epidemiológicos.
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Protocolo
Los procedimientos descritos en este protocolo fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Indiana de Pennsylvania.
1. Los embriones Cosecha
- Mantener el pez cebra a 28,5 ° C, pH 7, conductividad entre 500-1.500 mS, y un ciclo luz / oscuridad de 14 horas de luz y 10 horas de oscuridad 24. Utilizar cepas de tipo silvestre, como tu, AB o híbrido TU / AB. Las diferentes cepas pueden responder de manera diferente al tratamiento químico 25.
- Configurar el pescado para el apareamiento la noche antes de la recolección de huevos mediante la adición de agua del sistema de peces en un tanque de apareamiento. Añada peces machos y hembras en el tanque y separar los dos peces con un divisor. Cada par de pescado producirá una gama de 50-300 huevos. Para asegurarse de que se produzca una suficientes huevos, configurar 30 pares de peces. Por lo general, alrededor del 50% de los pares de pescado a la edad de apareamiento primer (6-9 meses de edad) va a producir huevos, lo que resulta hasta 200 huevos por pares y un máximo de hasta 3, 000 huevos para este experimento.
- A la mañana siguiente, después de la luz se enciende, retire el divisor para iniciar el apareamiento. Compruebe los tanques de apareamiento para los huevos cada 15 minutos.
- Una vez que los peces ponen huevos, cosechar todos los embriones utilizando un colador de té y combinarlos en un gran contenedor con tampón E3 (NaCl 5 mM, KCl 0,17 mM, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM de MgSO4). A 1,5 HPF, retirar y desechar los huevos no fertilizados con una pipeta de plástico bajo un microscopio de disección. Huevos no fecundados son opacos mientras que los huevos fertilizados son transparentes 34.
- Transferencia de 50 embriones en una placa de 100 x 15 mm de Petri de vidrio que contiene 50 ml de tampón de E3 para cada condición de tratamiento. Se necesita un total de 33 platos para 11 condiciones de tratamiento y 3 repeticiones.
2. El tratamiento de los embriones
- Realizar los tratamientos en 2 horas después de la fecundación (HPF) 35. Incubar los embriones / larvas a 28,5 ° C y examinar las larvas a 120 HPF. Realizar por lo least tres réplicas de cada condición de tratamiento para el análisis estadístico.
- Para 3 placas de Petri (cada uno con 50 embriones) en 2 hpf, eliminar el tampón E3 con una pipeta de transferencia y añadir 50 ml de etanol 300 mM diluido en tampón de E3. Cubrir las placas de Petri con Parafilm para minimizar la evaporación de etanol.
- Continuar la exposición de los embriones al etanol durante 22 horas. A continuación, eliminar el etanol con una pipeta de transferencia. Añadir 50 ml de tampón E3 y agitar el plato varias veces para lavar el etanol. Eliminar este tampón E3 con una pipeta de transferencia y repetir la etapa de lavado 2 veces más.
- Por 3 placas de Petri (cada uno con 50 embriones) en 2 HPF, eliminar el tampón E3 con una pipeta de transferencia y añadir 50 ml de tampón nuevo E3.
- Para 9 placas de Petri (cada uno con 50 embriones) en 2 hpf, eliminar el tampón E3 con una pipeta de transferencia y añadir 50 ml de nitrito de sodio 1,000 mg / L disuelto en tampón E3. Confirmar la concentración de la solución madre de nitrito de antemano utilizando unamodificación de la diazotación (método USEPA 354.1) 28 método espectrofotométrico.
- Continuará exponiendo 3 platos por 46 horas, 3 platos por 70 horas y 3 platos para 94 hr. Vuelva a colocar la solución de nitrito con una solución de nitrito de recién hecho todos los días.
- Después de cada tiempo de exposición, retire el nitrito con una pipeta de transferencia. Añadir 50 ml de tampón E3 y agitar el plato varias veces para lavar el nitrito. Eliminar este tampón E3 con una pipeta de transferencia y repetir la etapa de lavado 2 veces más.
- Para 3 placas de Petri (cada uno con 50 embriones) en 2 hpf, eliminar el tampón E3 con una pipeta de transferencia y añadir 50 ml de nitrito de sodio 200 mg / L. Repetir esto con 400, 600, 800, y 1000 mg / L de nitrito de sodio.
- Continuar la exposición de los embriones a nitrito por 70 horas. Vuelva a colocar la solución de nitrito con una solución de nitrito de recién hecho todos los días.
- Después del tiempo de exposición, retire el nitrito con una pipeta de transferencia. Añadir 50 ml de tampón E3 y agitar el plato variasveces para lavar el nitrito. Eliminar este tampón E3 con una pipeta de transferencia y repetir la etapa de lavado 2 veces más.
- Para 3 placas de Petri (cada uno con 50 embriones) en 2 hpf, eliminar el tampón E3 con una pipeta de transferencia y añadir 50 ml de nitrato de sodio 1,000 mg / L disuelto en tampón E3. Confirmar la concentración de la solución madre de nitrato de antemano utilizando una modificación de la reducción de cadmio (USEPA Método 353.3) método espectrofotométrico 28.
- Continuar la exposición de los embriones de nitrato de 70 hr. Vuelva a colocar la solución de nitrato de solución de nitrato de recién hecho todos los días.
- Después del tiempo de exposición, retire el nitrato con una pipeta de transferencia. Añadir 50 ml de tampón E3 y agitar el plato varias veces para lavar el nitrato. Eliminar este tampón E3 con una pipeta de transferencia y repetir la etapa de lavado 2 veces más.
- Durante cada día de la exposición, contar el número de embriones / larvas muertas usando un microscopio estereoscópico. Los signos de la muerteincluir la falta de ritmo cardíaco y la circulación de la sangre, o la falta de motilidad después de 1 minuto de observación. Retire embriones / larvas muertas con una pipeta de transferencia para reducir la contaminación del tampón E3.
- Cuando terminan los experimentos a 120 HPF, la eutanasia a las larvas.
- Eliminar el tampón E3 con una pipeta de transferencia. A continuación, añadir 50 ml de 0,2% de MS-222 (tamponada a pH 7) y esperar 10 minutos.
- Retire el MS-222 con una pipeta de transferencia. Añadir 50 ml de tampón E3 y agitar para lavar el MS-222.
- Eliminar el tampón de E3 con una pipeta de transferencia y añadir 20 ml de 4% de paraformaldehído (PFA) para fijar las larvas. Hacer remolinos en el plato varias veces. Usar una pipeta de transferencia para transferir las larvas en un vial de vidrio a lo largo con suficiente PFA para llenar el vial. Almacenar los viales en el refrigerador durante la noche (O / N).
- Tome fotos de larvas fija utilizando un estereoscopio con una cámara digital. Utilice un aumento de 30x, ISO 200, y 200 ms tiempo de exposición. Orientar las larvas de manera que el anterior a la left y el dorsal es a la parte superior del campo.
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Resultados
La exposición a etanol 300 mM durante 22 h no tenía ningún efecto sobre la supervivencia (datos no mostrados), consistente con informes anteriores 5,23,26. Esto se esperaba, ya que el etanol es un teratógeno conocido y sirvió como un control positivo. Fenotipos observados se incluyen edema pericárdico, noninflation vejiga natatoria (Figura 1), defectos craneofaciales, y retraso en el desarrollo (datos no mostrados).
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Discusión
El método aquí descrito demuestra la utilidad de pez cebra para evaluar el potencial teratogénico de nitrito y nitrato. En comparación con otros vertebrados, el pez cebra tiene ventajas que incluyen alta fecundidad, la fertilización externa, transparencia óptica, y un rápido desarrollo. Mutantes disponibles que carecen de pigmentación (por ejemplo, el pez cebra Casper 36) también ayudan a mejorar la visibilidad de los órganos internos. También es fácil de generar pez cebra transgénico con genes informadores p...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
VK fue financiado por subvenciones del Departamento de Biología de IUP y la Escuela de Estudios de Posgrado e Investigación (Desarrollo Profesional de Estudiantes de Posgrado). El CQD y el TWS contaron con el apoyo de la Escuela de Estudios de Posgrado e Investigación de IUP (Costos de publicación del profesorado/Gastos de investigación incidentales). También agradecemos a los miembros del laboratorio Diep por el mantenimiento de las instalaciones de pez cebra.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| DREL/2010 instrumento | Hach | 26700-03 | |
| Etanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Placa de Petri de vidrio KIMAX | VWR | 89001-244 | |
| MS-222 | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| NitraVer 5 Reactivo de nitrato | Hach | 14034-46 | |
| NitriVer 3 Reactivo de nitrito | Hach | 14065-99 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 3-374-10 | |
| Paraformaldehído | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| S6E Microscopio estereoscópico | Leica | 10446294 | |
| Nitrato de sodio | Fisher Scientific | S343 | |
| Nitrito de sodio | Fisher Scientific | S347 | |
| Pipetas de transferencia | Laboratorio Productos Venta | L320072 | |
| Viales de vidrio | Fisher Scientific | 03-338B |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
