Artículo de método

Aislamiento de leucocitos infiltrantes de ratón Piel Usando enzimática Digest y Separación de degradado

DOI:

10.3791/53638

⸱

25 de enero de 2016

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1Department of Biology, Macalester College, 2Department of Medicine, Division of Rheumatic and Autoimmune Diseases, Center for Immunology, University of Minnesota

En este artículo

Resumen

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Este protocolo describe la digestión enzimática de la piel de ratón en un medio rico en nutrientes seguida de una separación en gradiente para aislar leucocitos. Las células así derivadas se pueden utilizar para diversas aplicaciones posteriores. Se trata de una alternativa eficaz, económica y mejorada a las máquinas de disociación de tejidos y a los protocolos más estrictos de digestión de tejidos basados en tripsina y dispasas.

Resumen

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La disociación de la piel murina en una suspensión unicelular es esencial para el análisis celular posterior, como la caracterización de las células inmunitarias infiltrantes en modelos de inflamación de la piel en roedores. Aquí, describimos un protocolo para la digestión de la piel de ratón en una solución rica en nutrientes con colagenasa D, seguida de la separación de células hematopoyéticas utilizando un gradiente de densidad discontinuo. Las células así obtenidas se pueden utilizar para estudios in vitro, transferencia in vivo y otros análisis celulares y moleculares posteriores, incluida la citometría de flujo. Este protocolo es una alternativa eficaz y económica a los costosos disociadores mecánicos, las columnas de separación especializadas y los métodos de digestión más duros basados en tripsina y dispasa, que pueden comprometer la viabilidad celular o la densidad de las proteínas de superficie relevantes para la caracterización fenotípica o la función celular. Como se muestra aquí en nuestros datos representativos, este protocolo produjo células altamente viables, contenía subconjuntos específicos de células inmunitarias y no tuvo ningún efecto sobre la integridad de las proteínas marcadoras de superficie comunes utilizadas en el análisis de citometría de flujo.

Introducción

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No se encontraron enfermedades de la piel que van desde dermatitis de contacto, eczema, psoriasis, celulitis, infecciones por hongos y abscesos a los cánceres de piel no melanoma de estar entre las 50 enfermedades más prevalentes en todo el mundo, y la cuarta causa mundial de enfermedades no mortales en 2010 1. Por consiguiente, la investigación de los mecanismos moleculares y celulares que subyacen a diversas patologías de la piel es un área necesaria y activa de investigación. Modelos de roedores han sido notablemente útil en la comprensión de las condiciones inflamatorias de la piel tales como dermatitis atópica 2, 3 psoriasis, o infección Staphylococcus aureus 4. Protocolos de bajo costo, eficientes y simples para la digestión enzimática de tejido de la piel del ratón pueden proporcionar preparaciones de células que se pueden utilizar para una variedad de aplicaciones posteriores para entender mejor la fisiopatología de enfermedades de la piel. Aquí, un método sencillo y económico se describe, por digestión enzimática de la piel del ratónel tejido de la piel y el aislamiento de leucocitos infiltrantes que puede ser utilizado para el cultivo celular, la transferencia adoptiva in vivo, análisis citométrico de flujo y clasificación o estudios de expresión génica. El objetivo general de este procedimiento consiste en preparar una suspensión de células de leucocitos infiltrantes de piel con la viabilidad celular alta y reducir al mínimo los costos normalmente asociados con kits de reactivos de encargo y disociadores mecánicos.

Métodos de disociación del tejido de la piel existentes 5-7 pueden resultar en una baja viabilidad celular y la superficie de la integridad marcador, o requerir kits enzimáticos personalizados y costosas máquinas de disociación de tejidos 8-11. Mientras que la digestión de los tejidos de la piel de oreja de ratón es razonablemente frecuente 12-13 de la digestión de tejidos de la piel altamente queratinizado (por ejemplo, desde el flanco) puede resultar en preparaciones de células contaminadas con grandes cantidades de escombros no celular. En un estudio reciente, Zaid y colegas digeridos ratón piel flanco durante 90 minutos en 2,5 mg / ml de dispasa, Folloconducido por 45 min en 3 mg / ml de colagenasa 7. En otro estudio, estos investigadores utilizaron múltiples incubaciones con una digestión combinada de 2,5 hr, incluyendo el uso de tripsina / EDTA, colagenasa III, y dispasa 5. No se recomienda el uso de tripsina durante la digestión enzimática de la piel, como se ha demostrado que el tratamiento con tripsina de diferentes fabricantes para afectar apreciablemente la integridad de las proteínas de la superficie celular en células de mamífero 14-15. Además, dispasa puede tener efectos significativos sobre las capacidades proliferativas de células CD4 y CD8a T y afectar a la abundancia de superficie de al menos 20 moléculas, incluyendo T común marcadores de activación celular, tales como CD62L 16. Otros protocolos utilizan RPMI 1640 en el medio de la digestión 6. Sin embargo, la presencia de Mg2 + y Ca2 + en medio RPMI puede causar la agregación extensa celular 17.

Un protocolo ideal para la disociación del tejido debe aspirar a la viabilidad celular alta, bajaniveles de agregación celular, y un daño mínimo a proteínas de la superficie celular. Preparaciones de células del estroma de los ganglios linfáticos de alta calidad se han cumplido con los protocolos que utilizan incubaciones enzimáticas más cortos, Ca 2+ y Mg 2+ medios de comunicación libres, y evitar la tripsina y Dispasa 18. Sin embargo, los protocolos de este tipo no se han establecido para la disociación de la piel entera de ratón.

Aquí, un protocolo se describe a disociar, aislar y enriquecer los leucocitos infiltrantes de la piel de la piel del flanco del ratón alergeno-desafió. Brevemente, piel extirpada se pre-incubó en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) con suero bovino fetal al 10% durante 1 hora para suavizar el tejido para la digestión y eliminar cualquier exceso de piel o tejido graso muerto. Esto es seguido por una etapa de digestión enzimática 30 min con 0,7 mg / ml de colagenasa D. colagenasa D tiene efectos mínimos sobre la densidad de marcadores de superficie celular, y ningún efecto sobre la proliferación de células T in vitro 16,18, por lo que esmuy adecuado para aplicaciones que implican la caracterización de proteínas de la superficie. Después de la digestión enzimática, se utilizó centrifugación en gradiente de densidad discontinuo para eliminar las células epiteliales y los restos de la suspensión de una sola célula y enriquecer para las células hematopoyéticas. Es importante destacar que este procedimiento evita costosos reactivos separación celular magnética basada en la columna de disociación y máquinas de tejido 8-11, y se puede realizar con el equipo y los materiales encontrados en un laboratorio de investigación básica biomédica. Aquí se utiliza este protocolo para aislar los leucocitos de la piel flanco desafiado tres veces con la oxazolona hapteno (buey) en ratones ND4 suizos previamente sensibilizados (adaptado de 19). Las células se analizaron mediante citometría de flujo multiparamétrica. Esta técnica produjo una suspensión de células con los desechos mínimo y> 95% de viabilidad de los linfocitos aislados que fueron analizados por el flujo multi-paramétrico citometría para medir la infiltración de linfocitos y neutrófilos T en el sk afectadaen.

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Protocolo

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Nota: los ratones 8-12 semanas de edad Hembra ND4 Swiss Webster, convencionalmente alojados con libre acceso a los alimentos y el agua, fueron utilizados para estos estudios El protocolo experimental utilizado (B13S1) fue aprobado por IACUC de Macalester College..

1. Sensibilización y Desafío con oxazolona

  1. Día 0
    1. Preparar cámara de anestesia mediante la adición de 3 ml de isoflurano a las toallas absorbentes colocados debajo de la malla en la parte inferior de un 4 L frasco de vidrio con tapa. Para los ratones hembra ND4 utiliza aquí, el tiempo en la cámara es de 30-60 seg hasta que el sujeto es anestesiado adecuadamente; optimizar la administración de anestesia se utiliza para la cepa de ratón.
    2. Afeitarse la espalda de cada ratón anestesiado y flanquear usando un cortador de pelo animal.
  2. Día 1
    1. Hacer una solución 2% de 4-etoximetilen-2-fenil-2-oxazolin-5-ona (Ox) en etanol absoluto, y se incuba a 50 ° C durante 15 min en un plato giratorio en una incubadora.
    2. Brevemente anestesiarratones utilizando anestesia con isoflurano como se describe en 1.1.1 y aplique 100 l de 2% de buey a la afeitada de vuelta en varias aplicaciones de serie de unos 20 l cada uno. Espere 5-10 segundos entre las aplicaciones de serie de la solución a secar.
    3. Tenga cuidado de no derramar la solución Buey 2% en regiones distintas de la parte posterior, y esperar a que la solución se seque entre aplicaciones.
  3. Días 5-7
    1. Hacer una solución 1% de (Ox) en etanol absoluto, y se incuba a 50 ° C durante 15 min en un plato giratorio en una incubadora.
    2. Suavemente pero con firmeza inmovilizar el ratón en el pescuezo de la base del cuello y la cola con el abdomen hacia arriba y el cuello ligeramente inclinada hacia abajo (similar a una retención para una inyección intraperitoneal) y aplicar 100 l de 1% Ox al flanco afeitado en varias aplicaciones de serie y tomarse el tiempo para secar la piel después como se ha descrito anteriormente.
    3. Para los ratones de control, aplicar 100 l de vehículo absoluta etanol para el flan afeitadok.

2. Flanco Piel Cosecha

  1. La eutanasia ratones utilizando la inhalación de dióxido de carbono, y extirpar con cuidado el área deseada de la piel del flanco (~ 25 mm x 25mm de la piel) con 10 cm tijeras quirúrgicas.
  2. Usando una cuchilla quirúrgica limpia, nítida, raspar el exceso de grasa y tejido conectivo de la piel flanco.
  3. Coloque 3 piezas de piel flanco de 3 ratones en un tubo cónico de 50 ml que contiene 10 ml de HBSS RT [con rojo de fenol, sin calcio o magnesio, 5 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), 10 mM 4- (2-hidroxietil) -1- ácido piperazinetanosulfónico (HEPES), y suero bovino fetal al 10% (FBS)].

3. Pre-digestión del tejido Lavadora

  1. Colocar el tubo que contiene fragmentos de piel en una placa giratoria para 30 min en una incubadora no gaseados seco mantenido a 37 ° C.
  2. Vortex vigorosamente durante 10 segundos al final del periodo de incubación.
  3. Cuele el contenido del tubo a través de un m 70colador para desechar el tampón de lavado y recoger el tejido. Un único tamiz puede ser reutilizado durante todo el procedimiento dentro de un grupo de tratamiento biológico.
  4. El uso de un par de fórceps, transferir la piel flanco desde el colador en un nuevo tubo cónico de 50 ml que contiene 10 ml de fresco, medios de comunicación RT HBSS (que contienen EDTA, HEPES, FBS y como se describe anteriormente).
  5. Con un par 12.5 cm de tijeras de disección quirúrgicos inmersos en el tubo, pelos en cada pieza de piel del flanco de manera que la pieza media del tejido es de aproximadamente 2,2 mm x 2,2 mm en la zona.
  6. Colocar el tubo que contiene fragmentos de piel en una placa giratoria para 30 min en una incubadora no gaseados seco mantenido a 37 ° C.
  7. Vortex vigorosamente durante 10 segundos al final de la incubación

4. La digestión de colagenasa de la piel

  1. Cuele el contenido del tubo a través de un colador de 70 micras, recoger y transferir las piezas de piel flanco en un nuevo tubo cónico de 50 ml que contiene 10 ml fresh, medios RT HBSS suplementado con 0,7 mg / ml de colagenasa D.
  2. Colocar el tubo que contiene medio de la digestión y fragmentos de piel en una placa giratoria para 30 min en una incubadora no gaseados seco mantenido a 37 ° C.
  3. Contenidos vórtice de tubo vigorosamente durante 10 segundos al final de la incubación.
  4. Filtrar contenido del tubo a través de un colador de 70 micras en un nuevo tubo cónico de 50 ml; mantener el flujo a través que contiene el tejido digerido y deseche el filtro y el flanco restos de piel.
  5. Lavar el flujo a través en 50 ml de HBSS medios de comunicación, centrifugar durante 5 min a 350 g y decantar el sobrenadante.

5. Densidad centrifugación en gradiente

  1. Utilizando una pipeta serológica, añadir 3 ml RT 67% centrifugación en gradiente de densidad media en 1X tampón fosfato salino (PBS) en un nuevo tubo cónico de 15 ml para cada muestra.
  2. Resuspender el sedimento celular en 5 ml RT 44% de densidad de centrifugación en gradiente de medios de comunicación en HBSS con rojo fenol.
  3. CaballeroLy capa de 5 ml de los medios de centrifugación en gradiente de densidad 44% que contiene las células en la parte superior del gradiente de densidad de centrifugación de la muestra los medios de comunicación 67% usando una pipeta serológica. Asegúrese de ajustar la pipeta a la velocidad más baja y coloque la pipeta a lo largo de la pared del tubo cónico. Tenga cuidado de no mover, alterar, o invertir el gradiente.
  4. Aceleración de Ajuste a la posición más baja, desenganchar el freno, y centrifugar el gradiente a 931 xg durante 20 minutos a temperatura ambiente asegurándose de que la centrífuga es equilibrada.
  5. Después de la centrifugación, retire con cuidado el gradiente de la centrífuga, y transportar suavemente a la mesa de laboratorio sostiene el tubo en posición vertical. Usando una pipeta de transferencia de plástico de 5 ml, retire la capa de células en la interfase de los 44% y 67% de gradiente de densidad media de centrifugación y la transferencia a un nuevo tubo cónico de 15 ml. Si la interfaz no está visible, simplemente quite unos 2 ml de líquido en el 67% -44% del límite.
  6. Llene el tubo cónico que contiene células de la interface con 2% de FBS en 1X PBS enfriado en hielo, las células de centrifugación durante 5 minutos a 350 xg, y decantar el sobrenadante.
    Nota: Esta es la primera vez que las células se pueden enfriar / mantenidos en frío, ya pasos de digestión son a 37 ° C y los pasos de los medios de gradiente de densidad de centrifugación son a RT. Las células pueden ser resuspendidas en un 1: 1 Trypan azul de dilución y el recuento de viabilidad y la información se puede obtener en este punto.

6. Bloqueo y tinción para el Análisis de citometría de flujo

  1. Bloquear RII / III receptores en las células para prevenir la tinción de anticuerpos no específicos. Para los experimentos descritos aquí, hacer mezclas de reacción de anticuerpos en PBS con 2% de FBS que contiene 1: 100 dilución de anticuerpo no conjugado contra CD16 / 32 (2.4G2) para atar y bloquean los receptores RII / III.
  2. Se incuban las células bloqueadas con mezclas de reacción adecuados de anticuerpos contra CD3ɛ (145-2C11), CD4 (RM4-5), CD8a (53-6,7), CD11b (M1 / 70), CD11c (N418), CD44 (IM7), CD45 ( 30-F11), CD45R(RA3-6B2), CD62L (MEL-14), y Ly-6G / Ly-6C (Gr-1) (RB6-8C5), así como Brilliant Violet 510 mancha en vivo / muerto para identificar las células muertas. Utilice todos los anticuerpos ya sea a la dilución recomendada por los fabricantes o previamente optimizado por los investigadores. Para los experimentos descritos aquí, utilizar todos los anticuerpos a 1: 100 dilución.
  3. Lavar las células y resuspender en 50 l de PBS 1X tampón de tinción con 2% de FBS. Mantenga en hielo hasta que los datos de fluorescencia se pueden adquirir en un citómetro de flujo.
    Nota: Es importante tener parámetros de compensación pre-optimizados con un tejido linfoide y un antígeno de superficie celular común (como CD4 o CD8) antes de la adquisición de los datos de fluorescencia.
  4. Para aumentar el número de células para análisis de citometría de flujo aguas abajo, adquirir datos de las muestras enteras de células teñidas.

7. Analizar citometría de flujo de datos mediante los métodos estándar para lograr los pasos descritos a continuación

  1. En primer lugar, la puerta en la región de linfocitos de la dispersión frontal(área) por dispersión lateral (área) trama.
  2. A continuación, seleccione las células individuales utilizando el dispersión frontal (ancho) por dispersión lateral (ancho), para evitar el análisis de dobletes. Esto también se puede lograr con una altura de dispersión hacia adelante por la altura dispersión lateral trama.
  3. Entonces, la puerta en el linaje (CD11b, CD11c y CD45R / B220) -negativo y CD3 positivos acontecimientos, para excluir a los macrófagos, las células células dendríticas, y B, respectivamente, y confine analiza al compartimento de células T, si el objetivo es, como en este caso, para evaluar la infiltración de células T.
  4. A continuación, la puerta en las células vivas que excluyen la mancha en vivo / muerto.
  5. Por último, la puerta en la población celular de interés (ver sección de resultados representativos).

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Resultados

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La colagenasa D tratada esplenocitos muestran niveles similares de CD4 y CD8 α en las células T en comparación con los controles tratados con los medios
En primer lugar, cualquier efecto potencial de colagenasa D sobre la frecuencia y la superficie abundancia de linaje y activación marcadores en subconjuntos de células T se evaluaron utilizando el tejido linfoide secundario como un control. Una suspensión de esplenocitos se obtuvo d...

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Discusión

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La caracterización de los cambios en los leucocitos de la piel-residente en modelos de roedores de enfermedades de la piel tales como dermatitis atópica o psoriasis es importante para la comprensión de las conexiones mecánicas entre la afluencia de células inflamatorias y patología de la enfermedad. Aquí se describe una técnica económica para aislar leucocitos de tejidos de la piel con el equipo básico que se encuentra en la mayoría de los laboratorios de investigación biomédica. Esta relativamente rápida técnica evita ...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen intereses financieros o de otro tipo para revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los Institutos Nacionales de Salud (NIH R15 NS067536-01A1 a DC), la Asociación Nacional de vulvodinia (premio a DC), y Macalester College apoyaron este trabajo. CB recibió una beca del Programa de Beckman estudiosos Macalester College, financiado por la Fundación Mabel Beckman Arnold y. BTF y TM son compatibles con JDRF 2-2011-662. Agradecemos al Dr. Jason Schenkel y el Dr. Juliana Lewis para el asesoramiento técnico, y todos los miembros actuales y anteriores del laboratorio Chatterjea por su ayuda y apoyo.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
HBSS con rojo fenol, sin calcio, sin magnesio, líquidoSigma Aldrich55021CMantener estéril hasta el día de su uso.
HEPES, ≥ 99,5% (valoración)Sigma AldrichH3375
EDTA solución salina disódicaSigma AldrichE7889Mantener estéril hasta el día de su uso.
Suero Fetal Bovino, USDA, Inactivado por Calor, Premium SelectMidSciS01520HIMantener estéril hasta el día de su uso.
Percoll, pH 8.5-9.5 (25&grados; C)Sigma AldrichP1644Mantener estéril. Percoll debe hacerse isotónico con PBS estéril 10X antes de su uso.
Kit combinado de recortadoraKent ScientificCL9990-1201 Use la recortadora más grande para afeitar el flanco y la espalda.
4-etoximetileno-2-fenil-2-oxazolina-5-onaSigma AldrichE0753-10Gse disuelve en 100% EtOH a 50 grados; C durante 15 minutos en un plato giratorio.
Anti-ratón purificado CD16/CD32 (2.4G2)Tonbo Biosciences70-0161Anticuerpo utilizado para bloquear la unión de anticuerpos no específicos durante la tinción de anticuerpos para la citometría de flujo
anti-CD3ε-BV650 (145-2C11)Becton Dickinson564378Anticuerpo utilizado para teñir células para citometría
de flujo anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5)eBioscience47-0042-80Anticuerpo utilizado para teñir células para el flujo citometría
anti-CD8α-BV785 (53-6.7)BioLegend100749Anticuerpo utilizado para teñir células para citometría
de flujo anti-CD11b-eFluor450 (M1/70)eBioscience48-0112-80Anticuerpo utilizado para teñir células para citometría de flujo
anti-CD11c-eFluor450 (N418)eBioscience48-0114-80Anticuerpo utilizado para teñir células para citometría
de flujo anti-CD44-BV711 (IM7)Becton Dickinson563971Anticuerpo utilizado para teñir células para citometría de flujo
anti-CD45-FITC (30-F11)Tonbo Biosciences35-0451-U025Anticuerpo utilizado para teñir células para citometría
de flujo anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2)eBioscience48-0452-80Anticuerpo utilizado para teñir células para citometría
de flujo anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14)BioLegend104431Anticuerpo utilizado para teñir células para citometría de flujo
anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5)BioLegend108407Anticuerpo utilizado para teñir células para citometría de flujo
Ghost Dye-BV510Tonbo Biosciences13-0870-T100Colorante de viabilidad para citometría de flujo
LSR FortessaBecton DickinsonN/AAnalizador de células (18 parámetros)
Colagenasa D de Clostridium histolyticumRoche Applied Science11088858001Enzima liofilizada alícuota a 5 mg/ml en HBSS con rojo fenol, sin calcio y sin magnesio en alícuotas de 1 mL.  Almacene inmediatamente a -20 grados; C durante un máximo de seis meses.
ND4 Ratones hembra suizosHarlan0-32de 8-12 semanas de edad; alojados convencionalmente con acceso gratuito a alimentos y agua y utilizados de acuerdo con las pautas de IACUC de Macalester College.

Referencias

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