Las proteínas se utilizan a menudo para marcar artrópodos para la investigación de dispersión. Se demuestran los métodos para administrar marcas de proteínas internas y externas en artrópodos. También se ilustran las técnicas de detección de marcas de proteínas, ya sea a través de ensayos inmunoenzimáticos indirectos o en sándwich (ELISA).
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Artículo de método
Administrar y Detección de Marcas de proteínas de Artrópodos de Dispersión de Investigación
En este artículo
Resumen
Resumen
Monitoreo movimiento artrópodos se requiere a menudo para comprender mejor la dinámica de población asociados, patrones de dispersión, las preferencias de la planta huésped, y otras interacciones ecológicas. Los artrópodos suelen ser rastreados en la naturaleza mediante el etiquetado con una marca única y luego vuelven a su recogida en el tiempo y en el espacio para determinar sus capacidades de dispersión. Además de las etiquetas físicas reales, como el polvo o pintura de color, varios tipos de proteínas han demostrado ser muy eficaz para el marcado de los artrópodos para la investigación ecológica. Las proteínas se pueden administrar internamente y / o externamente. Las proteínas pueden entonces ser detectados en los artrópodos recapturados con un ensayo ligado a enzimas específico de la proteína de inmunoabsorción (ELISA). Aquí se describen los protocolos para la externa como internamente etiquetado artrópodos con la proteína. Dos ejemplos experimentales sencillos se demuestran: (1) una marca de proteína interna presenten a un insecto, proporcionando una dieta enriquecida con proteínas y (2) una marca de proteína externa tópicamente unpplied a un insecto usando un nebulizador médico. A continuación relacionamos una guía paso a paso del sándwich y métodos indirectos de ELISA utilizados para detectar signos de proteínas en los insectos. En esta demostración, se discuten diversos aspectos de la adquisición y la detección de marcadores de proteínas en los artrópodos para la marca de liberación y recaptura, marca de captura, y los tipos de auto-marca-captura de la investigación, junto con las diversas formas en que el procedimiento inmunomarcaje ha sido adaptado para adaptarse a una amplia variedad de objetivos de investigación.
Introducción
Seguimiento de los movimientos de plagas de artrópodos, enemigos naturales (parasitoides y depredadores), y polinizadores en la naturaleza es esencial para comprender mejor la manera de mejorar los servicios de los ecosistemas. El componente clave para la mayoría de tipos de investigación dispersión está teniendo un método fiable para etiquetar el artrópodo (s) de interés. Una variedad de materiales (por ejemplo, pinturas, tintes, polvos de colores, etiquetas, elementos raros, proteínas) se han utilizado para marcar los artrópodos para evaluar su dinámica poblacional, la capacidad de dispersión, la alimentación de comportamientos y otras interacciones ecológ....
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Protocolo
1. Marque Interna, Retención y Procedimiento de Detección
- Procedimiento de marcación interna
- Recoge los insectos de interés (n ≈ 100 individuos) de una colonia de laboratorio criados con una dieta artificial o desde el campo y se dividen en dos contenedores de cría limpias.
- Coloque un paquete regular de 20 ml de dieta (tratamiento control negativo sin marcar) en uno de los contenedores. Suplemento de un segundo paquete de 20 ml artificial dieta con 1,0 ml de una solución de 1,0 mg / ml de IgG de pollo / IgY, mezclar bien, y colocarlo en otro recipiente.
Nota: Si el insecto de interés no tiene una dieta artificial, la marc....
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Resultados
Marcado interno:
Los resultados de la prueba de retención marca interna se muestran en la Figura 2A. El valor umbral crítico ELISA calculado era 0.054. En general (en todas las cuatro fechas muestra combinada), los insectos tratados sin proteínas dieron valores constantemente bajos de ELISA (x = 0,038 ± 0,002, n = 80). Por el contrario, todos los insectos alimentados con la dieta enri.......
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Discusión
El procedimiento inmunomarcaje proteína artrópodos fue descrita por primera vez casi un cuarto de siglo atrás 9. Desde entonces, el procedimiento se ha adaptado para estudiar los patrones de dispersión de una amplia variedad de artrópodos utilizando administrados tanto interna como externamente IgG / IgY. Estas proteínas han demostrado marcadores firmes para la amplia variedad de especies de insectos ensayadas hasta el momento. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, la principal limitación para el uso d.......
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Divulgaciones
La mención de nombres comerciales o productos comerciales en esta publicación es únicamente con el propósito de proporcionar información específica y no implica recomendación ni aprobación por el Departamento de Agricultura de Estados Unidos. USDA es un proveedor de igualdad de oportunidades.
Agradecimientos
El financiamiento fue proporcionado por el USDA CRIS 5347-22620-021-00D y, en parte, por la Agricultura y la Alimentación de Investigación Iniciativa Competitiva subvención no. 2011-67009-30141 del Instituto Nacional del USDA de la Agricultura y la Alimentación. Estamos muy agradecidos por el apoyo técnico de Johanna Nassif. También queremos agradecer a Paul Baker, David Horton, Diego Nieto, y Frances Sivakoff para proporcionar algunas de las imágenes utilizadas en la Figura 3.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Contenedor de almacenamiento de alimentos (para la cría de insectos) | Rubbermaid/Tupperware | Varios tamaños | Varios fabricantes y proveedores. La tela de malla se pega en una ventana |
| Nebulizador de pequeño volumen (Micro Mist) | Teleflex-Hudson RCI | 1881 | Disponible en línea y en tiendas de suministros médicos. Otras marcas también funcionarán. |
| Tubos de microcentrífuga, 1,6 ml con tapa | Productos de laboratorio Continental | 4445.X | Cualquier tipo similar funcionará. Preferimos marcas que tengan tapas fáciles de abrir. |
| Caja de almacenamiento de espuma de poliestireno para tubos de microcentrífuga (rejilla de 5x20) | RPI Corp. | 145746 | Este diseño es agradable porque no abarrota los tubos. |
| Dispensador, repetidor | Eppendorf | 4982000322 | Cualquier cosa similar ayudará a acelerar la dispensación. |
| Majas, molinillos de papel desechables de plástico, 1,5 ml | Kimble Chase | 749521-1500 | Disponible con varios proveedores. Los morteros se pueden limpiar y esterilizar en autoclave para su reutilización. |
| Placas BD Falcon ELISA, 96 pocillos (fondo plano) | Pipeta BD | 351172 | |
| Ovation, manual (20-200 y micro; l) | VistaLab | 1057-0200 o 1070-0200 | Cualquier tipo similar funcionará. Este modelo es ergonómico. |
| Depósitos, reactivo estéril | VistaLab | 4054-1000 | Cualquier cosa similar funcionará. |
| Pipeta electrónica, 8 canales (50-1.200 y micro; l) (Biohit eLine) | Sartorius | 730391 | Si tuvieras que elegir un modelo electrónico, este tamaño es el más útil. |
| Pipeta electrónica, 8 canales (10-300 y micro; l) (Biohit eLine) | Sartorius | 730361 | Cualquier cosa similar funcionará. |
| Colector, arandela de placas multipocillo (8 posiciones, recta) | Sigma-Aldrich | Z369802 | Cualquier cosa similar funcionará para el lavado manual de platos. |
| Lector de microplacas con detección de absorbancia | Molecular Devices | SpectraMax 250 | Cualquier cosa similar funcionará. |
| Pollo IgG/IgY | Estados Unidos Biológico | I1903-15R | También disponible en otras fuentes |
| Claras de huevo | Tienda de comestibles | " Todos los blancos", " Batidores de huevos", etc. | Mezcle 5 ml con 95 ml dH2O para solución al 5% |
| Tris (Trizma Base) | Sigma-Aldrich | T1503 | 2.42 g/L para hacer TBS |
| Cloruro de sodio (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | 29.22 g/L para hacer TBS y 8.0 g/ L para PBS |
| Fosfato de sodio dibásico (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S0876 | 1,14 g/L para PBS |
| Fosfato de potasio monobásico (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | 0,2 g/L para PBS |
| Cloruro de potasio (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | 0,2 g/L para PBS |
| Tween 20, Grado EIA | Sigma-Aldrich | P1379 | Agregue 0,5 ml por L al PBS después de que se disuelvan las sales. |
| PBS con 1% BSA | Sigma-Aldrich | P3688 | Mix 1 paquete en 1 L dH2O |
| Anti-Chicken IgY (IgG) (molécula entera) anticuerpo producido en conejo (1:500) | Sigma-Aldrich | C6409 | Mix 100 µ l en 50 ml de |
| leche en polvo o fresca TBS (1%) | Tienda de comestibles | Mezcla 10 g con 1 L dH2O para solución al 1% | |
| Anti-pollo IgY (IgG) (molécula entera)-Anticuerpo peroxidasa producido en conejo (1:10.000) | Sigma-Aldrich | A9046 | Mix 100 µ l en 1 L de leche al 1% Anticuerpo |
| anti-albúmina de huevo de gallina producido en conejo (1:8.000) | Sigma-Aldrich | C6534 | Diluido 125 µ l en 1 L PBS-BSA |
| Cabra Anti-Conejo IgG Peroxidasa Conjugado (1:2.000) | Sigma-Aldrich | A6154 | Diluir 0,5 ml en 1 L PBS-BSA, luego añadir 1,3 ml Silwet |
| Vac-In-Stuff (Silwet L-77) copolímero de silicio-poliéter | Lehle Seeds | VIS-01 | Añadir como último ingrediente |
| TMB Microwell Sustrato de peroxidasa de un componente | SurModics | TMBW-1000-01 |
Referencias
- Hagler, J. R., Jackson, C. G. Methods for marking insects: Current techniques and future prospects. Annu. Rev. Entomol. 46, 511-543 (2001).
- Lavandero, B. I., Wratten, S. E., Hagler, J. R., Jervis, M. A. The need for....
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Reimpresiones y permisos
