-DamID siguientes: Genoma de toda la cartografía de la proteína-ADN Interacciones de alto rendimiento de secuenciación de fragmentos de ADN adenina-metilado

Resumen

Se describe en este documento un ensayo mediante el acoplamiento de identificación de ADN metiltransferasa adenina (DamID) a alto rendimiento de secuenciación (DamID-ss). Este método mejorado proporciona una mayor resolución y un rango dinámico más amplio, y permite el análisis de datos DamID-Seq en conjunción con otros datos de secuenciación de alto rendimiento tales como chip-ss, RNA-Seq, etc.

Resumen

El ensayo de identificación de ADN adenina metiltransferasa (DamID) es un método poderoso para detectar interacciones proteína-ADN tanto a nivel local como en todo el genoma. Es un enfoque alternativo a la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP). Una proteína de fusión expresada que consiste en la proteína de interés y la adenina metiltransferasa del ADN de E. coli puede metilar la base de adenina en motivos GATC cerca de los sitios de interacciones proteína-ADN. Los fragmentos de ADN metilados con adenina pueden amplificarse y detectarse específicamente. El ensayo DamID original detecta las ubicaciones genómicas de los fragmentos de ADN metilados mediante hibridación a micromatrices de ADN, que está limitada por la disponibilidad de micromatrices y la densidad de sondas predeterminadas. En este artículo, informamos sobre el protocolo detallado de integración de la secuenciación de ADN de alto rendimiento en DamID (DamID-seq). El gran número de lecturas cortas generadas a partir de DamID-seq permite detectar y localizar las interacciones proteína-ADN en todo el genoma con alta precisión y sensibilidad. Hemos utilizado el ensayo DamID-seq para estudiar las interacciones genoma-lámina nuclear (NL) en células de mamíferos, y hemos observado que DamID-seq proporciona una alta resolución y un amplio rango dinámico en la detección de interacciones genoma-NL. El enfoque DamID-seq permite sondear las asociaciones NL dentro de las estructuras génicas y comparar los mapas de interacción genoma-NL con otros datos genómicos funcionales, como ChIP-seq y RNA-seq.

Introducción

ADN metiltransferasa identificación adenina (DamID) ^1,2 es un método para detectar la proteína-DNA in vivo y es un enfoque alternativo a la cromatina immunoprecipitation (CHIP) ^3. Se utiliza una cantidad relativamente baja de células y no requiere la reticulación química de la proteína con el ADN o un anticuerpo altamente específico. Este último es particularmente útil cuando la proteína diana está vagamente o indirectamente asociada con el ADN. DamID ha sido utilizado con éxito para mapear los sitios de unión de una variedad de proteínas, incluyendo proteínas de la envoltura nuclear, la cromatina asociada ^{4-10 11-13}

Protocolo

1. Generación y expresión de proteínas de fusión y Dam gratuito Proteínas

1. Clone proteína de interés en el vector DamID.
   1. Amplificar cDNA de proteína de interés (POI) utilizando la ADN polimerasa de alta fidelidad deseada y cebadores apropiados de acuerdo con el protocolo del fabricante. Experimentalmente determinar las condiciones óptimas de amplificación para asegurar la amplificación adecuada de insertos.
   2. Ejecutar un gel de agarosa y purificar cDNA amplificado de POI por el kit de extracción de gel de acuerdo con el protocolo del fabricante.
   3. CDNA clon del PDI en el vector pDONR201 usando BP Clonase II de acuer....

Resultados

La proteína de fusión Dam-V5-LMNB1 se verificó a ser co-localizada con la proteína Lamin B endógeno mediante tinción de inmunofluorescencia (Figura 1).

La amplificación por PCR con éxito de fragmentos de ADN adenina-metilado es un paso clave para DamID-ss. Las muestras experimentales deberían amplificar un frotis de 0,2 - 2 kb mientras que los controles negativos (sin DpnI, sin ligasa o sin plantilla PCR) debe.......

Discusión

Si las proteínas marcadas con Dam conservan las funciones de las proteínas endógenas debe examinarse antes de un experimento DamID-seq. La localización subcelular de las proteínas de la envoltura nuclear marcadas con Dam siempre debe determinarse y compararse con la de las proteínas endógenas. Para estudiar los factores de transcripción, se sugiere examinar si la proteína de fusión Dam puede rescatar las funciones de la proteína endógena en la regulación de la expresión génica. Esta prueba funcional se puede realizar en .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Sistemas de expresión lentiviral ViraPower	Life Technologies	K4950-00, K4960-00, K4970-00, K4975-00, K4980-00, K4985-00, K4990-00, K367-20, K370-20 y K371-20
Gateway BP Clonasa II Enzyme Mix	Life Technologies	11789-020
Gateway LR Clonasa II Enzyme Mix	Life Technologies	11791-020
DNeasy Blood & Kit de pañuelos (250)	QIAGEN	69506 o 69504
Gateway pDONR 201	Life Technologies	11798-014
293T	cells American Type Culture Collection	CRL-11268
Trypsin-EDTA (0.05%), rojo de fenol	Life Technologies	25300-054
DMEM, alta glucosa, piruvato	Life Technologies	11995-065
Suero fetal bovino	Sigma	F4135
Tris			marca no crítica
Marca EDTA			no crítica
200 Proof EtOH			marca no crítica
Marca de isopropanol			no crítica
Marca de acetato			no crítica
DpnI	New England Biolabs	R0176	suministrado con
adaptadores tampón DamID "AdRt" y "AdRb"	secuencias integradas de DNA Technologies		disponibles en ref. 24; sin fosforilación del extremo 5' o 3' para evitar la autoligadura.
T4 ADN ligasa	Roche Life Science	10481220001	suministrado con tampón
DpnII	New England Biolabs	R0543	suministrado con tampón
DamID DamID AdR_PCRSecuencias	integradas de tecnologías		de ADN disponibles en ref. 24
Juego de soluciones de desoxinucleótidos (dNTP)	New England Biolabs	N0446	100 mM de dATP, dCTP, dGTP y dTTP
Ventaja 2  Mezcla de polimerasa	Clontech	639201	suministra con tampón
1Kb Plus DNA Ladder	Life Technologies	10787018	1.0 y micro; g/µ l
Kit de purificación de PCR QIAquick	QIAGEN	28104 o 28106
Kit de purificación de PCR MinElute	QIAGEN	28004 o 28006	para un volumen de elución de menos de 30 y micro; l
Perlas SPRI / Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter	A63880	aplican mezcla adicional y más tiempo de elución si es inferior a 40 y micro; l se utiliza tampón de elución
Tampón EB	QIAGEN	19086
NEBNext dsDNA Fragmentasa	New England Biolabs	M0348	suministrado con tampón
T4 Tampón de reacción de ADN ligasa	New England Biolabs	B0202
T4 ADN polimerasa	England Biolabs	M0203
ADN polimerasa I, fragmento grande (Klenow)	New England Biolabs	M0210
T4 Ponirueotida quinasa	New England Biolabs	M0201
Fragmento de Klenow (3' → 5' exo-)	New England Biolabs	M0212	suministrado con
adaptadores de secuenciación tampón	Secuencias integradas de DNA Technologies		disponibles en ref. 28
Kit de ligadura rápida	New England Biolabs	M2200	utilizado en 3.4.3; suministrado con tampón de reacción de ligadura rápida y cebador de secuenciación rápida de ADN ligasa T4
y 2	integradas de DNA Technologies		disponibles en ref. 28
KAPA HiFi PCR Kit KAPA	Biosystems	KK2101 o KK2102	suministrado con KAPA HiFi DNA Polymerase, 5x KAPA HiFi Fidelity Buffer y 10 mM dNTP mix
agarosa	Sigma Aldrich	A4679
bromuro de	etidioSigma Aldrich	E1510-10ML	10 mg/ml
QIAquick Kit de extracción de gel	QIAGEN	28704 o 28706
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad Laboratories	1725121 o 1725122
marca de espectrofotómetro			no crítica
0.45 μ m PVDF Marca del filtro			no crítico
25 ml Marca Seringe			no crítico
10 cm Placas de cultivo de			marca no crítica
Placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos			marca no crítica
Termociclador S1000	Bio-Rad Laboratories
C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad Laboratories		para qPCR
Marca del mezclador			no crítica
Calentador de bloque seco o marca del termomezclador			no crítica
Marca de			no crítica
Sistema de electroforesis de gel con fuente de			marca no crítica
Soporte magnético			para la purificación del ADN con perlas de SPRI; debe contener tubos de 1,5-2 ml; marca no crítica
Transiluminador			marca no crítica
Sistema de electroforesis E-gel	Life Technologies	G6400, G6500, G6512ST