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Artículo de método

Lapso de tiempo-microscopía de vídeo para la Evaluación de EYFP-Parkin agregación como un marcador para celular mitofagia

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DOI:

10.3791/53657

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4 de mayo de 2016

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1Department of Cancer Biology, Thomas Jefferson University, SKCC, 2Department of Medical Oncology, Thomas Jefferson University, SKCC, 3Kazan Federal University

En este artículo

Resumen

Aquí, describimos en detalle un enfoque de microscopía de video de lapso de tiempo para medir el reclutamiento temporal de EYFP-Parkin durante la eliminación selectiva de mitocondrias dañadas. Este proceso dinámico de eliminación de mitocondrias dañadas dependiente de EYFP-Parkin se puede utilizar como indicador de la salud celular en diferentes condiciones experimentales.

Resumen

La microscopía de video time-lapse se puede definir como la obtención de imágenes en tiempo real de células vivas. Esta técnica se basa en la recopilación de imágenes en diferentes puntos temporales. Los intervalos de tiempo se pueden establecer a través de una interfaz de computadora que controla la cámara integrada en el microscopio. Este tipo de microscopía requiere tanto la capacidad de adquirir eventos muy rápidos como la señal generada por la estructura celular observada durante estos eventos. Una vez que se han recopilado las imágenes, se ensambla una película de todo el experimento para mostrar la dinámica de los eventos moleculares de interés. La microscopía de video de lapso de tiempo tiene una amplia gama de aplicaciones en el campo de la investigación biomédica y es una herramienta poderosa y única para seguir la dinámica de los eventos celulares en tiempo real. A través de esta técnica, podemos evaluar eventos celulares como la migración, la división, la transducción de señales, el crecimiento y la muerte. Además, mediante el uso de sondas moleculares fluorescentes podemos marcar moléculas específicas, como ADN, ARN o proteínas, y seguirlas a través de sus vías y funciones moleculares. La microscopía de video de lapso de tiempo tiene múltiples ventajas, la principal es la capacidad de recopilar datos a nivel de una sola célula, lo que la convierte en una tecnología única para la investigación en el campo de la biología celular. Sin embargo, la microscopía de video de lapso de tiempo tiene limitaciones que pueden interferir con la adquisición de imágenes de alta calidad. Las imágenes pueden verse comprometidas por ambos factores externos; fluctuaciones de temperatura, vibraciones, humedad y factores internos; pH, motilidad celular. En este artículo, describimos un protocolo para la adquisición dinámica de una proteína específica, Parkin, fusionada con la proteína fluorescente amarilla mejorada (EYFP) con el fin de rastrear la eliminación selectiva de las mitocondrias dañadas, utilizando un enfoque de microscopía de video de lapso de tiempo.

Introducción

La macro autofagia es un proceso intracelular que implica la degradación catabólica de componentes celulares dañados y disfuncionales, como orgánulos y proteínas, con el propósito de reciclar o producir energía. Para iniciar este proceso metabólico, la célula engulle los componentes celulares dañados en una estructura de doble membrana, conocida como autofagosoma, que se fusiona con un lisosoma y su contenido se degrada y recicla 1,2. Hay dos tipos principales de autofagia, la no selectiva y la selectiva. El proceso de autofagia no selectiva ocurre cuando la célula se encuentra bajo condiciones de privación de nutrientes y necesita buscar nutrientes esenciales y energía. Sin embargo, la autofagia selectiva se produce para mediar la eliminación de orgánulos y proteínas disfuncionales/dañados que, de otro modo, podrían ser tóxicos. Uno de los procesos de autofagia selectiva más estudiados es la eliminación de mitocondrias, denominada mitofagia 1,3-5.

Las mitocondrias son los orgánulos centrales para el metabolismo celular y la fuente principal de trifosfato de adenosina (ATP) a través de la fosforilación oxidativa a través de la cadena de transporte de electrones, la oxidación de ácidos grasos y el ciclo del ácido tricarboxílico (TCA). Además, las mitocondrias regulan la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y liberan proteínas que participan en las vías de muerte celular 6-8.

PTEN-quinasa putativa 1 (PINK1) y Parkin RBR E3 ubiquitina ligasa (Parkin) son las proteínas clave implicadas en el proceso de mitofagia. Parkin puede proteger contra la muerte celular al mantener la célula sana a través del control de calidad mitocondrial9. Tras la pérdida del potencial de membrana mitocondrial, la parkina citosólica es reclutada por PINK1 para las mitocondrias. Este reclutamiento desencadena los eventos secuenciales de la mitofagia 10. Existe una amplia gama de pruebas de que la mitofagia es un proceso fundamental de control de calidad de las mitocondrias y las anomalías en este proceso impulsan la enfermedad 7. Por ejemplo, la enfermedad de Parkinson autosómica recesiva se ha asociado con mutaciones en los genes que codifican para Parkin y PINK1 (PARK2 y PINK1, respectivamente) 11. El control de calidad de la salud mitocondrial es esencial para la eliminación de las mitocondrias que contribuyen a la acumulación de ROS12. La presencia excesiva de ROS intracelulares puede provocar daños tanto en el ADN nuclear como en el mitocondrial (ADN y ADN mt, respectivamente).

Aquí, mostramos un enfoque de microscopía de video de lapso de tiempo para seguir la agregación de Parkin después de la inducción de mitofagia mediada por Parkin en fibroblastos embrionarios de ratón inmortalizados a través de la administración in vitro de cianuro de carbonilo 4-(trifluorometoxi)-fenilhidrazona (FCCP), un agente de desacoplamiento. FCCP interrumpe la síntesis de ATP al cortocircuitar protones a través de la membrana mitocondrial externa y, por lo tanto, desacoplar la fosforilación oxidativa de la cadena de transporte de electrones 13. El desencadenamiento de la despolarización de la membrana mitocondrial conduce a la interrupción de las mitocondrias y a la eliminación selectiva dependiente de Parkin. Por lo tanto, la transfectación de las células de interés con un vector de expresión que codifica Parkin fusionado con un marcador fluorescente (proteína fluorescente amarilla mejorada, EYFP) se puede utilizar como una marca fluorescente para seguir el reclutamiento de Parkin durante el proceso mitofágico. Con el fin de visualizar las mitocondrias, co-transfectamos pDsRed2-Mito, que codifica la proteína fluorescente roja (DsRed2) que contiene una secuencia de diana mitocondrial de la subunidad VIII de la citocromo c oxidasa (Mito). pDsRed2-Mito está diseñado para el marcaje fluorescente de mitocondrias14. El tiempo requerido para la translocación de Parkin a la membrana mitocondrial se puede medir y proporciona una medida indirecta de la salud celular. Por ejemplo, podemos decir que si una línea celular eliminada para un gen particular de interés muestra un reclutamiento más rápido o más lento de Parkin después de la inducción de la mitofagia por FCCP, ese producto génico sería un jugador clave para mantener las tasas metabólicas de la célula en el estado fisiológico y prevenir el desarrollo de enfermedades. Por lo tanto, la microscopía de video de lapso de tiempo proporciona una herramienta muy poderosa para aplicaciones de investigación básica y clínica para seguir la dinámica de las proteínas marcadas durante sus procesos moleculares y comprender cómo se ven afectados estos procesos durante una condición patológica.

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Protocolo

1. La electroporación de fibroblastos con ambos vectores de expresión EYFP-Parkin y pDsRed2-Mito

  1. Cultivar las células de fibroblastos de embriones de ratón inmortalizada en 10 centímetro placa de cultivo de tejidos utilizando DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco) suplementado con 10% de suero fetal bovino, 2 mmol / l de L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, y 100 mg / ml estreptomicina en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO 2 a 37 ° C.
    1. En la confluencia de células 80%, desechar el medio DMEM completo por succión estéril y añadir 10 ml de solución tampón de fosfato 1x estéril (PBS) (80 g de NaCl, 2,0 g de KCl, 14,4 g de Na 2 HPO 4, 2,4 g de KH 2 PO 4 y 1 L de H2O destilada, pH: 7,4).
    2. Desechar el PBS mediante aspiración estéril y añadir 1 ml de tripsina-EDTA 0,25%. Incubar la placa a 37 ° C hasta que las células se separan (2-3 min). Añadir 4 ml de medio DMEM completo, volver a suspender las células y sacar 10 _6; l de la suspensión celular para el recuento hemocitómetro.
      NOTA: El hemocitómetro está diseñado de modo que el número de células en un conjunto de 16 cuadrados de las esquinas es equivalente al número de células x 10 4 / ml.
  2. Seed 1 x 10 6 células en 10 cm placas de cultivo de tejidos de 24 horas antes del proceso de electroporación.
  3. Descartar el medio DMEM completo por succión estéril y añadir 10 ml de PBS estéril. Desechar el PBS mediante aspiración estéril y añadir 1 ml de tripsina-EDTA 0,25%. Incubar la placa a 37 ° C hasta que las células se separan (2-3 min). Añadir 4 ml de medio completo DMEM y resuspender las células en un tubo de 15 ml.
  4. Girar las células hacia abajo a 250 xg durante 5 min usando una centrífuga refrigerada (4 ° C). Eliminar el sobrenadante por aspiración estéril y resuspender el precipitado en 1 ml de PBS estéril. Girar las células hacia abajo a 250 g durante 5 min a 4 ° C.
  5. Eliminar el sobrenadante por aspiración estéril, y añadir 100 l Of mezcla de solución para la electroporación (82 l de solución de electroporación V + 18 l de solución Suplementaria 1) al sedimento celular y resuspender suavemente el precipitado pipeteando (Para más detalles, consulte el Manual del usuario). Añadir 2 g de EYFP-Parkin (excitación / emisión 514/527) y 1 g pDsRed2-Mito (excitación / emisión 565/620) a la suspensión celular.
  6. Transferir la solución a la cubeta estéril utilizando un pasteur desechable (ambas herramientas se proporcionan con el kit) y electroporación utilizando el programa pre-establecido NIH / 3T3 T-030 (solo pulso, tensión de 200 V, la capacitancia 960 mF, tiempo de pulso de 20 milisegundos , el número de impulsos: 1).
  7. Inmediatamente después de la electroporación, añadir 500 l de medio DMEM completo pre-calentado fresco y sembrar la célula en un 6 cm de la placa de cultivo de tejidos en vivo de imágenes de grado y los incuban en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO 2 a 37 ° C durante 24 horas.

2. Tiempo-Lapso de microscopía de vídeo

  1. Ajuste la temperatura de la cámara del microscopio a 37 ° C antes de su uso.
  2. En este punto, preparar un medio específico de formación de imágenes en vivo de proceder con el protocolo experimental. Prepare el soporte de imágenes en vivo de la siguiente manera; mezclar DMEM-fenol libre suplementado con 10% de suero bovino fetal, 2 mmol / l de L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, y 100 mg / ml de estreptomicina. Pre-calentar el medio de imágenes en vivo a 37 ° C en un baño de agua.
  3. Descartar el medio de las células sometidas a electroporación por aspiración estéril y añadir 1 ml de medio de imágenes en vivo pre-calentado, utilizando una pipeta P1000 e incubar la placa durante 30 minutos a 37 ° C.
  4. Durante el período de placa de incubación, afluencia 5% de CO 2 en la cámara del microscopio ya a una temperatura estable de 37 ° C.
  5. Coloque la placa con las células a electroporación en la cámara del microscopio evitando movimientos u oscilaciones importantes.
  6. Mediante la interfaz de software, configurar el microscopio con el fin de detectar tanto Fluoreseñales scence de las proteínas de fusión codificadas por los vectores de co-transfectadas, EYFP-Parkin (rango de excitación de 495 a la 510 nm y el rango de emisión 520 a la 550 nm, verde) y el pDsRed2-Mito (máximo de excitación 558 nm y emisión máxima de 583 nm, rojo).
    1. Abra el software de microscopía de vídeo de lapso de tiempo. En el menú superior seleccionar el FITC para EYFP-Parkin y rodamina para pDsRed2-Mito. En el menú superior seleccionar el aumento (20X).
  7. El uso de la interfaz de software, buscar la única célula que expresa ambos vectores co-transfectadas y registrar la posición. Repita este paso hasta un mínimo de 10 células se recoge para cada condición experimental (grupo experimental).
    1. Seleccione el menú "Aplicaciones" y haga clic en Multi Adquisición dimensional. En las ventanas de adquisición multidimensional seleccionar los parámetros necesarios, tales como el número de adquisiciones, el intervalo de tiempo entre cada adquisición y la posición de la célula registrada. Haga clic en "Adquirir"Para iniciar el proceso de adquisición.
  8. Iniciar la adquisición basal de ambos EYFP-Parkin y la señal fluorescente DsRed2-Mito recogida de imágenes cada 5 min durante un intervalo total de 15 min.
  9. Para preparar el medio de imágenes en vivo pre-calentado con una concentración de FCCP dos veces mayor que la concentración final de trabajo (0,1 - 10 mM, dependiente del tipo de célula).
  10. Interrumpir el proceso de adquisición y añadir suavemente 1 ml de medio de imágenes en vivo pre-calentado con FCCP en la placa dentro de la cámara del microscopio utilizando una pipeta P1000.
  11. Reiniciar el proceso de adquisición, como se describe anteriormente, durante un periodo total de 3 horas, utilizando la posición de grabado. Guardar todas las imágenes adquiridas con el fin de analizarlas y crear un video del proceso mitophagic cuando la adquisición se ha terminado.

3. Análisis

  1. Recoge todas las imágenes adquiridas en formato "tiff" en un ordenador personal
  2. Abrir las imágenes con un suave gráficoWare y definir el intervalo temporal se produjeron de la mitocondrial inducida por despolarización con FCCP a la primera imagen que muestra el reclutamiento de Parkin en la membrana mitocondrial (Las imágenes se adquieren cada 5 min). Repita este análisis para cada celda en el grupo experimental.
  3. Etiquetar la primera celda de la columna en una hoja de cálculo con el nombre del grupo experimental. Para cada grupo experimental, medir los intervalos temporales para Parkin reclutamiento de un mínimo de 10 células. Hacer un promedio de los intervalos temporales calculadas para el reclutamiento Parkin y definir la desviación estándar para cada grupo experimental (media ± SD, n = 10).
    1. Organizar en columnas individuales de los intervalos temporales calculados. Cada columna contiene el n = 10 mediciones del grupo experimental.
    2. Seleccione el "promedio" de la función en el menú de fórmulas. Seleccionar los datos de la columna. Seleccione la función "desviación estándar" en el menú de fórmulas. select los datos de la columna.
  4. El uso de un enfoque estadístico, comparar los grupos experimentales aplicando el estadístico apropiado con el fin de definir una diferencia significativa en la dinámica de mitofagia entre los grupos experimentales. (Por ejemplo, dos grupos = t de Student prueba, tres o más grupos = ANOVA más un test post-hoc)

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Resultados

Aquí, nos muestran cómo la microscopía de vídeo de lapso de tiempo es una técnica poderosa que puede ser utilizado para seguir los acontecimientos moleculares de las proteínas con fluorescencia etiquetado en una sola célula. Los resultados representativos también muestran cómo esta técnica permite la adquisición de imágenes de alta calidad. Cuando las imágenes del proceso molecular, se obtienen, tenemos la oportunidad de analizar de diferentes maneras. Aquí, se analizan el intervalo de t...

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Discusión

La microscopía de lapso de tiempo se puede definir como la técnica que se extiende imágenes de células vivas de una sola observación en el tiempo a la observación de la dinámica celular durante largos períodos de tiempo. Esta metodología se distingue de un simple o confocal microscopia de células vivas, ya que permite al observador identificar en tiempo real una sola proteína fluorescente con etiquetas y siga su dinámica dentro de una sola célula viva. De hecho, la microscopía confocal puede identifica fácilmente proteí...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado en parte por subvenciones de los NIH (1R01CA137494, R01CA132115, R01CA086072 a R.G.P.), el Centro Oncológico Kimmel P30CA056036 de subvención principal del Centro Oncológico de los NIH (R.G.P.), una subvención de la Fundación para la Investigación del Cáncer de Mama, generosas subvenciones del Dr. Ralph y Marian C. Falk Medical Research Trust (R.G.P.) y una subvención del Departamento de Salud de Pensilvania (R.G.P.). En parte, este trabajo fue financiado por una beca postdoctoral (G.D.) de la American Italian Cancer Foundation y Bioimaging Shared Resource del Sidney Kimmel Cancer Center (NCI 5, P30, CA-56036). El Departamento renuncia específicamente a la responsabilidad por un análisis, interpretaciones o conclusiones. No hay conflictos de intereses asociados con este manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
DMEMCorning Life Science10-013-CVPrecalentamiento en 37 ° C antes
de usar DMEM sin fenolCorning Life Science17-205-CVPrecalentar a 37 ° C antes de usar
Suero fetal bovinoSigma-AldrichF2442Precalentamiento a 37 ° C antes
de usar L-GlutaminaGibco25030Precalentar a 37 ° C antes de usar
Penicilina/estreptomicinaCorning Life Science30-002-CIPrecalentamiento a 37 ° C antes de usar
el vector de expresión EYFP-PARKINAddgene23955
pDsRed2-Mito vector de expresiónClontech632421
Nucleofector 2B dispositivoLONZAAAD-1001S
Nucleofector para kit R NIH/3T3LONZAVCA-1001
ZEISS AXIOVERT 200M microscopio invertidoCARL ZEISS
Cianuro de carbonilo 4-(trifluorometoxi)-fenilhidrazona (FCCP)Sigma-AldrichC2920
MetaMorphMolecularDevices Constructor
ImageJInstituto Nacional de SaludConstructor experimental
experimental

Referencias

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