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Artículo de método

Administrar y Detección de Marcas de proteínas de Artrópodos de Dispersión de Investigación

7K vistas

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DOI:

10.3791/53693

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28 de enero de 2016

 , 
1USDA-ARS, Arid-Land Agricultural Research Center

En este artículo

Resumen

Las proteínas se utilizan a menudo para marcar artrópodos para la investigación de dispersión. Se demuestran los métodos para administrar marcas de proteínas internas y externas en artrópodos. También se ilustran las técnicas de detección de marcas de proteínas, ya sea a través de ensayos inmunoenzimáticos indirectos o en sándwich (ELISA).

Resumen

Monitoreo movimiento artrópodos se requiere a menudo para comprender mejor la dinámica de población asociados, patrones de dispersión, las preferencias de la planta huésped, y otras interacciones ecológicas. Los artrópodos suelen ser rastreados en la naturaleza mediante el etiquetado con una marca única y luego vuelven a su recogida en el tiempo y en el espacio para determinar sus capacidades de dispersión. Además de las etiquetas físicas reales, como el polvo o pintura de color, varios tipos de proteínas han demostrado ser muy eficaz para el marcado de los artrópodos para la investigación ecológica. Las proteínas se pueden administrar internamente y / o externamente. Las proteínas pueden entonces ser detectados en los artrópodos recapturados con un ensayo ligado a enzimas específico de la proteína de inmunoabsorción (ELISA). Aquí se describen los protocolos para la externa como internamente etiquetado artrópodos con la proteína. Dos ejemplos experimentales sencillos se demuestran: (1) una marca de proteína interna presenten a un insecto, proporcionando una dieta enriquecida con proteínas y (2) una marca de proteína externa tópicamente unpplied a un insecto usando un nebulizador médico. A continuación relacionamos una guía paso a paso del sándwich y métodos indirectos de ELISA utilizados para detectar signos de proteínas en los insectos. En esta demostración, se discuten diversos aspectos de la adquisición y la detección de marcadores de proteínas en los artrópodos para la marca de liberación y recaptura, marca de captura, y los tipos de auto-marca-captura de la investigación, junto con las diversas formas en que el procedimiento inmunomarcaje ha sido adaptado para adaptarse a una amplia variedad de objetivos de investigación.

Introducción

Seguimiento de los movimientos de plagas de artrópodos, enemigos naturales (parasitoides y depredadores), y polinizadores en la naturaleza es esencial para comprender mejor la manera de mejorar los servicios de los ecosistemas. El componente clave para la mayoría de tipos de investigación dispersión está teniendo un método fiable para etiquetar el artrópodo (s) de interés. Una variedad de materiales (por ejemplo, pinturas, tintes, polvos de colores, etiquetas, elementos raros, proteínas) se han utilizado para marcar los artrópodos para evaluar su dinámica poblacional, la capacidad de dispersión, la alimentación de comportamientos y otras interacciones ecológicas 1,2.

La idoneidad de un marcador utilizado para cualquier investigación dispersión dada dependerá del tipo de estudio que se llevó a cabo. Hay tres grandes categorizaciones para marcar artrópodos: (1) la marca de liberación y recaptura (MRR), (2) la marca de captura, y (3) la auto-marca-de captura. Para la investigación signo de liberación y recaptura, el investigador normalmente marca los artrópodos colectivamente en el Laboratory y los libera en un punto central en el campo. Los artrópodos son luego recapturados en distintos intervalos espaciales y temporales utilizando diferentes dispositivos de recogida (por ejemplo, la red de barrido, vacío, trampa pegajosa) 3,4,5. Los ejemplares recapturados se examinan a continuación, para la marca específica para distinguir liberado de personas nativas. Para la investigación marca de captura, el investigador normalmente se aplica la marca directamente en el equipo de aspersión campo utilizando (por ejemplo, pulverizador de mochila, la pluma y el pulverizador de boquilla). Los mejores marcadores para la investigación marca de captura son de bajo costo y de fácil aplicación para el hábitat de los artrópodos. Para la investigación propia marca de captura, el investigador suele aplicar marcas a un cebo artrópodos 6,7 o nido de entrada 8. A su vez, el artrópodo marca internamente devorando el cebo marcado o externamente por "cepillado" en contra de la marca a medida que sale del nido.

Como se mencionó anteriormente, muchos tipos de marcadores nos han sidoed para etiquetar una variedad de especies de artrópodos. Sin embargo, muy pocos son útiles para estas tres categorías de investigación de dispersión. El desarrollo del procedimiento inmunomarcaje proteína fue un gran avance para el marcado de los insectos. Inmunomarcaje pone una etiqueta de proteínas en los artrópodos, ya sea interna o externamente, que, a su vez, se detecta mediante un ensayo anti-proteína específica inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). Los primeros marcadores tales proteínas utilizadas fueron inmunoglobulina de conejo (IgG) y pollo IgG / IgY 9,10. Demostraron ser marcas muy eficaces para MRR y la investigación propia marca de captura (véase el debate). Por desgracia, las proteínas de IgG / IgY son costosos y por lo tanto no son prácticos para la investigación mark-captura y la mayoría de los tipos de investigación propia marca de captura. Posteriormente, los ELISA de detección de proteínas de segunda generación fueron desarrollados para las proteínas contenidas en la clara de huevo de pollo (albúmina), la leche de vaca (caseína) y la leche de soja (proteína inhibidora de tripsina). Cada ensayo es muy sensible, específico, y, lo másimportante, utiliza las proteínas que son mucho menos costosas que las proteínas de IgG / 11 IgY. Estas proteínas han demostrado ser eficaces para el MRR, marca de captura, y la investigación propia marca de captura (véase el debate).

En este artículo, describimos y demostramos cómo llevar a cabo estudios de retención de laboratorio marca proteína. Tales estudios son la primera fase de la investigación necesaria para cualquier tipo de estudio de campo de dispersión. En concreto, es fundamental que los investigadores saben cuánto tiempo se mantendrá la marca en las especies de artrópodos dirigidos antes de embarcarse en estudios de campo de dispersión. A continuación, describimos y demostramos cómo marcar interna y externamente insectos para MRR, marca de captura, y estudios de campo de tipo auto-marca-de captura. A continuación, mostramos la forma de detectar la presencia de las marcas con los ELISA indirectos y sándwich.

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Protocolo

1. Marque Interna, Retención y Procedimiento de Detección

  1. Procedimiento de marcación interna
    1. Recoge los insectos de interés (n ≈ 100 individuos) de una colonia de laboratorio criados con una dieta artificial o desde el campo y se dividen en dos contenedores de cría limpias.
    2. Coloque un paquete regular de 20 ml de dieta (tratamiento control negativo sin marcar) en uno de los contenedores. Suplemento de un segundo paquete de 20 ml artificial dieta con 1,0 ml de una solución de 1,0 mg / ml de IgG de pollo / IgY, mezclar bien, y colocarlo en otro recipiente.
      Nota: Si el insecto de interés no tiene una dieta artificial, la marca se puede colocar sobre o en cualquiera que sea la dieta que normalmente se mantienen en (por ejemplo, judías verdes, huevos de la polilla, el agua, el azúcar, la miel).
    3. Permitir a los insectos para reanudar su actividad de alimentación durante 24 horas.
  2. Procedimiento de retención de marca interna
    1. Retire los paquetes de la dieta de cada contenedor y suministrar los insectos wITH otra fuente de alimento para sostenerlos durante la duración del experimento (por ejemplo, judías verdes).
    2. Recoger una cohorte (n = 20) de los insectos diariamente (o en cualquier intervalo de tiempo deseado) de cada tratamiento y congelar inmediatamente a -20 ° C.
  3. Sandwich procedimiento ELISA
    1. Añadir 50 l de conejo anti-pollo IgY anticuerpo primario diluido 1: 500 en solución salina amortiguadora Tris (TBS) a cada pocillo de una microplaca de ELISA limpia e incubar durante un mínimo de 1 hora a RT (nota: las microplacas también se pueden incubar O / N a 4 ° C).
    2. Desechar el anticuerpo de la placa y bloquear cada pocillo con 300 l de una solución de leche seca no grasa 1,0% durante 30 min.
    3. A la espera de los pasos de incubación anteriores, colocar insectos congelados individualmente en 1,6 ml tubos de microcentrífuga con 1,0 ml de TBS.
    4. Moler cada insecto con una mano limpia hasta que se homogeneizó a fondo y añadir 100 l de cada muestra a un pocillo individual de la prueba ELISAplato. Permitir que las muestras se incuban a temperatura ambiente a durante 1 h.
    5. Añadir 100 l de negativo (TBS solamente) y positivos (claras de huevo en TBS) controles a pozos en la primera columna de cada placa de ELISA. Además, añadir 100 l de controles negativos de insectos (insectos sin marcar) a los 8 pozos en la última columna de cada placa (Figura 1). Permitir que las muestras de control incubar a temperatura ambiente durante 1 hr. Tenga en cuenta que la plantilla proporcionada en la Figura 1 es la plantilla que utilizamos para nuestros ensayos estandarizados. La colocación de las muestras en los pocillos es a la discreción del investigador.
    6. Lavar cada pocillo tres veces con tampón fosfato salino (PBS) Tween y luego añadir 50 l de IgG de conejo anti-pollo / IgY conjugado con peroxidasa de rábano picante diluida 1: 10.000 en solución de leche 1% y se incuba durante 1 hora a RT.
    7. Lavar cada pocillo tres veces con PBS-Tween y añadir 50 l de tetrametilbencidina (TMB) a cada pocillo.
    8. Después de 10 min, leer los pozoscon un espectrofotómetro de microplacas ajustado a una longitud de onda de 650 nm.

figure-protocol-1
Figura 1. Un diagrama esquemático que muestra las designaciones así estandarizados utilizados para una típica de 96 pocillos ELISA microplaca. Cada placa contiene 7 pozos dedicados a controles negativos de solución salina tamponada con Tris (TBS), un pozo dedicados a un control de la proteína positivo (Pos Ctrl), 80 pozos individuales dedicadas a insectos recapturados (muestra 1 ... 80), y 8 pozos dedicados a controles sin marcar (negativos) de insectos (Neg Ctrl 1 ... 8). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Marque externa, Retención y Procedimiento de Detección

  1. Procedimiento de marcado externo
    1. Recoge los insectos de interés (n ≈ 100individuos) de una colonia de laboratorio o de campo y el lugar en dos recipientes de plástico 1.0 L con un agujero de 2,5 cm de diámetro perforados por el lado de cada contenedor.
    2. Pulverizar los insectos en el primer recipiente con 1,0 ml de dH 2 O (tratamiento control negativo) utilizando un nebulizador médico. Pulverizar los insectos en el segundo recipiente con 1,0 ml de una solución 5,0% de claras de huevo de pollo usando un nebulizador médico.
    3. Conecte la manguera del nebulizador a una toma de aire estándar de laboratorio y luego insertar la desembocadura del nebulizador en el agujero de 2,5 cm del recipiente. A continuación, encienda la salida de aire gradualmente hasta que el nebulizador produce un vapor.
    4. Continuar pulverización (marcado) hasta que la solución claras de huevo se ha dispensado (aprox. 2-5 minutos).
    5. Retire el nebulizador y colocar un tapón en el orificio del recipiente de plástico. Permita que los insectos que están a temperatura ambiente hasta que la solución se haya secado completamente.
  2. Procedimiento de retención de marca externa
    1. Coloque cada tratamiento de los insectos secos en un recipiente de cría limpia separada para evitar una mayor exposición a la marca.
    2. Añadir alimentos y agua a los recipientes limpios para sostener los insectos durante la duración del estudio.
    3. Recoge una cohorte (n = 20) de los insectos de cada tratamiento diario y congelar inmediatamente a -20 ° C.
  3. Procedimiento ELISA indirecto
    1. Coloque los insectos congelados individualmente en tubos de microcentrífuga de 1,6 ml y añadir 1,0 ml de TBS.
    2. Remoje las muestras durante 1 hora en un conjunto agitador orbital a 120 rpm.
    3. Añadir controles positivos y negativos como se describe en el Paso 1.3.5.
    4. Después de remojar, pipetear una parte alícuota de 100 l de cada muestra en uno de los 80 pocillos de muestras designadas en una nueva placa de ELISA de 96 como se muestra en la Figura 1 Permitir que las muestras se incuban durante 1 hora a RT (nota:. Las microplacas También puede haber O incubado / N a 4 ° C).
    5. Lavar éstos tres veces conPBS-Tween y luego añadir 300 l de fosfato salino tamponada que contiene 1% de albúmina de suero bovino (PBS-BSA) a cada pocillo.
    6. Después de 30 min a TA lavar dos veces con PBS-Tween.
    7. Añadir 50 l de conejo anti-albúmina de huevo anticuerpo primario diluido 1: 8000 en PBS-BSA-Silwet (0,05%) a cada pocillo e incubar durante 1 hora a RT.
    8. Lavar cada pocillo tres veces con PBS-Tween y luego añadir 50 l de IgG de cabra anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano diluida 1: 2000 en PBS-BSA-Silwet (0,05%) durante 1 hora a RT.
    9. Lavar cada pocillo tres veces con PBS-Tween y se añaden 50 l de sustrato TMB a cada pocillo.
    10. Después de 10 min, leer los pocillos con un espectrofotómetro de microplacas ajustado a una longitud de onda de 650 nm.

Análisis 3. Datos

  1. Calcular el valor medio de absorbancia de los insectos de control negativo 8 en cada placa ELISA y luego calcular la desviación estándar a partir de los controles negativos agrupados lado a otrom todas las placas de ELISA de un estudio dado 12.
  2. Añadir seis veces la desviación estándar combinada con la media obtenida para cada placa ELISA para obtener un valor umbral positivo ELISA. Cualquier muestra de insectos obteniéndose un valor de absorbancia igual o mayor que este valor se considera que es positivo para la presencia de la marca de la proteína.

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Resultados

Marcado interno:

Los resultados de la prueba de retención marca interna se muestran en la Figura 2A. El valor umbral crítico ELISA calculado era 0.054. En general (en todas las cuatro fechas muestra combinada), los insectos tratados sin proteínas dieron valores constantemente bajos de ELISA (x = 0,038 ± 0,002, n = 80). Por el contrario, todos los insectos alimentados con la dieta enri...

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Discusión

El procedimiento inmunomarcaje proteína artrópodos fue descrita por primera vez casi un cuarto de siglo atrás 9. Desde entonces, el procedimiento se ha adaptado para estudiar los patrones de dispersión de una amplia variedad de artrópodos utilizando administrados tanto interna como externamente IgG / IgY. Estas proteínas han demostrado marcadores firmes para la amplia variedad de especies de insectos ensayadas hasta el momento. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, la principal limitación para el uso d...

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Divulgaciones

La mención de nombres comerciales o productos comerciales en esta publicación es únicamente con el propósito de proporcionar información específica y no implica recomendación ni aprobación por el Departamento de Agricultura de Estados Unidos. USDA es un proveedor de igualdad de oportunidades.

Agradecimientos

El financiamiento fue proporcionado por el USDA CRIS 5347-22620-021-00D y, en parte, por la Agricultura y la Alimentación de Investigación Iniciativa Competitiva subvención no. 2011-67009-30141 del Instituto Nacional del USDA de la Agricultura y la Alimentación. Estamos muy agradecidos por el apoyo técnico de Johanna Nassif. También queremos agradecer a Paul Baker, David Horton, Diego Nieto, y Frances Sivakoff para proporcionar algunas de las imágenes utilizadas en la Figura 3.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Contenedor de almacenamiento de alimentos (para la cría de insectos)Rubbermaid/TupperwareVarios tamañosVarios fabricantes y proveedores. La tela de malla se pega en una ventana
Nebulizador de pequeño volumen (Micro Mist)Teleflex-Hudson RCI1881Disponible en línea y en tiendas de suministros médicos. Otras marcas también funcionarán.
Tubos de microcentrífuga, 1,6 ml con tapaProductos de laboratorio Continental4445.XCualquier tipo similar funcionará. Preferimos marcas que tengan tapas fáciles de abrir.
Caja de almacenamiento de espuma de poliestireno para tubos de microcentrífuga (rejilla de 5x20)RPI Corp.145746Este diseño es agradable porque no abarrota los tubos.
Dispensador, repetidorEppendorf4982000322Cualquier cosa similar ayudará a acelerar la dispensación.
Majas, molinillos de papel desechables de plástico, 1,5 mlKimble Chase749521-1500Disponible con varios proveedores. Los morteros se pueden limpiar y esterilizar en autoclave para su reutilización.
Placas BD Falcon ELISA, 96 pocillos (fondo plano)Pipeta BD351172
Ovation, manual (20-200 y micro; l)VistaLab1057-0200 o 1070-0200Cualquier tipo similar funcionará. Este modelo es ergonómico.
Depósitos, reactivo estérilVistaLab4054-1000Cualquier cosa similar funcionará.
Pipeta electrónica, 8 canales (50-1.200 y micro; l) (Biohit eLine)Sartorius730391Si tuvieras que elegir un modelo electrónico, este tamaño es el más útil.
Pipeta electrónica, 8 canales (10-300 y micro; l) (Biohit eLine)Sartorius730361Cualquier cosa similar funcionará.
Colector, arandela de placas multipocillo (8 posiciones, recta)Sigma-AldrichZ369802 Cualquier cosa similar funcionará para el lavado manual de platos.
Lector de microplacas con detección de absorbanciaMolecular DevicesSpectraMax 250Cualquier cosa similar funcionará.
Pollo IgG/IgYEstados Unidos BiológicoI1903-15RTambién disponible en otras fuentes
Claras de huevoTienda de comestibles" Todos los blancos", " Batidores de huevos", etc.Mezcle 5 ml con 95 ml dH2O para solución al 5%
Tris (Trizma Base)Sigma-AldrichT15032.42 g/L para hacer TBS
Cloruro de sodio (NaCl)Sigma-AldrichS988829.22 g/L para hacer TBS y 8.0  g⁠/⁠ L para PBS
Fosfato de sodio dibásico (Na2HPO4)Sigma-AldrichS08761,14 g/L para PBS
Fosfato de potasio monobásico (KH2PO4)Sigma-AldrichP56550,2 g/L para PBS
Cloruro de potasio (KCl)Sigma-AldrichP95410,2 g/L para PBS
Tween 20, Grado EIASigma-AldrichP1379Agregue 0,5 ml por L al PBS después de que se disuelvan las sales.
PBS con 1% BSASigma-AldrichP3688Mix 1 paquete en 1 L dH2O
Anti-Chicken IgY (IgG) (molécula entera) anticuerpo producido en conejo (1:500)Sigma-AldrichC6409Mix 100 µ l en 50 ml de
leche en polvo o fresca TBS (1%)Tienda de comestiblesMezcla 10 g con 1 L dH2O para solución al 1%
Anti-pollo IgY (IgG) (molécula entera)-Anticuerpo peroxidasa producido en conejo (1:10.000)Sigma-AldrichA9046Mix 100 µ l en 1 L de leche al 1% Anticuerpo
anti-albúmina de huevo de gallina producido en conejo (1:8.000)Sigma-AldrichC6534Diluido 125 µ l en 1 L PBS-BSA
Cabra Anti-Conejo IgG Peroxidasa Conjugado (1:2.000)Sigma-AldrichA6154Diluir 0,5 ml en 1 L PBS-BSA, luego añadir 1,3  ml Silwet
Vac-In-Stuff (Silwet L-77) copolímero de silicio-poliéterLehle SeedsVIS-01Añadir como último ingrediente
TMB Microwell Sustrato de peroxidasa de un componenteSurModicsTMBW-1000-01

Referencias

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