Artículo de método

El uso de Correlación Digital de Imágenes para caracterizar cepas locales en muestras de tejido vascular

DOI:

10.3791/53625

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24 de enero de 2016

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1Biomedical Engineering Program, University of South Carolina, 2Department of Mechanical Engineering, University of South Carolina

En este artículo

Resumen

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Describimos el uso de la correlación de imágenes digitales para caracterizar el campo de deformación superficial local en muestras de tejido vascular sometidas a ensayos de tracción uniaxial. Estas mediciones facilitan la cuantificación precisa de la respuesta mecánica de la muestra y la generación de relaciones constitutivas tensión-deformación.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La caracterización del comportamiento mecánico de los tejidos blandos biológicos y de ingeniería es un componente central de la investigación biomédica fundamental y el desarrollo de productos. Las relaciones tensión-deformación se obtienen normalmente a partir de los datos de los ensayos mecánicos para permitir la evaluación comparativa entre las muestras y, en algunos casos, la identificación de las propiedades mecánicas constitutivas. Sin embargo, se pueden introducir errores mediante el uso de medidas de deformación medias, ya que puede producirse una heterogeneidad significativa en el campo de deformación debido a la falta de uniformidad geométrica de la muestra y a las concentraciones de tensión inducidas por el montaje/agarre de los tejidos blandos dentro del sistema de ensayo. Cuando la heterogeneidad del campo de deformación es significativa, la evaluación precisa de la respuesta mecánica de la muestra requiere la medición de las deformaciones locales. Este estudio demuestra un nuevo protocolo de prueba biomecánica para calcular las deformaciones superficiales locales utilizando un dispositivo de prueba mecánica junto con una cámara de alta resolución y una técnica de correlación de imágenes digitales. Se adquieren una serie de imágenes de la superficie de la muestra y luego se analizan para cuantificar la deformación local de la superficie de una muestra de tejido vascular sometida a una carga uniaxial en rampa. Este enfoque puede mejorar la precisión en la biomecánica vascular experimental y tiene potencial para un uso más amplio entre otros tejidos blandos nativos, tejidos blandos diseñados y materiales poliméricos / hidrogeles blandos. En el vídeo, demostramos cómo configurar los componentes del sistema y realizar un experimento completo con tejido vascular nativo.

Introducción

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Una rica historia de la investigación que abarca más de 50 años se ha centrado en la cuantificación de las propiedades mecánicas de los tejidos vasculares. Estos estudios nos permiten comprender mejor tanto el comportamiento fisiológico y patológico de los vasos sanguíneos, proporcionamos una base para evaluar la eficacia / compatibilidad de los dispositivos endovasculares, y la ayuda en el diseño y fabricación de vascular ingeniería construye 1.6. Medición precisa de la respuesta mecánica de los tejidos blandos y modelización constitutiva de sus propiedades mecánicas es inherentemente un reto debido a la mecánica heterogeneidad, anisotropía, y no linealidad exhibido por la mayoría de los tipos de tejidos. Por otra parte, las mediciones experimentales son a menudo confundidos por complejidades locales introducidas en las interfaces de la muestra de agarre en el transcurso de ensayos mecánicos (es decir, la flexión, la fricción, las concentraciones de esfuerzos, desgarro) y la transición inevitable de las propiedades mecánicas una vez que el tejido se escinde del animal vivo.

Un experimento de tracción uniaxial se encuentra entre los ensayos mecánicos simples que se pueden realizar en una muestra hecha de un material sólido, y con frecuencia se utiliza para evaluar la respuesta mecánica de tejido vascular. Los resultados de estos experimentos proporcionan información preliminar útil para ambas fuentes de tejidos nativos y artificiales, y pueden ser utilizados para comparar los efectos de ciertos tratamientos, estados de enfermedad, o compuestos farmacológicos en el comportamiento mecánico de la pared vascular 7-11.

Ensayos mecánicos uniaxial de los tejidos blandos se realiza típicamente en muestras con geometrías relativamente uniformes, que son más comúnmente de hueso de perro o en forma de anillo 7,8,12-14. Sin embargo, desviación significativa de estas geometrías idealizadas puede ocurrir debido a los desafíos asociados con la disección de tejidos, el aislamiento y sujeción dentro del sistema de prueba. Cualquier falta de uniformidad en la geometría en última instancia, dar lugar a estrés heterogénea y la tensióncampos cuando la muestra se somete a la extensión uniaxial, con el grado de depende de la forma real de la muestra heterogeneidad, así como tamaño de la muestra (en relación con los agarres) y las propiedades mecánicas del material 9,15,16. Cuando heterogeneidades de campo son significativos, los cálculos de deformación de la muestra en base a las posiciones de agarre relativos son inexactos y por lo tanto una base insuficiente para evaluar el comportamiento mecánico.

Sistemas de análisis de vídeo han sido ampliamente utilizados para las mediciones de deformación de los tejidos blandos, a menudo el uso de marcadores de colorante de alto contraste aplicados a la superficie de la muestra 17,18. Correlación de imágenes digital, una técnica metrológica óptico que mide la tensión superficial de campo completo mediante la comparación de valores de intensidad de nivel de gris en la superficie de la muestra antes y después de la deformación, se ha utilizado en conjunción con vídeo análisis de los tejidos blandos 19-21. Hay varias ventajas de la correlación de imágenes digitales en comparación con interferometric métodos que pueden ser empleados para las mediciones. En primer lugar, como una técnica de medición sin contacto, que minimiza los efectos de confusión de la modificación de las propiedades del material debido a la forma en que el sistema de medición afecta a la muestra. En segundo lugar, se requiere un ambiente mucho menos estrictas medición y tiene una gama más amplia de sensibilidad y resolución que otros métodos. En tercer lugar, dotado de la capacidad de captura de un campo de visión completo, esta técnica puede caracterizar tanto la media y las respuestas mecánicas locales. Para una explicación detallada del método, se anima a los lectores a ver el libro de Sutton 22.

Para obtener campos de deformación en la superficie de la muestra, una técnica de correlación digital de la imagen de dos dimensiones (2D-DIC) se puede utilizar. En pocas palabras, las imágenes de la muestra son capturados en estados cargados sin carga y diversos. La primera imagen se divide en cuadrados pequeños llamados subconjuntos (M × M píxeles) que forman una malla para su posterior cálculo deCampos de deformación 2D. Se obtiene la posición de cada plaza en la muestra deformados mediante un algoritmo de imagen coincidente. El movimiento de cada cuadrado es entonces seguido, imagen por imagen, produciendo campos de desplazamiento que luego pueden ser utilizados para derivar los gradientes de deformación y las tensiones a través de una variedad de métodos, incluyendo polinomio de montaje o de elementos finitos interpolación. En el presente manuscrito, proporcionamos una metodología detallada para la evaluación de los campos de tensiones superficiales en tejidos vasculares nativas a través de la integración de los ensayos de tracción uniaxial y 2D-DIC.

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Protocolo

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NOTA: Los procedimientos descritos a continuación se realizaron como parte de un protocolo aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Carolina del Sur en Columbia, Carolina del Sur.

1. Adquisición y disección de tejidos

  1. Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos antes de la disección de tejidos. Tijeras Autoclave quirúrgicos y pinzas estándar finas, así como cuchillas quirúrgicas bajo presión de 15 psi y temperatura de 121 ° C durante 15 minutos.
  2. Adquirir un conjunto de porcino fresca (7 meses de edad machos Landrace, 60-70 kg) riñones con la aorta intacta de un matadero local. Tejido transporte al laboratorio en solución salina tamponada (PBS) Solución de helado de fosfato 1%.
  3. Inmediatamente después de su llegada, aislar la aorta abdominal del tejido circundante utilizando tijeras quirúrgicas y pinzas.
  4. Lavar el recipiente tres veces utilizando una jeringa de 50 ml lleno de PBS (pH 7,2). El uso de las tijeras y pinzas, quite tanto tejido perivascular como possIble sin comprometer la integridad de la muestra.
  5. Verticalmente colocar una hoja de afeitar afilada en la sección central de la embarcación y asegúrese de que es perpendicular al eje longitudinal del vaso. Crear dos muestras de anillo cada uno con una anchura de aproximadamente 20 mm mediante la aplicación de tres cortes circunferenciales secuenciales con la hoja de afeitar.
  6. Verticalmente posicionar una hoja de afeitar afilada en una sola muestra de anillo de tal manera que la hoja se orienta en la dirección radial. Aplicar una fuerza aguda para producir un corte radial, que se traduce en una muestra en forma de tira para ensayos mecánicos uniaxial. Colocar la muestra en una placa de Petri de 100 mm de vidrio y sumergirse en PBS hasta que la aplicación de motas superficie. Repita el procedimiento para la segunda muestra el anillo.

2. Creación de la superficie del patrón moteado

  1. Conectar el aerógrafo a la válvula de presión.
  2. Ajuste el diámetro de la boquilla del aerógrafo para producir motas de 60 a 100 micras (rango apropiado para el diámetro de la boquilla debedeterminar a partir de estudios preliminares).
  3. Verter aproximadamente 2 ml de tejido negro tinta de marcado en el alimentador de gravedad de la aerógrafo.
  4. Coloque el aerógrafo aproximadamente 0,5 m de distancia de la muestra.
  5. Retire la muestra de la placa de Petri. Pulverizar colorante de marcación de tejido en la superficie de la íntima de la muestra durante aproximadamente 5 segundos bajo una presión de pulverización de 100 psi. Repetir tres veces para asegurar que el patrón de speckle cubre uniformemente la superficie de la muestra.

3. Realización de experimentos

  1. Fije cada extremo de la muestra a una tira de plástico (1 cm de anchura x 1 cm de longitud x 0,5 cm de espesor) usando un adhesivo tisular. Colocar la muestra en una tabla de cortar el tejido. Coloque la muestra de tal manera que quede plana y medir sus dimensiones usando un calibrador digital.
  2. Iniciar controles del sistema para la prueba mecánica. En el sistema controla la pantalla de inicio, seleccione "forma de onda" en la barra de tareas se encuentra en la pestaña "Configuración".
  3. Anunciosimplemente la posición de la empuñadura superior del probador mecánico a -4 mm (4 mm extensión relativa a la posición inicial designada en el sistema). Asegurar suavemente una tira de plástico (que se adjunta a la muestra de 3,1) en la empuñadura superior del probador mecánico y dejar que la muestra cuelgue libremente. Utilice el calibrador digital para asegurar que la distancia entre la muestra y el agarre superior es de menos de 2 mm.
  4. Ajustar manualmente la posición de la empuñadura inferior de modo que el extremo libre de la muestra puede ser asegurado sin extensión. Asegurar suavemente la tira de plástico unida al extremo libre de la muestra en el agarre inferior del probador mecánico.
    1. Utilice el calibrador digital para asegurar que la distancia entre la muestra y la empuñadura inferior es de menos de 2 mm. Cero la célula de carga del sistema. Mida la longitud de la muestra y utilizar esto como la longitud de referencia para el cálculo de tensiones circunferenciales globales.
  5. Introduzca el protocolo de ensayos mecánicos. El protocolo utilizado en tsu demostración implica 4 ciclos de desplazamiento uniaxial que se extienden la longitud de la muestra en un 18% a una velocidad de desplazamiento de 0,01 mm / seg.
  6. De forma intermitente rociar PBS sobre la muestra a lo largo del protocolo de pruebas restantes para asegurarse de que permanece hidratado.
  7. Monte la cámara (cámara de 5 mega píxeles, lente de 100 mm, tamaño de píxel de 3,49 micras) sobre un trípode que se sitúa 1,5 m del marco de carga. Asegurarse de la cámara y superficie de la muestra son perpendiculares ajustando la cámara en el campo disponible más bajo de la profundidad y la manipulación de su alineación de tal manera que todo el campo de vista está en foco.
  8. Abra el software de captura de imágenes.
  9. Seleccione "PGR-2" en la opción "Seleccionar sistema".
  10. Seleccione la ruta del proyecto para guardar las imágenes a analizar.
  11. Haga clic en el icono de "Time Square" y especifique el intervalo de adquisición como 5 seg.
  12. Ajuste la exposición, apertura numérica, y el enfoque de la lente con el fin de obtener una visión clara de la muestra.
  13. Ajuste la posición del LED para proporcionar la iluminación adecuada en la muestra.
  14. Haga clic en el icono "Inicio" en el software de captura de imagen para obtener una imagen de la superficie de la muestra.
  15. Abra el software de análisis de imágenes.
  16. Importe la imagen obtenida. Zoom en un moteado individual, y luego contar el número de píxeles dentro de este moteado individual.
    Nota: Identificar un moteado negro representativa. Definir el tamaño speckle como la distancia lineal entre píxeles en ambos lados de la speckle que tienen altos valores similares. Para un tamaño de speckle aceptable, el número de píxeles a través de la anchura de un speckle típica debe ser mayor de 3 píxeles. Para mejorar la resolución espacial en las mediciones, la mayoría de manchas deben tener no más de 5-7 píxeles a lo ancho de la speckle, siempre que sea posible. Así, un moteado típico para este caso oscilaría entre 10 micras, con el más pequeño y 23 micras, con el más grande en dimensión lineal. Para determinar un subconjunto adecuadotamaño, un subconjunto típica debe tener al menos 3 blanco y 3 motas negras a través de su anchura. Si un speckle típica es de 5 píxeles en dimensión lineal, entonces cada subconjunto 31x31 sería al menos 105 m en la dimensión lineal. La separación entre centros de subconjuntos debe ser al menos 1/6 de la dimensión lineal. Por lo tanto, para un tamaño de 31x31 subconjunto, la distancia es de 5 píxeles que representa 18 micras de distancia lineal.
  17. Después de verificar la calidad de patrón moteado, haga clic en el icono de forma simultánea "Ejecutar" en el sistema y el icono "Inicio" en el software de captura de imagen para iniciar la prueba.
  18. Captura de una serie de imágenes a lo largo de la prueba utilizando el software de la cámara y la captura de imágenes.

4. Procedimientos de limpieza después del experimento

  1. Coloque la muestra descartada en la bolsa de riesgo biológico y cerrar la bolsa. Llame al Departamento de Salud Ambiental y Seguridad (EHS) de la Universidad de Carolina del Sur para su eliminación adecuada.
  2. Preparar un fosfatosolución desinfectante libre con una relación 1:64 dilución de detergente desinfectante de agua destilada. Remojar las herramientas quirúrgicas en esta solución durante 20 min.
  3. Enjuague los artículos descritos en 4.2 con agua destilada. Seque las herramientas utilizando una toalla de papel y luego rociar con una solución de etanol al 70%. Una vez más, secar los instrumentos quirúrgicos utilizando una toalla de papel y volver a ponerlos en la caja de herramientas quirúrgica.

5. Análisis de Imágenes para medir el campo de deformación local

  1. Abra el software de análisis de imágenes.
  2. Haga clic en la pestaña "imágenes de moteado", seleccione todas las imágenes que deben ser analizados.
  3. Haga clic en la herramienta rectángulo y seleccionar el área de interés en la primera imagen.
  4. Introduzca el tamaño de subgrupo 41 × 41 píxeles y tamaño de paso 5 píxeles.
  5. Haga clic en Inicio pestaña análisis en el software, seleccione la interpolación como optimizada 8-trampa; seleccione el criterio de que las diferencias al cuadrado normalizados de cero y pesos subconjunto de opciones como Gauss.
  6. Configure las opciones de umbral como por defecto en el software.
  7. Haga clic en la ficha sub post-procesamiento en la ficha de análisis de inicio. Haga clic en la opción de la tensión de cálculo y dejar el tamaño del filtro y el tipo de filtro por defecto en el software. Seleccione tensor de tipo Lagrange.
  8. Seleccione la ficha de datos y, a continuación, seleccione cualquier imagen analizada para la visualización del campo de deformación superficial.

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Resultados

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Los datos mecánicos adquiridos a partir de una prueba de extensión uniaxial en rampa sobre el tejido vascular se compone de carga frente a las relaciones de desplazamiento muestra aplicada a una tasa de desplazamiento dado. En este estudio, 2D-DIC, en relación con ensayos mecánicos uniaxial se utiliza para medir los campos de deformación superficie de la muestra en direcciones ortogonales en varios estados deformados. La naturaleza viscoelástica de tejido vascular se manifiesta por la no...

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Discusión

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Aunque estudios previos han utilizado una amplia gama de métodos de vídeo de tinte de seguimiento para evaluar la tensión de la muestra 18,20,21,23,24, nuestro objetivo actual es proporcionar una metodología integral para acoplar de ensayo de tracción uniaxial con 2D-DIC para la evaluación de cepas de superficie en muestras de tejido vascular. Con una cámara de alta resolución y el software de análisis de imágenes de la casa, el campo de deformación se puede medir dentro de una región de la superficie determi...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos de interés potenciales.

Agradecimientos

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El software y el soporte técnico son cortesía de correlacionada Soluciones Incorporated (www.correlatedsolutions.com).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Comprobador mecánico de tracción uniaxialEnduratec3230 AT/HR
Tinte de marcado de tejidos azulhttp://www.ebay.com/itm/Tissue-Marking-Dye-in-Bottles-2oz-Bottle-1-ea-/201193551510?pt=LH_DefaultDomain_0&hash=item2ed811f696
PulverizadorAnest-iwataCM-BCustom Micron B
CameraGreyGS2-GE-50S5M-C
LenteTokinaAT-X M100
Tejido vascularCaughman Inc
0.9% Cloruro de sodio Inyección PBSBAXTER HEALTHCARE CORP.
Vic_snapSoluciones
Vic_2DSoluciones
Wintest 4.1Adhesivo tisular Bose ElectroForce
  3M Vetbond 1469SB
Desinfectante Fisher Scientific04-355-13Decon BDD Bacdown Detergente Desinfectante
Point correlacionadascorrelacionadas

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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