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Artículo de método

Las fibras serotoninérgicos proyección de imagen en la médula espinal de ratón El uso de la claridad / Técnica CÚBICO

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DOI:

10.3791/53673

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26 de febrero de 2016

 ,  , 
1Brain Structure and Function Group, Neuroscience Research Australia, 2School of Medical Sciences, The University of New South Wales

En este artículo

Resumen

Las proyecciones supraespinales son importantes para la percepción del dolor y otros comportamientos, y las fibras serotoninérgicas son uno de estos sistemas de fibras. El presente estudio se centró en la aplicación del protocolo combinado CLARITY/CUBIC a la médula espinal de ratón con el fin de investigar la terminación de estas fibras serotoninérgicas.

Resumen

Las fibras largas de descender a la médula espinal son esenciales para la locomoción, la percepción del dolor, y otros comportamientos. El patrón de terminación de fibras en la médula espinal de la mayoría de estos sistemas de fibra no se han investigado a fondo en cualquier especie. fibras serotoninérgicos, que se proyectan a la médula espinal, se han estudiado en ratas y zarigüeyas en secciones histológicas y su significado funcional se ha deducido en base a su patrón de terminación de fibras en la médula espinal. Con el desarrollo de la claridad y técnicas cúbico, es posible investigar este sistema de fibras y su distribución en la médula espinal, que es probable que revelar características hasta ahora desconocidas de las vías supraespinales serotoninérgicos. A continuación, ofrecemos un protocolo detallado para obtener imágenes de las fibras serotoninérgicos en la médula espinal de ratón usando la claridad combinado y técnicas cúbicos. El método consiste en la perfusión de un ratón con una solución de hidrogel y la clarificación del tejido con una combinación de la limpieza de los reactivos. el tejido de la médula espinal fue despejada en menos de dos semanas, y la posterior tinción de inmunofluorescencia contra la serotonina se completó en menos de diez días. Con un microscopio de fluorescencia multi-fotón, el tejido fue escaneada y una imagen 3D se reconstruyó usando software Osirix.

Introducción

Las proyecciones supraespinales son responsables de la modulación de diversos comportamientos como la percepción del dolor. Una de las proyecciones portadoras de información nociceptiva contiene fibras serotoninérgicas, que se originan en el rafe posterior del cerebro y los núcleos reticulares adyacentes1,2. Los estudios fisiológicos y farmacológicos han demostrado un aumento de la liberación de serotonina en el asta dorsal de la médula espinal después de la estimulación eléctrica de los núcleos del rafe en el cerebro posterior3-5. En la rata y la zarigüeya, las fibras rafespinales serotoninérgicas tienen terminales densos, no solo en el cuerno dorsal6-8, sino también en la zona intermedia7,9,10, el cuerno ventral7,11 e incluso la lámina 1012,13. No hay estudios similares en el ratón. El presente estudio tuvo como objetivo mapear el patrón de terminación de las fibras serotoninérgicas que surgen de los núcleos del rafe del cerebro posterior y sus núcleos reticulares adyacentes en la médula espinal del ratón utilizando el método CLARITY14 recientemente publicado y su modificación: CUBIC15.

La inmunohistoquímica convencional de fluorescencia o peroxidasa de la médula espinal muestra claramente la distribución de las fibras serotoninérgicas en la sustancia gris de la médula espinal en secciones transversales de 30-40 μm de grosor. Sin embargo, este enfoque no muestra la continuidad de los tractos de fibras serotoninérgicas en la sustancia blanca y sus colaterales en la sustancia gris. Aunque la reconstrucción en 3D de secciones histológicas ha avanzado en nuestro conocimiento de los tractos fibrosos, sigue siendo un desafío para los histólogos y anatomistas seguir un solo tracto debido a las pequeñas distorsiones en el tejido causadas por el corte. Para sortear este obstáculo, varios investigadores han desarrollado varios protocolos para hacer que toda la estructura del tejido sea transparente y recopilar una imagen del tejido inalterado en un solo archivode video 17-21. Hasta el momento, la técnica de hidrogel tisular (CLARITY), transparente, intercambiado por lípidos, híbrido con acrilamida, compatible con la imagen/inmunotinción, desarrollada por el grupo14,15 de Deisseroth, así como CUBIC, desarrollada por Susaki et al16, son las más exitosas. Desde la publicación de los protocolos, muchos investigadores han comenzado a utilizar estas técnicas para investigar diversos aspectos de los tejidos biológicos, incluyendo, no solo el cerebro22-25, sino también el corazón, los riñones, el intestino y los pulmones26,27.

Mediante la fijación de la médula espinal del ratón con la solución de hidrogel (CLARITY) y la eliminación con los reactivos CUBIC (que es un método mucho más rápido que el descrito por el protocolo CLARITY original14,15), se eliminó un bloque de tejido de la médula espinal de 2-3 mm de largo en dos semanas y se completó la tinción de inmunofluorescencia para la serotonina en ocho días. Con solo una combinación de agentes químicos, la inmunohistoquímica convencional se puede utilizar para crear una imagen de tractos de fibras individuales en un archivo de video 3D en aproximadamente un mes.

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Protocolo

Ética Declaración: Todos los procedimientos que involucran sujetos animales siguen las directrices del Comité de Cuidado de Animales y Ética (ACEC) en la Universidad de Nueva Gales del Sur (el número ACEC aprobado es de 14 / 94A).

1. Preparación de la cuerda del ratón transparente espinal

  1. Preparación de hielo solución de hidrogel frío
    1. Preparación de solución de paraformaldehído al 16% (PFA)
      1. Añadir 16 g de polvo en 70 ml de paraformaldehído-calentado previamente en agua destilada (50-55 ° C) y se agita en un agitador magnético se calienta hasta que se disuelva paraformaldehído. Nota: No permita que la solución se caliente más de 55 ° C y tenga en cuenta que paraformaldehído es tóxico.
      2. Transferir la solución de paraformaldehído a un cilindro y añadir agua destilada hasta 100 ml. Se enfría la solución de paraformaldehído usando un 4 ° C refrigerador.
    2. Disolver 125 mg iniciador VA-044 en 26,25 ml de agua destilada y se enfría la solución en un 4° C nevera.
    3. solución fresca 5 ml de acrilamida (40%), 1,25 ml de solución de bis (2%) (PRECAUCIÓN: Bis y soluciones de acrilamida son tóxicos, puede causar defectos genéticos o cáncer), 5 ml 10x PBS, solución PFA 12,5 ml 16%, y el solución de iniciador VA-044 en hielo.
    4. Mezclar las soluciones anteriores en hielo.
      Nota: el volumen total es de 50 ml.
  2. Perfusión y la Colección de la cuerda del ratón espinal
    1. Anestesiar un ratón con una inyección intraperitoneal de ketamina (80 mg / kg) y xyzaline (5 mg / kg) diluido en solución salina normal al 0,9%. La dosificación para el ratón puede ser inferior a la de las ratas.
    2. En una superficie de plástico adecuado en una campana extractora, fijar las extremidades del ratón fuera del cuerpo (cinta adhesiva es eficaz) una vez que el ratón no responde a una pizca de su piel del pie.
    3. Cortar la piel del ratón sobre el pecho y luego el pecho hueso para exponer el corazón con una tijera.
    4. Usando una bomba peristáltica, con una aguja de 25 G unida a the extremo del tubo, inserte la aguja en el ventrículo izquierdo del corazón, snip la aurícula derecha para crear un punto de salida para la sangre y luego comenzar el lavado con solución salina normal 40 ml de 0,9% a razón de aproximadamente 10 ml / min.
    5. Cuando se haya completado, perfundir el ratón con 35 ml de solución de hidrogel de hielo frío.
      Nota: la perfusión a una velocidad de 10 ml / min para evitar la hinchazón del tejido nervioso.
    6. Incisión en la piel sobre la parte posterior con una cuchilla y luego retire los músculos al lado del vertebrado. Después de cortar los arcos vertebrales en un lado y dándoles la vuelta hacia el otro lado, tomar la médula espinal de la columna vertebral con una multa de tijera.
  3. Borrado de la cuerda del ratón espinal
    1. Coloque la médula espinal en 15 ml de solución de hidrogel durante la noche a 4 ° C.
    2. Eliminar 10 ml de la solución de hidrogel y verter el resto de la solución con los segmentos de la médula espinal a un tubo de 5 ml. Llenar el tubo 5 ml con la solución de hidrogel hasta que esté completamente lleno.
    3. Estirar un pequeño trozo de Parafilm sobre la parte superior del tubo de 5 ml y luego envolver Parafilm alrededor del cuello del tubo. Nota: Asegúrese de que los contactos parafilm la solución de hidrogel y no haya burbujas entre la solución de hidrogel y la parafina.
    4. Poner el tubo de 5 ml en un 37   ° C horno durante la noche. Observe la solución de hidrogel hasta que se convierte en un gel.
    5. Tome el tubo de 5 ml del horno y quitar el gel del tubo con una llave (tal como una punta de pipeta 1 ml pala). Quitar el gel a partir del tejido de la médula espinal por pegar el tejido grueso para el gel y luego tomar el papel grueso de distancia (el gel se adhiere al tejido y, por tanto, será eliminado por el tejido).
    6. Después de quitar el gel a partir del tejido de la médula espinal, lavar la médula espinal 4 veces con 1 x PBS (pH 7,4) durante 24 horas en un agitador.
    7. Preparar la solución de limpieza CUBIC disolviendo 3,85 g de urea y 3,85 g de N, N, N ', N'-tetrakis (2-hidroxipropil) ethylenediamine en 5,38 ml de agua destilada.
      Nota: Se utiliza un agitador caliente. Añadir 2,31 g de polietilenglicol mono-p-isooctilfenil éter / Triton X-100 a la solución una vez que es claro y se enfría a temperatura ambiente.
      Nota: 10 g de estos tres productos químicos son de un ratón.
    8. Cortar la médula espinal de ratón coronal en 2-3 mm de largo segmentos con una hoja de afeitar y ponerlas en 5 ml de la solución de aclaramiento CÚBICO anteriormente. Colocar en un agitador en el horno a 37   ° C durante 3 días.
    9. Tres días más tarde, cambiar la solución de intercambio de información para una nueva. Nota: la solución anterior se prepara antes de su uso.
    10. Dos o tres días más tarde después de actualizar la solución de aclaramiento cúbico, comprobar la transparencia del tejido contra un papel con tipo de letra 8 letras. Si es transparente, las letras se pueden ver a través del tejido despejado. Eliminar la solución de compensación y añadir 4 ml de PBST (0,1% Triton-X100) para lavar el tejido 4 veces al día (cada 6 horas).

2. La tinción de inmunofluorescencia

  1. Incubar los segmentos de la médula espinal en la solución de anticuerpo primario (anti-serotonina, criado en conejo, diluido 1: 100 en PBST) durante 3 días en un agitador en un horno de 37 ° C.
  2. Eliminar la solución de anticuerpo y añadir 4 ml de PBST (0,1% Triton-X100) para lavar los segmentos de la médula espinal 4 veces al día (cada 6 horas) en un horno a 37 ° C.
  3. Quitar la solución PBST y agregar la solución de anticuerpo secundario (conjugado de cabra 594 IgG anti-conejo, diluido 1: 100 en PBST) incubar el tejido durante 3 días en un agitador en un horno de 37 ° C.
  4. Retirar la solución de anticuerpo secundario y añadir 4 ml de PBST para lavar los segmentos de la médula espinal 4 veces al día (cada 6 horas) en un agitador en un horno de 37 ° C. Al día siguiente, el tejido está listo para la imagen.

3. Imaging

  1. Eliminar la solución de PBST y añadir 4 ml de 85% de glicerol para hacer que el índice de refracción del tejido uniforme.
  2. Comprobar la claridad del tejido. Una vez que es evidente en aproximadamente 1 hora, poner el tejido sobre un gran tobogán, vidrio delgado que se ajusta el bastidor de soporte del microscopio de fluorescencia de múltiples fotos.
  3. Ponga unas gotas de 85% de glicerol al lado del tejido de la médula espinal y el cubreobjetos con un vaso cubreobjetos 22 x 50 mm 2.
    Nota: La orientación de la médula espinal decide cómo la imagen se parece.
  4. Ponga el portaobjetos de vidrio en el bastidor de soporte del microscopio de fluorescencia de múltiples fotones y mover el tejido en la vía de la luz.
  5. Elija el helio-neón línea de láser 594 nm y ajustar la intensidad del láser al nivel óptimo marcando el brillo de la señal positiva en la imagen en vivo.
  6. Seleccionar el área de escaneo del tejido de la médula espinal utilizando el objetivo 20X (en agua, NA 0,7) y se preparan para crear una pila Z, y la profundidad de cada paso se establece en 3 m.
  7. Analiza el tejido desde la parte superior a la parte inferior de la pila Z bajo el objec 20Xtivo y luego objetivo 63X (en aceite, NA 1,4) (tamaño del paso fue de 1 m), respectivamente. Reconstruir videos en 3D utilizando un software de 3D ​​28.

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Resultados

Esta sección muestra los resultados de la tinción de anticuerpos de la serotonina en la médula espinal de ratón transparente usando una combinación de la claridad y protocolos cúbicos. Se demuestra que las fibras serotoninérgicos están presentes en todas las láminas de la médula espinal con un predominio en la parte ventral del asta ventral (Figura 1, también ver video 1). El tejido de control no tuvo fibras positivos (resultado no se muestra). En el ast...

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Discusión

El protocolo descrito se muestra cómo las fibras de imagen serotoninérgicos en la médula espinal de ratón con la claridad combinado y técnicas cúbico. Se introduce un proceso de compensación más rápido en comparación con el protocolo de compensación pasiva desarrollada por Cheung et al. 14 y Tomer et al. 15 y permite que el tejido de la médula espinal a estar bien apoyado por el hidrogel durante la limpieza.

Un paso importante durante la fijación de la...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Centro de Excelencia para la Función Cerebral Integrativa del Consejo de Investigación Australiano (ARC Centre Grant CE140100007), una subvención del proyecto NHMRC (#1086643). El Prof. George Paxinos cuenta con el apoyo de una beca Senior Principal Research Fellow del NHMRC (#1043626).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Fotoiniciador VA044Wakova-044/225-02111http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm
solución de acrilamida al 40%Bio Rad161-0140http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0140-40-acrylamide-solution
solución al 2% BisBio Rad161-0142http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0142-2-bis-solution?parentCategoryGUID=5e7a4f31-
879c-4d63-ba0b-82556a0ccf1d
paraformaldehídoSigma158127http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/158127?lang=en®ion=AU
ureaMerck Millipore66612http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Urea---CAS-57-13-6---Calbiochem,EMD_BIO-66612
N,N,N',N'-tetrakis (2-hidroxipropil) etilendiaminaMerck Millipore821940http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetra-2-propanol,MDA_CHEM-821940
Triton-X 100Merck Millipore648462http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/TRITON®-X-100-Detergent---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648462
sacarosaSigmaS0389http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s0389?lang=en®ion=AU
anticuerpo de serotoninaMerck MilliporeAB938http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Anti-Serotonin-Antibody,MM_NF-AB938
anti conejo de cabra Anticuerpo secundario IgG (H + L), Alexa Fluor & reg; 594 conjugadoLife Technologies  A-11012 https://www.lifetechnologies.com/order/genome-database/antibody/Rabbit-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012
microscopio multifotónicoLeica LeicaTCS SP5 MP STED http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/details/product/leica-tcs-sp5-mp/

Referencias

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