Aquí, se presenta un protocolo para aislar y establecer cultivos primarios de fibroblastos/miofibroblastos (MF) a partir de células gástricas, del intestino delgado y de colon congeladas productoras de tejido con un fenotipo MF. Estas células expresan CD90, α-SMA y vimentina. Los MF se pueden utilizar para una variedad de ensayos funcionales, incluida la actividad enzimática y la producción de citocinas.
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Artículo de método
Aislamiento de CD 90+ fibroblastos / miofibroblastos de congelados Humanos gastrointestinales Especímenes
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Resumen
Resumen
Fibroblastos / miofibroblastos (MFS) han ido ganando cada vez más atención por su papel en la patogénesis y sus contribuciones a tanto la cicatrización de heridas y la promoción del microambiente tumoral. Si bien en la actualidad hay muchas técnicas para el aislamiento de FMs de (GI) tejidos gastrointestinales, este protocolo introduce un elemento novedoso de aislamiento de estas células del estroma de tejido congelado. Congelar las muestras de tejido GI no sólo permite al investigador para adquirir muestras de colaboradores en todo el mundo, los biobancos y proveedores comerciales, sino que también permite el procesamiento retardado de muestras frescas. El protocolo descrito producirá consistentemente células fusiformes característicos con el fenotipo MF que expresan los marcadores CD90, α-SMA y vimentina. A medida que estas células se derivan de muestras de los pacientes, el uso de células primarias también confiere el beneficio de MFs que imitan estrechamente a partir de los estados-a saber, la enfermedad del cáncer y enfermedades inflamatorias del intestino. Esta técnica tiene la abejan validado en gástrico, intestino delgado, colon y MF generación cultivo primario. Culturas MF primarios se pueden utilizar en una amplia gama de experimentos sobre un número de pasaje y su pureza evaluados tanto por inmunocitoquímica y análisis de citometría de flujo.
Introducción
Los miofibroblastos / fibroblastos (MFS) representan una abundante población de células en el tracto gastrointestinal (GI) mucosa. Estas células estromales se encuentran justo por debajo del epitelio y forman una red interconectada dentro de la lámina propia de la mucosa en el intestino. MFs no sólo sean responsables de la deposición de la matriz extracelular, pero a través de la regulación paracrina puede influir en el transporte de electrolitos, restitución, y la función de barrera del epitelio adyacente 1, 2. Además, MFs han demostrado que desempeñan un papel clave en la inflamación y el tejido remodelación de 3, 4. Los miofibroblastos son una parte crítica del microambiente tumoral, en donde también se les conoce como los fibroblastos asociados al cáncer, y contribuyen al crecimiento de las células tumorales y sirven como un nicho de células madre del cáncer 3. Datos emergentes sugieren que FMs también puede servir células presentadoras de antígenos como locales. Además, la función FMs como reguladores importantes de la respuesta inmune innata y adaptativa, producing una variedad de citocinas y factores de crecimiento 5.
En individuos sanos, las células MFS se cree que diferenciar de las células madre mesenquimales y expresar en su superficie celular, el marcador mesenquimal, CD90 3, 5. Estas células también son positivas para vimentina, pero negativo para epitelial y marcador de células hematopoyéticas, EpCAM y CD45 , respectivamente. Los miofibroblastos se sugieren para ser una forma activada de los fibroblastos y pueden distinguirse de los fibroblastos no activadas por la expresión de α-SMA 5.
Durante la última década, múltiples enfoques para el aislamiento de miofibroblastos de colon humanos mucosa han sido publicados-en su mayoría basados en el método descrito originalmente por Mahida et al. 5-8. Mientras que los estudios individuales reportan procedimientos de aislamiento de diversos mucosa intestinal, no protocolo universal para el aislamiento de MFs desde múltiples áreas del tracto GI (es decir, gástrica, pequeño y lmucosa intestinal arge) ha sido publicado. El protocolo presentado en el presente documento ha sido probado y utilizado con éxito para los tres tipo de tejido se ha mencionado anteriormente. . Además, no se han informado procedimientos para aislar MFs de la mucosa GI congelados.
A continuación, presentamos un método optimizado, que se basa en la digestión enzimática, y al mismo tiempo permite el aislamiento de la mucosa intestinal humana FMs de la cultura y la citometría de flujo análisis, unicelulares, preparaciones mucosas digeridos recientemente. Esta técnica produce de forma fiable cultivos primarios con un fenotipo MF. Además, los mismos métodos pueden ser utilizados para aislar a partir de muestras MFs congeladas de tejidos intestinales y gástricos pequeñas también. Aislamiento de miofibroblastos a partir de tejido fresco GI se ha descrito previamente; sin embargo, la utilización de muestras congeladas presenta muchos beneficios. A saber, los investigadores podrán recoger y almacenar los tejidos de cualquier número de colaboradores de todo el mundo que tienen la capabidad para enviar muestras de tejido congelado. Por otra parte, los investigadores pueden encontrar la colección de tejidos descartados de la sala de operaciones y / o sala de endoscopia e inmediato procesamiento de tejido para el aislamiento de conflicto con su horario de experimentación actual. También, debido a la naturaleza impredecible de la cirugía, la obtención de tejidos puede ocurrir muy tarde en el día, lo que limitará el tiempo que queda para el tejido procesado. La congelación de tejido para su posterior procesamiento será mejorar estos desafíos.
Por último, estos métodos se han utilizado con éxito en el aislamiento de miofibroblastos intestinales del colon, gástricos y pequeños en estados de enfermedad tales como carcinoma colorrectal y enfermedades inflamatorias del intestino.
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Protocolo
El protocolo para la obtención de tejidos humanos descartados de pacientes quirúrgicos y el establecimiento de cultivos primarios fue aprobado por la Universidad de Texas Medical Branch y la Universidad de Nuevo México Juntas de Revisión Institucional. Los requisitos generales para la obtención de muestras de tejido humano se describen a continuación. Tenga en cuenta que desde MFs puede ser aislado de tejido congelado, bancos de datos genéticos y vendedores comerciales son también opciones viables.
1. Obtener Tejidos Humanos
- Presentar un protocolo para obtener tejido de colon humano a la junta de revisión institucional para su aprobación.
- Establecer colaboraciones con los cirujanos generales y / o cirujanos colorrectales con el fin de obtener los tejidos humanos para la investigación. La colaboración con el departamento de patología también es obligatoria, ya que estarán determinando el tejido que no es necesaria para el diagnóstico y puede ser designado para la investigación.
- Asesorar al patólogo para proporcionar tejido de la neoplasia y luego Grossly mucosa normal al menos 5 cm desde el tumor. Coloque inmediatamente las muestras en medios de lavado enfriado con hielo y colocarlo en hielo. El patólogo determinará la cantidad de tejido que se puede dar de forma segura para la investigación. El tejido mínima requerida para el aislamiento MF es 1,5 mm 2.
- Utilice el tejido obtenido de forma inmediata para establecer los cultivos primarios o congelación y lugar a -80 ° C para el futuro aislamiento.
- Si la congelación para el aislamiento después, cortar el tejido en aproximadamente 1 - 2 mm 2 piezas, colocar en un tubo criogénico con 1 ml de medio de congelación (véase más adelante), y se almacena a -80 ° C. Nota: La utilización de este protocolo, se ha observado el aislamiento con éxito de FMs del tejido congelado durante más de 4 años.
2. Prepare Reactivos
- Para la solución de colagenasa: Preparar 100 U / ml de colagenasa I, II y IV en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) con Ca2 + / Mg2 + (ver Tabla Materiales ). PRECAUCIÓN: La colagenasa concentración unidad activa y la pureza puede varía de un proveedor a otro, lo que puede impedir la eficiencia de la digestión del tejido y / o conservación del epítopo en la superficie celular de la mucosa. Para evitar estos peligros potenciales, utilice la colagenasa con más alto grado de pureza (≥95%) y preparar la solución madre basado en la concentración de unidades activas.
- Prepare la solución de DNasa social a base de agua a 10 mg / ml (3,55 UA / mg).
- Preparar los medios de lavado: (MEM: 89 ml, antibiótico-antimicótico, 100x: 1 ml; FCS inactivado por calor: 10 ml)
- Preparar fibroblastos crecimiento de los medios: MEM: botella de 500 ml; L-glutamina (200 mM): 5 ml; Aminoácidos no esenciales MEM, 100x solución: 5 ml; ciprofloxacina HCl (10 mg / ml): 570 l; Antibiótico-antimicótico, solución 100x: 10 ml; piruvato de sodio (100 mM): 5 ml; FCS inactivado por calor: 50 ml
- Preparar medios Freeze: medios de crecimiento de fibroblastos (Reactivo 2,4) con la adición de 10% sulfóxido de dimetilo (DMSO), a continuación, filtrar-sterilize con un filtro de 0,22 micras.
Tejido 3. enzimáticamente Digesto Humano
- Si el tejido se congeló en los medios de congelación, lugar criovial en caliente (~ 37 ° C) agua hasta que se descongela el tejido y medios de comunicación.
- Para 4 - 5 de 2 mm 2 piezas de tejido, tejido lavar dos veces con 10 ml de HBSS sin Ca 2 + / Mg2 +.
- Una vez que el tejido se ha asentado por gravedad, desechar cuidadosamente el sobrenadante sin girar la muestra.
- Añadir 10 ml de la solución de colagenasa a la muestra y transferir la mezcla tejido-solución en un tubo estéril, DNasa / RNasa libre con una función de rotores para muestra de disociación. Utilice la colagenasa para disociar la matriz extracelular que rodea el aspecto basal de las células epiteliales y forma la fracción no celular de la lámina propia de la mucosa.
- Cierre bien el tubo y coloque boca abajo en el manguito del disociador (por ejemplo, gentleMACS). Si el laboratorio no tiene acceso a la tél antes mencionados equipos, aumentar el tiempo de cada etapa de digestión de obtener resultados comparables.
- Ejecute el h_tumor_01 Programa, un perfil preestablecido incluye con la máquina (duración total de 36 seg, con pulsos intermitentes que van desde 1.000 - 4.000 rpm, con 268 rondas por corrida).
- Después de la terminación del programa, desconecte el tubo de la disociador.
- Incubar la muestra durante 45 min a 37 ° C bajo rotación continua en agitador a 140 rpm. Nota: Para cantidades variables de muestras de tejido, el tiempo de digestión puede reducirse o aumentarse proporcionalmente (es decir, mayores cantidades de tejido pueden requerir tiempo adicional).
- Conecte el tubo boca abajo en el manguito del disociador.
- Elija y ejecutar el Programa h_tumor_02 (duración total de 37 seg, con pulsos intermitentes que van desde 1.000 - 4.000 rpm, con 235 rondas por corrida).
- Después de la terminación del programa, desconecte el tubo de la disociador.
- Añadir 50 l de solución de DNasa. Utilice DNAsa disociar / eliminar las células muertas y la fracción de ADN de los restos celulares que conduce a la celda aglutinación.
- Incubar la muestra durante 30 min a 37 ° C bajo rotación continua en agitador a 60 rpm.
- Conecte el tubo boca abajo en el manguito del disociador de nuevo.
- Elija y ejecutar el Programa h_tumor_03 (duración total de 37 seg, con pulsos intermitentes que van desde 1.000 - 4.000 rpm, con 168 rondas por corrida).
Nota: Si el tejido no se digiere completamente, centrifugar a 250 xg durante 10 min a 20 ° C, desechar el sobrenadante, resuspender en 2 ml de solución de disociación celular y se incuba a TA durante 10 min. - Pasar la suspensión celular a través estéril filtro celular 70 micras.
- Centrifugar la suspensión celular a 250 × g durante 10 min a 20 ° C. Aspirar el sobrenadante por completo.
- Pellet lavado de células dos veces con 25 ml de HBSS sin Ca 2 + / Mg2 + y descartar el sobrenadante.
- Antes de la última erah, el recuento del número de células utilizando un sistema automatizado conteo de células disponibles en el laboratorio o manualmente mediante hemocitómetro. Para MF generación cultivo primario proceder para el paso 3.19.1, para el análisis o clasificación de FMs mediante citometría de flujo proceder para el paso 3.19.2.
- Para el aislamiento y el crecimiento de la cultura MF pura (Figura 1), descartar el sobrenadante de la última centrifugación, el sedimento celular se resuspende en la cantidad apropiada de medios de aislamiento de fibroblastos necesaria para sembrar hasta 4 x 10 6 células en 3 ml de los medios de comunicación por pocillo en 6 platos así, tratados con cultivo celular. Continúe con el paso 3.20.
- Para el análisis o clasificación de FMs mediante citometría de flujo, colocar hasta 2 x 10 6 en 2 ml de medio de aislamiento de fibroblastos de 24 pocillos, placa de bajo vinculante e incubar O / N a 37 ° C con 5% de CO 2. Esta es restaurar los epítopos de la superficie celular que pueden ser afectados por el procedimiento enzimático. Luego recoger suspensión celular y contar células recuperadas y procederpara la inmunotinción y citometría de flujo análisis 8.
- Crecer células a 37 ° C con 5% de CO 2. Cambie los medios de comunicación cada 2 - 3 días hasta que la formación de ~ 80% de confluencia MF monocapa (Figura 1D-E).
- Células pasaje en matraces T25 con de 6 placa de pocillos a una relación de 1: 1 y crecer durante ~ 10 - 14 días en medio de crecimiento de fibroblastos para alcanzar 80 - 100% de confluencia.
- Expandir cultivo mediante pases de células T25 T75 a las células a una relación de 1: 2. Una vez que las células alcanzan la confluencia, puede utilizarse un matraz para el análisis de pureza MF aislado utilizando por citometría de flujo como se describió previamente 5. Congele o pasaje otro matraz T75 de la cultura MF en relación 1: 3.
Nota: Cuando se analizaron por citometría de flujo, se espera que GI mucosa del estroma MF de origen mesenquimal al crecer en la cultura tendrá siguiente fenotipo: EpCAM-, CD31-, CD45-, vimentina +, α-SMA +, CD90 +.
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Resultados
El uso de este protocolo de digestión enzimática, hemos sido siempre capaz de aislar y crecer CD90 + células estromales de la mucosa intestinal MF población a partir de muestras y biopsias (Figura 1) quirúrgicas gastrointestinales. Visible la proliferación de colonias MF se pudo observar en el día 2 - 5 después de la siembra suspensiones de células mononucleares en placas de 6 pocillos (Figura 1A-B). Los cultivos primarios MF alcanzan ~ 50 - 7...
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Discusión
Aunque este protocolo fue desarrollado para la aplicación de investigación única, a la luz de la creciente importancia crítica de las células del estroma como un posible cáncer de biomarcadores pronósticos y diana terapéutica, la capacidad de congelar bioespecímenes "funcionales" para su uso posterior ofrece una ventaja significativa. Esto representa una ventaja única para la creación de biorepositorio clínica, que puede servir como herramientas adicionales que sirven para avanzar en el desarrollo de la medici...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud (1R01DK103150-01A1, T32 DK007639, R01CA175803, K08CA125209) y el Instituto de Ciencias Traslacionales de la Rama Médica de la Universidad de Texas, y un Premio de Ciencias Clínicas y Traslacionales (8UL1TR000071).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| MEM, 1x | Corning | MT-10-010-CV | |
| Solución salina equilibrada de Hanks | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Piruvato de sodio | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Antibiótico-antimicótico, 100x | Gibco | 15240-062 | |
| Ciprofloxacina HCl | Corning | 61-277-RF | |
| L-Glutamina, 100x | Corning | 25-005-CI | |
| MEM Aminoácidos no esenciales | Corning | 25-025-CI | |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) Hybri-Max | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DL-Dithiothreitol solución (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| 0,5 M EDTA, pH 8,0 | Cellgro | 46-034-CI | |
| DNAse | Worthington LS002139 | ||
| Colagenasa de Clostridium histolyticum, Tipo I | Sigma-Aldrich | C1639 | |
| Colagenasa de Clostridium histolyticum, Tipo II | Sigma-Aldrich | C1764 | |
| Colagenasa de Clostridium histolyticum, Tipo IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Solución de disociación celular Accumax | Sigma-Aldrich | A7089 | |
| gentleMACS C Tubos | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACS Disociador | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Contador de células automatizado Countess | Invitrogen | C10227 | |
| Filtro de células (70 µ m) | Corning | 352350 | |
| PE Ratón Anti-Humano Vimentina | BD Biosciences | 562337 Clon RV202 | |
| FITC Anti-Actina Monoclonal, α-Músculo Liso | Sigma-Aldrich | F3777 | Clon 1A4 |
| APC Ratón Anti-Humano CD90 | BD Biosciences | 559869 | Clon 5E10 |
Referencias
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