Artículo de método

Síntesis de Cd-libre EAD / ZnS puntos cuánticos Adecuado para aplicaciones biomédicas

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DOI:

10.3791/53684

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6 de febrero de 2016

 ,  , 
1Department of Chemistry, Missouri State University, 2Center for Molecular Microscopy, Leidos Biomedical Research, Inc., Frederick National Laboratory for Cancer Research

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Resumen

En este protocolo, se detalla la síntesis de puntos cuánticos (QDs) InP/ZnS libres de Cd. Los QD basados en InP están ganando popularidad debido a la toxicidad de los iones Cd2+ que pueden liberarse a través de la degradación de nanopartículas. Después de la síntesis, los QD se solubilizan en agua utilizando un polímero anfifílico para su uso en aplicaciones biomédicas.

Resumen

Los nanocristales fluorescentes, específicamente los puntos cuánticos, han sido una herramienta útil para muchas aplicaciones biomédicas. Para un uso exitoso en sistemas biológicos, los puntos cuánticos deben ser altamente fluorescentes y de tamaño pequeño/monodisperso. Si bien los puntos cuánticos basados en cadmio de uso común poseen estas cualidades, son potencialmente tóxicos debido a la posible liberación de iones Cd2+ a través de la degradación de nanopartículas. Los puntos cuánticos basados en indio, específicamente InP/ZnS, se han explorado recientemente como una alternativa viable a los puntos cuánticos basados en cadmio debido a sus características de fluorescencia y tamaño relativamente similares. La síntesis presentada aquí utiliza técnicas estándar de inyección en caliente para un crecimiento efectivo de nanopartículas; Sin embargo, las propiedades de las nanopartículas, como el tamaño, la longitud de onda de emisión y la intensidad de la emisión, pueden cambiar drásticamente debido a pequeños cambios en las condiciones de reacción. Por lo tanto, las condiciones de reacción, como la temperatura, la duración de la reacción y la concentración de precursores, deben mantenerse con precisión para producir productos reproducibles. Debido a que los puntos cuánticos no son inherentemente solubles en soluciones acuosas, también deben someterse a una modificación de la superficie para impartir solubilidad en agua. En este protocolo, se utiliza un polímero anfifílico para interactuar tanto con ligandos hidrofóbicos en la superficie del punto cuántico como con moléculas de agua solvente a granel. Aquí, se proporciona un protocolo detallado para la síntesis de puntos cuánticos InP/ZnS altamente fluorescentes que son adecuados para su uso en aplicaciones biomédicas.

Introducción

Los puntos cuánticos (QDs) son semiconductores nanocristales que exhiben propiedades fluorescentes cuando se irradian con luz 1. Debido a su pequeño tamaño (2-5 nm), que es similar a muchas biomoléculas más grandes, y la facilidad de biofuncionalización, los puntos cuánticos son una herramienta muy atractiva para aplicaciones biomédicas. Ellos han encontrado uso en el etiquetado biológica, una sola molécula de imágenes de células vivas, la administración de fármacos, de formación de imágenes in vivo, la detección de patógenos, y el seguimiento de la célula, entre muchos otros usos 2-8.

Los puntos cuánticos basados ​​en Cd se han utilizado más comúnmente en aplicaciones biomédicas debido a su intensa fluorescencia y reducidos anchos de pico de emisión 9. Sin embargo, han surgido preocupaciones debido a la toxicidad potencial de los iones Cd2 + 10 que puede ser puesto en libertad debido a la degradación de la nanopartícula. Recientemente, puntos cuánticos basados ​​en InP se han explorado como una alternativa a los puntos cuánticos basados ​​en Cd porque mantienen muchas de las características de fluorescenciaCd de puntos cuánticos basados ​​y puede ser más biocompatible 11. Puntos cuánticos basados ​​en Cd se han encontrado para ser significativamente más tóxico que los puntos cuánticos basados ​​en InP en ensayos in vitro en concentraciones tan bajas como 10 pM, después de sólo 48 h 11.

El color de los puntos cuánticos de emisión de fluorescencia es de tamaño ajustable-1. Es decir, como el tamaño de los aumentos de QD, la emisión de fluorescencia es desplazada al rojo. El tamaño y las dimensiones dispersidad de los productos QD puede ser modificado cambiando la temperatura, duración de la reacción, o las condiciones de concentración de precursor durante la reacción 12. Mientras que el pico de emisión de los puntos cuánticos InP es típicamente más amplio y menos intenso que los puntos cuánticos basados ​​en Cd, InP puntos cuánticos puede hacerse en una gran variedad de colores diseñados para evitar el solapamiento espectral, y son lo suficientemente intensa para la mayoría de aplicaciones biomédicas 12. La síntesis se detalla en este protocolo da los puntos cuánticos con un pico de emisión roja centrada a 600 nm.

Varios pasos se toman after síntesis de los núcleos QD para mantener la integridad óptica de los puntos cuánticos y para hacerlos compatibles para aplicaciones biológicas. La superficie del núcleo QD debe ser protegido de defectos de la oxidación o de superficie que pueden causar enfriamiento rápido; Por lo tanto, una concha de ZnS se reviste sobre el núcleo para producir InP / ZnS (core / shell) qds 13. Este revestimiento se ha demostrado que protege la fotoluminiscencia del producto QD. La presencia de iones de zinc durante la síntesis de InP QD se ha demostrado que limitar defectos de la superficie, así como distribución de tamaño de disminución 12. Incluso con la presencia de Zn 2 + en el medio de reacción, la síntesis de InZnP son muy poco probable 12. Después del recubrimiento, los puntos cuánticos resultantes InP / ZnS se recubren en ligandos hidrófobos tales como óxido de trioctilfosfina (TOPO) o oleilamina 12,14. Un polímero anfifílico puede interactuar con ligandos hidrófobos en la superficie QD, así como las moléculas de agua a granel para impartir solubilidad en agua 15. polímeros anfifílicos con carbogrupos químicos xylate se pueden utilizar como "asas químicas" para funcionalizar adicionalmente los puntos cuánticos.

Este protocolo se detalla la síntesis y funcionalización de InP / puntos cuánticos ZnS solubles en agua con la emisión de fluorescencia muy intensa y tamaño relativamente pequeño-dispersidad. Estos puntos cuánticos son potencialmente menos tóxicos que los puntos cuánticos CdSe / ZnS de uso común. En esto, la síntesis de InP / ZnS puntos cuánticos ofrece una alternativa práctica a los puntos cuánticos basados ​​en Cd para aplicaciones biomédicas.

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Protocolo

1. Síntesis de fosfuro de indio / sulfuro de zinc (InP / ZnS) Quantum Dots

  1. Síntesis de fosfuro de indio (InP) Quantum Dot Núcleos
    1. Montar un fondo redondo de 100 ml, de 3 bocas, con un condensador de 12 pulgadas. Añadir 30 ml de oleilamina (OLA), cloruro de 0,398 g de indio (III) (incl 3), 0,245 g de cinc (II) cloruro (ZnCl2) y se agita durante la evacuación a temperatura ambiente usando un vacío durante 1 hora. La solución debería aparecer incoloro con un precipitado blanco.
    2. El uso de una manta de calentamiento con un termopar y controlador de temperatura proporcional-integral-derivativo (PID), aumentar la temperatura de la solución a 120 ° C. Evacuar la solución bajo vacío durante 20 min para eliminar las impurezas de bajo punto de ebullición que pueden afectar el crecimiento del núcleo.
      Nota: Si bien es posible utilizar un baño de arena y termómetro, usando una manta de calentamiento y PID aumenta la uniformidad y reproducibilidad de los productos de reacción.
    3. Bajo gas inerte (por ejemplo,, N 2), reflujo la solución y aumentar la temperatura a 220 ° C durante 15 min. La incl 3 y ZnCl 2 completamente disuelven, lo que resulta en una solución de color amarillo pálido. Deje que la temperatura se estabilice durante 10 min.
    4. Purgar una jeringa desechable de 3 ml de plástico y 4 pulgadas, 22 aguja G con gas nitrógeno. El uso de la jeringa, entregar rápidamente 0,5 ml de tris (dimetilamino) fosfina (TDMAP) a la solución incl 3. La temperatura de la solución disminuye ligeramente y vuelve a 220 ° C. La solución cambia de transparente, amarillo claro a opaco, negro.
    5. Después de 9,5 min, retirar el matraz de reacción de la camisa de calentamiento hasta que la temperatura disminuye por debajo de 200 ° C. Para proteger la integridad de los núcleos de InP, proceder directamente a la capa de ZnS en el paso 1.2.1.
  2. Síntesis del sulfuro de zinc (ZnS Conchas) Quantum Dot
    1. Colocar el matraz de reacción de la etapa 1.1.5 en una manta de calefacción y estabilizar el temperatura a 200 ° C. Agregar lentamente 3,58 g dodecanotiol (DDT) en el transcurso de 15 segundos a la solución que contiene los puntos cuánticos de InP. Deje que la solución reaccione durante 1 hora.
      Nota: grosor de la cáscara ZnS puede variarse aumentando o disminuyendo la cantidad de estearato de zinc añadido en la etapa 1.2.4. La alteración de la cantidad de ZnCl 2 o dodecanotiol en los pasos 1.1.1 y 1.2.1 puede afectar significativamente la calidad de los puntos cuánticos cambiando la cinética de reacción.
      1. Después, retire el matraz de reacción de la camisa de calentamiento y permita que la solución se enfríe a aproximadamente 60 ° C.
    2. Una vez que la solución de InP / ZnS alcanza ~ 60 ° C, añadir 10 ml de hexanos y transferir toda la solución de aproximadamente 45 ml a un tubo de centrífuga de polipropileno de 50 ml. Centrifugar la muestra (3.000 xg durante 10 min) para eliminar los precursores sólidos sin reaccionar.
    3. transferir con cuidado el sobrenadante a una botella de centrífuga de polipropileno de 250 ml, añadir 200 ml de acetona, y se centrifuga la solución (3.000 xg durante 10 min) para precipitar los puntos cuánticos InP / ZnS. Este volumen también se puede dividir de manera uniforme en cuatro tubos de 50 ml por centrifugación si una centrífuga con rotor / los accesorios necesarios no está disponible. Decantar el sobrenadante y secar el pellet QD a fondo con gas nitrógeno para eliminar la acetona.
    4. Resuspender los puntos cuánticos en 20 ml OLA utilizando ultrasonidos, transferir a un fondo redondo de 50 ml, de 3 bocas, que contiene 0,474 g de estearato de zinc, y revuelva. Evacuar la solución bajo vacío durante 20 min a TA.
    5. Bajo gas nitrógeno, aumentar la temperatura a 180 ° C y permite que la reacción continúe durante 3 h. Si bien no hay cambios visuales notables en la solución de reacción que se producen durante esta reacción, la adición de estearato de zinc aumenta el grosor del cascarón ZnS, aumentando así QY mediante la mejora de pasivación de la superficie de los puntos cuánticos 12.. Una vez que la reacción se ha completado, retirar el matraz de la manta calefactora y permita que la solución se enfríe a aproximadamente 60 ° C.
    6. Una vez que los soluti InP / ZnSen alcances ~ 60 ° C, añadir 20 ml de hexanos y transferir a un tubo de centrífuga de 50 ml de polipropileno. Centrifugar la muestra (3.000 xg durante 10 min) para eliminar el estearato de zinc sin reaccionar.
    7. transferir con cuidado el sobrenadante a una botella de centrífuga de 250 ml de polipropileno, añadir 200 ml de acetona, y se centrifuga la solución (3.000 xg durante 10 min) para precipitar InP / ZnS puntos cuánticos. Con cuidado, se decanta el sobrenadante y se seca a fondo con gas nitrógeno para eliminar la acetona.
    8. Disolver el precipitado InP / ZnS QD en 30 ml de hexano. Vortex y someter a ultrasonidos brevemente la solución para asegurar una dispersión completa.
    9. Repita los pasos de purificación 1.2.6-1.2.8 dos veces más para asegurar la eliminación completa de ligandos orgánicos en exceso. Las interacciones entre el polímero anfifílico y el QD en el paso 1.2 pueden verse comprometidas en presencia de un exceso de ligandos.
    10. Con cálculos detallados por Xie, et al. 16, determinar el tamaño y concentración de los puntos cuánticos InP / ZnS sintetizados usando espectroscopia UV-Vis.
      Nota: La característica espectral importante para este análisis es el hombro del pico de absorción. El valor de longitud de onda y la absorbancia del máximo de este hombro se utiliza para calcular el tamaño y la concentración de los puntos cuánticos, respectivamente. Esta reacción típicamente produce aproximadamente 5 mol de los puntos cuánticos con un pico de emisión a 600 nm. Para sintetizar los puntos cuánticos de diferentes colores, la duración y / o la temperatura de la reacción se pueden modificar. Un tiempo de reacción más largo y / o una temperatura más alta de los resultados de la solución en un pico de emisión desplazada al rojo. Por ejemplo, el aumento de la temperatura de reacción a 240 ° C y mantener el tiempo de reacción de 10 min se traducirá en puntos cuánticos con un pico máximo de emisiones nm 680. Del mismo modo, la reducción de tiempo de reacción a 2 min y la duplicación de cloruro de zinc utilizado resultará en puntos cuánticos con un pico de emisión máxima nm 470. Estos puntos cuánticos InP / ZnS son estables durante al menos un mes a 4 ° C en la oscuridad bajo gas inerte.

2. aguaSolubilización de InP / ZnS Quantum Dots El uso de un polímero anfífilo

  1. solubilización en agua
    1. Uso de los puntos cuánticos InP / ZnS desde el paso 1.2.10, diluir una parte de los puntos cuánticos con hexanos para obtener 1 ml de 1 M puntos cuánticos.
      1. En un tubo de centrífuga, transferir 0,25 ml de InP / ZnS puntos cuánticos en cada tubo. Añadir 1 ml de acetona o metanol para el tubo de centrífuga y se centrifuga (3.000 xg durante 10 min). Retirar con cuidado el sobrenadante y disolver cada precipitado en 1 ml de tetrahidrofurano (THF).
      2. La transferencia de los puntos cuánticos InP / ZnS disueltos en THF en un matraz de 100 ml de fondo redondo y se diluye con 16 ml de THF. Para reducir el número de agregados en solución, los puntos cuánticos someter a ultrasonidos durante 5-10 minutos.
    2. Disolver 30 mg de poli (ácido maleico alt andhydride- -1-octadeceno), 3- (dimetilamino) -1-propilamina (PMAL-d) en 10 ml de agua de grado molecular. Baño de agua sonicación o agitación suave hasta que la solución es translúcido es suficiente para disolver completamente el polímero. losuso de vórtice o agitación vigorosa puede producir muchas burbujas, lo que dificulta la interacción del polímero con el QD. Añadir la solución de polímero 10 ml a los 100 ml matraz de fondo redondo que contiene InP / ZnS puntos cuánticos en THF.
    3. Se evapora THF de la solución QD / polímero usando un evaporador rotatorio. Colocar el matraz en un baño de hielo mientras se evapora para facilitar la interacción entre el polímero y QD. Dependiendo de la fuerza del vacío, más THF se evapora después de 10 min y la solución aparece turbia.
      1. Una vez que la solución se evapora a 10 ml, quitar el matraz del evaporador rotativo y añadir 30 ml de agua de grado molecular. Devolver el matraz al evaporador rotatorio y continuar a evaporarse a 2 ml. Esta etapa de evaporación final puede tomar muchas horas; asegurar el baño de hielo se mantiene.
    4. Quitar los puntos cuánticos InP / ZnS solubles en agua del matraz de fondo redondo con una pipeta. Filtrar la solución QD utilizando una jeringa de plástico de 3 ml unido a un sy nylon 0,1 micrasringe filtrar en un tubo de centrífuga de 5 ml.
    5. Coloque los puntos cuánticos en una unidad de diálisis de membrana de MWCO de 20.000 y se dializa frente a tampón borato 0,05 M pH 8,5 para eliminar el exceso de polímero. (Añadir lentamente tetraborato decahidrato sódico 0,05 M en ácido bórico 0,05 M, con agitación vigorosa, hasta que el pH es 8,5 para hacer esta solución tampón de borato.) El uso de un concentrador de vacío, concentrar los puntos cuánticos en tampón de borato a 1 ml.
    6. Para el almacenamiento, purgar la solución con nitrógeno gaseoso antes del sellado con Parafilm. Los puntos cuánticos InP / ZnS solubles en agua son estables durante al menos 4 meses a 4 ° C en la oscuridad.

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Resultados

Los núcleos no recubiertos InP no demuestran fluorescencia visible por el ojo sustancial. Sin embargo, InP / ZnS (core / shell) puntos cuánticos fluorescentes brillantes parecen a simple vista bajo irradiación UV. La fluorescencia de InP / ZnS los puntos cuánticos se ha caracterizado mediante espectroscopía de fluorescencia. El espectro de fluorescencia de los puntos cuánticos en hexanos (Figura 1) se excita a 533 nm muestra un pico principal centrado a 600 nm con una an...

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Discusión

Este protocolo se detalla la síntesis de los puntos cuánticos InP / ZnS altamente fluorescentes que se pueden utilizar en muchos sistemas biológicos. Los productos sintetizados QD aquí exhiben un solo pico de emisión de fluorescencia centrada en 600 nm con una FWHM de 73 nm (Figura 1), que es comparable a otras síntesis anteriormente descritos 12. El tiempo de reacción y la temperatura de reacción son pasos muy importantes debido a su profundo efecto sobre la calidad de la síntesis de QD y re...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores agradecen el Departamento de Química y la Escuela de Graduados de la Universidad Estatal de Missouri por su apoyo a este proyecto. También reconocemos el Laboratorio de Microscopía Electrónica en el Laboratorio Nacional de Investigación del Cáncer de Frederick para el uso de su microscopio electrónico de transmisión y rejillas recubiertas de carbono.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
OleylaminaAcros129540010
Cloruro de zinc (II)Sigma030-003-00-2
Cloruro de indio (III)Chem-Impex24560
Tris(dimetilamino)fosfinaEncompass50-901-10500
1-dodecanetiolAcros117625000
HexanosFisher SciH292-4
AcetonaTransChemicalUN 1090
Estearato de zincAldrich Chem307564-1KG
TetrahidrofuranoAcros34845-0010
Agua molecularFisher SciBP2470-1
Poli(anhyrdride-maleico-alt-1-tetradeceno), 3-(dimetilamino)-1-propilamina derivado Sigma90771-1G
Ácido bóricoFisher SciBP168-500
Tetraborato de sodio DecahidratoFisher SciBP175-500
Rhodamina BAldrich ChemR95-3
Gas nitrógenoAirgasUN1066
Azul tripánThermo SciSV30084.01
Jeringa Luer-lock de plástico de 3 mlBD309657
Luer-lock NeedleAir-Tite83000144714 pulgadas, calibre 22
Tubo de centrífuga de polipropileno de 50 mlFalcon352098
Botella de centrífuga de 250 mlThermo Sci05-562-23 Tubos deNalgene PPCO
5 mlArgos-TechT2076
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mlBio Plas4150
0.1 μ m Filtro de jeringaWhatman6786-1301Puradisc Filtro de nylon de 13 mm
Slide-A-Lyzer MINI Unidad de diálisisThermo Sci6959020,000 MWCO
Evaporador rotativoHeidolph
Centrífuga 5072EppendorfCubo oscilante con 50  Adaptadores de tubo ML
Espectrómetro UV/VIS Lambda 650Perkin ElmerEspectrofotómetro UV-Vis
LS 55 Espectrómetro de fluorescenciaPerkin ElmerFluorímetro
Axio Observer.A1Microscopio de epifluorescenciaZeiss
AxioCam MRmCámara CCD Zeiss
Microscopio Tecnai TF20FEIMiscroscopio de electrones Transmisison
Cámara TEM Eagle CCDFEITEM CCD
NanoBrook Omni DLSBrookhavenInstrumento dinámico de dispersión de luz
centrífuga

Referencias

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Erratum


Formal Correction: Erratum: Synthesis of Cd-free InP/ZnS Quantum Dots Suitable for Biomedical Applications
Posted by JoVE Editors on 2/29/2016. Citeable Link.

A correction was made to: Synthesis of Cd-free InP/ZnS Quantum Dots Suitable for Biomedical Applications. There was an error with an author's given name. The author's name was corrected to:

Katye M. Fichter

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Kathryn M. Fichter

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