Aislamiento y caracterización de ratón antral Los ovocitos Sobre la base de organización de la cromatina nucleolar

Resumen

Aquí se presenta un protocolo para la caracterización de los ovocitos antrales ratón sobre la base de la organización nucleolar.

Resumen

Este protocolo describe un método simple y rápido para aislar y caracterizar ovocitos de GV (Vesícula Germinal) antrales de ratón como capaces (SN, Nucleolo Rodeado) o incapaces (NSN, Nucléolo No Rodeado) de desarrollarse hasta la etapa de blastocisto después de la maduración in vitro (IVM) y la fertilización in vitro (FIV). Hace uso de Hoeschst33342 (o cualquier otro colorante intercalante de ADN) capaz de unirse a la heterocromatina del nucléolo mostrando un anillo en los ovocitos SN o no, como en los ovocitos NSN. Esto representa la forma más fácil y rápida de clasificar ambos ovocitos antrales que eventualmente se pueden usar para procedimientos de IVM o FIV.

Brevemente, el protocolo consta de los siguientes pasos: inyección de hormonas para estimular el crecimiento folicular; aislamiento de los ovocitos en la etapa GV del compartimento antral mediante la punción del ovario con una aguja estéril; preparación de pipetas de vidrio delgadas para el pipeteo bucal de los ovocitos; clasificación de los ovocitos con Hoechst33342 preparado a una concentración supravital; IVM, FIV o cualquier otro análisis molecular/celular.

Desafortunadamente, todavía hay pocas evidencias para clasificar los ovocitos SN y NSN utilizando técnicas menos invasivas. Una vez identificadas, podrían aplicarse potencialmente a las tecnologías de reproducción asistida humana, aunque con varios aspectos que deberían modificarse. Hasta la fecha, esta técnica tiene implicaciones potenciales para aumentar drásticamente los procedimientos exitosos de IVM y FIV tanto en especies en peligro de extinción como en especies con interés económico.

Introducción

Antrales ovocitos completamente crecidos (GV, vesícula germinal) aislados del compartimento antral del ovario se utilizan de forma rutinaria para diferentes propósitos, tales como, por ejemplo, el estudio de los mecanismos moleculares y celulares detrás de la maduración in vitro hasta la etapa metafase II.

A pesar de sus hermosos apariencia ovocitos más antrales, pero no todos, son capaces de completar la meiosis y llegar a la etapa de blastocisto; de hecho, en muchas especies de mamíferos, incluyendo seres humanos ^1,2, aproximadamente 30% de ellos detener su desarrollo en la etapa de 2 células, si se produce la fertilización <....

Protocolo

Este protocolo se lleva a cabo de conformidad con los principios rectores de la Europea (UE) 63/2010 y 26/2014 (italianos) leyes que protegen a los animales utilizados para la investigación científica. La eutanasia Dislocación cervical se utiliza para ovarios aislamiento y es realizado por expertos y personas que figuran en el protocolo aprobado abarca este estudio entrenado.

1. Los animales

1. Mantener adultos de 3 a ratones hembra de 6 semanas de edad, en una habitación con temperatura y humedad controladas (con fases de 12L: 12D y alimentados ad libitum).
2. Inyectar ratones por vía intraperitoneal con 2,5 UI de gonadotropina de sue....

Resultados

Las siguientes imágenes muestran el método utilizado para aislar los ovocitos de los ovarios de ratones antrales, a partir de la preparación de las pipetas para la clasificación de los ovocitos 'mediante Hoechst33342. Este método es bastante sencillo y se puede realizar en cualquier laboratorio equipado con una incubadora de CO _2, un estereomicroscopio y un microscopio de fluorescencia equipado con el filtro correcto para la observación de la Hoechst33342 Figura 1<.......

Discusión

Este protocolo describe el método usado para aislar y clasificar antrales ratón ovocitos GV. No hay pasos críticos particulares a subrayar, con pocas excepciones. En primer lugar: este procedimiento debe realizarse lo más rápidamente posible para: a) mantener la vitalidad de los ovocitos y b) evitar los cambios de pH en el medio utilizado. Segunda: los ovocitos deben ser brevemente excitado (5-10 seg) para Hoechst33342 para evitar daños de la cromatina y la posterior muerte de los ovocitos, especialmente si IVM y la FIV.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
PMSG	Sigma	G4527
EmbrioMax M2	Millipore	MR-015-PD
Hoechst33342	Thermo Scientific	62249
Aceite Mineral	Sigma	M8410
Plato de Cultivo Celular 35mmx10mm	Corning	430165
µ-Plato 35mm, fondo de vidrio alto	Ibidi	81158
Pipeta Pasteur Borosilicato	Corning	7095D-9
Conjuntos de tubos de aspiración para pipetas micropilares calibradas	Sigma	A5177