Lapso de tiempo-microscopía de vídeo para la Evaluación de EYFP-Parkin agregación como un marcador para celular mitofagia

Resumen

Aquí, describimos en detalle un enfoque de microscopía de video de lapso de tiempo para medir el reclutamiento temporal de EYFP-Parkin durante la eliminación selectiva de mitocondrias dañadas. Este proceso dinámico de eliminación de mitocondrias dañadas dependiente de EYFP-Parkin se puede utilizar como indicador de la salud celular en diferentes condiciones experimentales.

Resumen

La microscopía de video time-lapse se puede definir como la obtención de imágenes en tiempo real de células vivas. Esta técnica se basa en la recopilación de imágenes en diferentes puntos temporales. Los intervalos de tiempo se pueden establecer a través de una interfaz de computadora que controla la cámara integrada en el microscopio. Este tipo de microscopía requiere tanto la capacidad de adquirir eventos muy rápidos como la señal generada por la estructura celular observada durante estos eventos. Una vez que se han recopilado las imágenes, se ensambla una película de todo el experimento para mostrar la dinámica de los eventos moleculares de interés. La microscopía de video de lapso de tiempo tiene una amplia gama de aplicaciones en el campo de la investigación biomédica y es una herramienta poderosa y única para seguir la dinámica de los eventos celulares en tiempo real. A través de esta técnica, podemos evaluar eventos celulares como la migración, la división, la transducción de señales, el crecimiento y la muerte. Además, mediante el uso de sondas moleculares fluorescentes podemos marcar moléculas específicas, como ADN, ARN o proteínas, y seguirlas a través de sus vías y funciones moleculares. La microscopía de video de lapso de tiempo tiene múltiples ventajas, la principal es la capacidad de recopilar datos a nivel de una sola célula, lo que la convierte en una tecnología única para la investigación en el campo de la biología celular. Sin embargo, la microscopía de video de lapso de tiempo tiene limitaciones que pueden interferir con la adquisición de imágenes de alta calidad. Las imágenes pueden verse comprometidas por ambos factores externos; fluctuaciones de temperatura, vibraciones, humedad y factores internos; pH, motilidad celular. En este artículo, describimos un protocolo para la adquisición dinámica de una proteína específica, Parkin, fusionada con la proteína fluorescente amarilla mejorada (EYFP) con el fin de rastrear la eliminación selectiva de las mitocondrias dañadas, utilizando un enfoque de microscopía de video de lapso de tiempo.

Introducción

La macro autofagia es un proceso intracelular que implica la degradación catabólica de componentes celulares dañados y disfuncionales, como orgánulos y proteínas, con el propósito de reciclar o producir energía. Para iniciar este proceso metabólico, la célula engulle los componentes celulares dañados en una estructura de doble membrana, conocida como autofagosoma, que se fusiona con un lisosoma y su contenido se degrada y recicla ^1,2. Hay dos tipos principales de autofagia, la no selectiva y la selectiva. El proceso de autofagia no selectiva ocurre cuando la célula se encuentra bajo condiciones de privación de nutrientes y necesita buscar nutrientes esencia....

Protocolo

1. La electroporación de fibroblastos con ambos vectores de expresión EYFP-Parkin y pDsRed2-Mito

1. Cultivar las células de fibroblastos de embriones de ratón inmortalizada en 10 centímetro placa de cultivo de tejidos utilizando DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco) suplementado con 10% de suero fetal bovino, 2 mmol / l de L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, y 100 mg / ml estreptomicina en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO ₂ a 37 ° C.
   1. En la confluencia de células 80%, desechar el medio DMEM completo por succión estéril y añadir 10 ml de solución tampón de fosfato 1x estéril (PBS) (80 g de NaCl, 2,0 g de KCl, 14,4 ....

Resultados

Aquí, nos muestran cómo la microscopía de vídeo de lapso de tiempo es una técnica poderosa que puede ser utilizado para seguir los acontecimientos moleculares de las proteínas con fluorescencia etiquetado en una sola célula. Los resultados representativos también muestran cómo esta técnica permite la adquisición de imágenes de alta calidad. Cuando las imágenes del proceso molecular, se obtienen, tenemos la oportunidad de analizar de diferentes maneras. Aquí, se analizan el intervalo de t.......

Discusión

La microscopía de lapso de tiempo se puede definir como la técnica que se extiende imágenes de células vivas de una sola observación en el tiempo a la observación de la dinámica celular durante largos períodos de tiempo. Esta metodología se distingue de un simple o confocal microscopia de células vivas, ya que permite al observador identificar en tiempo real una sola proteína fluorescente con etiquetas y siga su dinámica dentro de una sola célula viva. De hecho, la microscopía confocal puede identifica fácilmente proteí.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DMEM	Corning Life Science	10-013-CV	Precalentamiento en 37 ° C antes
de usar DMEM sin fenol	Corning Life Science	17-205-CV	Precalentar a 37 ° C antes de usar
Suero fetal bovino	Sigma-Aldrich	F2442	Precalentamiento a 37 ° C antes
de usar L-Glutamina	Gibco	25030	Precalentar a 37 ° C antes de usar
Penicilina/estreptomicina	Corning Life Science	30-002-CI	Precalentamiento a 37 ° C antes de usar
el vector de expresión EYFP-PARKIN	Addgene	23955
pDsRed2-Mito vector de expresión	Clontech	632421
Nucleofector 2B dispositivo	LONZA	AAD-1001S
Nucleofector para kit R NIH/3T3	LONZA	VCA-1001
ZEISS AXIOVERT 200M microscopio invertido	CARL ZEISS
Cianuro de carbonilo 4-(trifluorometoxi)-fenilhidrazona (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
MetaMorph	Molecular	Devices Constructor
ImageJ	Instituto Nacional de Salud	Constructor experimental

experimental