Las proyecciones supraespinales son importantes para la percepción del dolor y otros comportamientos, y las fibras serotoninérgicas son uno de estos sistemas de fibras. El presente estudio se centró en la aplicación del protocolo combinado CLARITY/CUBIC a la médula espinal de ratón con el fin de investigar la terminación de estas fibras serotoninérgicas.
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Artículo de método
Las fibras serotoninérgicos proyección de imagen en la médula espinal de ratón El uso de la claridad / Técnica CÚBICO
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Resumen
Resumen
Las fibras largas de descender a la médula espinal son esenciales para la locomoción, la percepción del dolor, y otros comportamientos. El patrón de terminación de fibras en la médula espinal de la mayoría de estos sistemas de fibra no se han investigado a fondo en cualquier especie. fibras serotoninérgicos, que se proyectan a la médula espinal, se han estudiado en ratas y zarigüeyas en secciones histológicas y su significado funcional se ha deducido en base a su patrón de terminación de fibras en la médula espinal. Con el desarrollo de la claridad y técnicas cúbico, es posible investigar este sistema de fibras y su distribución en la médula espinal, que es probable que revelar características hasta ahora desconocidas de las vías supraespinales serotoninérgicos. A continuación, ofrecemos un protocolo detallado para obtener imágenes de las fibras serotoninérgicos en la médula espinal de ratón usando la claridad combinado y técnicas cúbicos. El método consiste en la perfusión de un ratón con una solución de hidrogel y la clarificación del tejido con una combinación de la limpieza de los reactivos. el tejido de la médula espinal fue despejada en menos de dos semanas, y la posterior tinción de inmunofluorescencia contra la serotonina se completó en menos de diez días. Con un microscopio de fluorescencia multi-fotón, el tejido fue escaneada y una imagen 3D se reconstruyó usando software Osirix.
Introducción
Las proyecciones supraespinales son responsables de la modulación de diversos comportamientos como la percepción del dolor. Una de las proyecciones portadoras de información nociceptiva contiene fibras serotoninérgicas, que se originan en el rafe posterior del cerebro y los núcleos reticulares adyacentes1,2. Los estudios fisiológicos y farmacológicos han demostrado un aumento de la liberación de serotonina en el asta dorsal de la médula espinal después de la estimulación eléctrica de los núcleos del rafe en el cerebro posterior3-5. En la rata y la zarigüeya, las fibras rafespinales serotoninérgicas tienen terminales densos, no solo en el cuerno d....
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Protocolo
Ética Declaración: Todos los procedimientos que involucran sujetos animales siguen las directrices del Comité de Cuidado de Animales y Ética (ACEC) en la Universidad de Nueva Gales del Sur (el número ACEC aprobado es de 14 / 94A).
1. Preparación de la cuerda del ratón transparente espinal
- Preparación de hielo solución de hidrogel frío
- Preparación de solución de paraformaldehído al 16% (PFA)
- Añadir 16 g de polvo en 70 ml de paraformaldehído-calentado previamente en agua destilada (50-55 ° C) y se agita en un agitador magnético se calienta hasta que se disuelva paraformaldehído. Nota: No permita que la solución ....
- Preparación de solución de paraformaldehído al 16% (PFA)
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Resultados
Esta sección muestra los resultados de la tinción de anticuerpos de la serotonina en la médula espinal de ratón transparente usando una combinación de la claridad y protocolos cúbicos. Se demuestra que las fibras serotoninérgicos están presentes en todas las láminas de la médula espinal con un predominio en la parte ventral del asta ventral (Figura 1, también ver video 1). El tejido de control no tuvo fibras positivos (resultado no se muestra). En el ast.......
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Discusión
El protocolo descrito se muestra cómo las fibras de imagen serotoninérgicos en la médula espinal de ratón con la claridad combinado y técnicas cúbico. Se introduce un proceso de compensación más rápido en comparación con el protocolo de compensación pasiva desarrollada por Cheung et al. 14 y Tomer et al. 15 y permite que el tejido de la médula espinal a estar bien apoyado por el hidrogel durante la limpieza.
Un paso importante durante la fijación de la.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Centro de Excelencia para la Función Cerebral Integrativa del Consejo de Investigación Australiano (ARC Centre Grant CE140100007), una subvención del proyecto NHMRC (#1086643). El Prof. George Paxinos cuenta con el apoyo de una beca Senior Principal Research Fellow del NHMRC (#1043626).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Fotoiniciador VA044 | Wako | va-044/225-02111 | http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm |
| solución de acrilamida al 40% | Bio Rad | 161-0140 | http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0140-40-acrylamide-solution |
| solución al 2% Bis | Bio Rad | 161-0142 | http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0142-2-bis-solution?parentCategoryGUID=5e7a4f31- 879c-4d63-ba0b-82556a0ccf1d |
| paraformaldehído | Sigma | 158127 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/158127?lang=en®ion=AU |
| urea | Merck Millipore | 66612 | http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Urea---CAS-57-13-6---Calbiochem,EMD_BIO-66612 |
| N,N,N',N'-tetrakis (2-hidroxipropil) etilendiamina | Merck Millipore | 821940 | http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetra-2-propanol,MDA_CHEM-821940 |
| Triton-X 100 | Merck Millipore | 648462 | http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/TRITON®-X-100-Detergent---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648462 |
| sacarosa | Sigma | S0389 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s0389?lang=en®ion=AU |
| anticuerpo de serotonina | Merck Millipore | AB938 | http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Anti-Serotonin-Antibody,MM_NF-AB938 |
| anti conejo de cabra Anticuerpo secundario IgG (H + L), Alexa Fluor & reg; 594 conjugado | Life Technologies | A-11012 https://www.lifetechnologies.com/order/genome-database/antibody/Rabbit-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012 | |
| microscopio multifotónico | Leica Leica | TCS SP5 MP STED http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/details/product/leica-tcs-sp5-mp/ |
Referencias
- Rivot, J. P., Chaouch, A., Besson, J. M. Nucleus raphe magnus modulation of response of rat dorsal horn neurons to unmyelinated fiber inputs: partial involvement of serotonergic pathways. J Neurophysiol. 44 (6), 1039-1057 (1980).
- Liang, H., Paxinos, G., Watson, C.
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Reimpresiones y permisos
