Síntesis de termogelificante poli (N-isopropilacrilamida) compuestos de sulfato de condroitina-injertado con alginato micropartículas de Ingeniería de Tejidos

Resumen

Un andamio de la ingeniería de tejidos inyectable compuesto de poli (N-isopropilacrilamida) sulfato de condroitina-injertado (PNIPAAm-g-CS) que contienen micropartículas de alginato se preparó. La fuerza adhesiva, propiedades de hinchamiento y en la biocompatibilidad in vitro se analizaron en este estudio. Las técnicas de caracterización desarrolladas aquí pueden ser aplicables a otros sistemas de termogelificación.

Resumen

Biomateriales inyectables se definen como materiales implantables que se pueden introducir en el cuerpo como un líquido y se solidifican in situ. Tales materiales ofrecen las ventajas clínicas de ser implantado mínimamente invasiva formando y fácilmente sólidos que llenan el espacio en defectos de forma irregular. biomateriales inyectables han sido ampliamente investigado como andamios para la ingeniería de tejidos. Sin embargo, para la reparación de ciertas áreas de soporte de carga en el cuerpo, tales como el disco intervertebral, andamios deben poseer propiedades adhesivas. Esto minimizará el riesgo de dislocación durante el movimiento y asegurar un contacto íntimo con el tejido circundante, proporcionando la transmisión adecuada de las fuerzas. Aquí, se describe la preparación y caracterización de un andamio compuesto de poli térmicamente sensible (N-isopropilacrilamida) sulfato de condroitina-injertado (PNIPAAm-g-CS) y micropartículas de alginato. El copolímero PNIPAAm-g-CS forma una solución viscosa en agua a temperatura ambiente, en el que alginatpartículas e se suspenden para mejorar la adherencia. Por encima de la temperatura de solución crítica inferior (LCST), alrededor de 30 ° C, el copolímero forma un gel sólido alrededor de las micropartículas. Hemos adaptado procedimientos biomateriales de caracterización de tener en cuenta la transición de fase reversible de PNIPAAm-g-CS. Los resultados indican que la incorporación de partículas de alginato / ml 50 o 75 mg en 5% (w / v) soluciones PNIPAAm-g-CS cuadruplicar la resistencia a la tracción adhesiva de PNIPAAm-GCS sola (p <0,05). La incorporación de micropartículas de alginato también aumenta significativamente la capacidad de hinchamiento de PNIPAAm-g-CS (p <0,05), lo que ayuda a mantener un gel llena espacios dentro de los defectos del tejido. Por último, los resultados de la vitro kit de ensayo en toxicología, 2,3-bis- (2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil) 2H-tetrazolio-5-carboxanilida (XTT) y ensayo de viabilidad Live / Dead indican que la adhesivo es capaz de soportar la supervivencia y la proliferación de encapsulado de riñón embrionario humano (HEK) 293 cells más de 5 días.

Introducción

Biomateriales inyectables son aquellos que pueden ser convenientemente presentadas en el cuerpo como un líquido y solidificar in situ. Tales materiales se han aplicado ampliamente en la medicina regenerativa, en el que se utilizan para entregar células encapsuladas para el sitio afectado ^1-4 y actuar como una matriz extracelular provisional en tres dimensiones para las células ^5. Para el paciente, biomateriales inyectables son ventajosas debido a que los procedimientos quirúrgicos para la implantación son mínimamente invasivos y la fase sólida puede llenar de forma irregular defectos de los tejidos, eliminando la necesidad de implantes ....

Protocolo

1. El poli (N-isopropilacrilamida) -g-sulfato de condroitina Síntesis

1. Antes de la síntesis del hidrogel bioadhesiva, purificar N-isopropilacrilamida (NIPAAm) monómero y el sulfato de condroitina metacrilato (CS).
   1. Pesar al menos 10 g de NIPAAm y disolver el monómero en 400 ml de n-hexano a 60 ° C. Se agita el recipiente periódicamente hasta disolución completa. Se recristaliza la solución en un congelador C -20 ° durante 24 hr.
   2. Retire el monómero se cristalizó en el filtro de recipiente y de vacío el n-hexano usando un embudo Buchner. Coloque el monómero en un horno de vacío a TA durante 24 horas para eliminar cualquier n-hexano restante.....

Resultados

Un co-polímero injertado térmicamente sensible se sintetizó con éxito y se caracteriza por su fuerza bioadhesiva, propiedades de hinchamiento, y en citocompatibilidad vitro. Elegimos para investigar alginato debido a sus propiedades mucoadhesivas bien establecidos. Las micropartículas de alginato, con un diámetro promedio de 59,7 ± 14,9 micras, se mezclaron con 5% (w / v) PNIPAAm-g-CS a concentraciones de 25, 50, y 75 mg / ml. Estas concentraciones se basan en un medio,.......

Discusión

Hay varios pasos críticos en la síntesis del compuesto de micropartículas de hidrogel y evaluar su fuerza adhesiva, la capacidad y la biocompatibilidad celular hinchazón. polimerización por radicales libres de PNIPAAm-g-CS requiere metacrilación exitosa de sulfato de condroitina, la disolución completa de los componentes de monómero, y las condiciones de reacción libre de oxígeno. La relación de monómero a NIPAAm sulfato de condroitina metacrilado en la mezcla de reacción fue elegido porque se ha demostrado, en nuestro .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
N-isopropilacrilamida, 99%, pura, estabilizada	Acros Organics	2210-25-5	Refrigere y retire el estabilizador con hexano
Sulfato de condroitina A sal de sodio (de la tráquea bovina)	Sigma-Aldrich	39455-18-0	Refrigere
Hexanos	Fisher Scientific	H302-4	Almacene en un gabinete inflamable
50% (p/p) de hidróxido de sodio	Fisher Scientific	SS254-1	Cáustico de naturaleza
Dióxido de metal Anhídrido	Sigma-Aldrich	276685	Humos fuertes; uso en una campana extractora
Acetona	Fisher Scientific	A18-4	Enfriar en un refrigerador antes de usar
Gas	Praxair	7727-37-9 Número de	pieza: NI 4.8, estilo cilindro T, 99.998% de nitrógeno puro (el argón se puede usar como gas inerte alternativo)
Tetrametiletilendiamina, 99% extra puro	Acros Organics	110-18-9
Persulfato de amonio	Sigma Aldrich	A3678	Higroscópico y se degrada en presencia de agua
Tabletas de solución salina tamponada con fosfato	Fisher Scientific	BP2944	Mantener seco
Ácido algínico, sal de sodio	Acros Organics	177775000	Use calor para ayudar a disolver
Cloruro de calcio dihidratado	Fisher Scientific	C79
Aceite de canola	Tienda		Obtener de una tienda local
Tween 20	Sigma-Aldrich	93773
70% (v/v) Isopropoanol	Fisher Scientific	A416-4
Orejas porcinas	Haine's Pork Shop		Obtener de un carnicero local
Cloruro de sodio	Fisher Scientific	S271-3
Riñón embrionario humano 293 células	ATCC	ATCC CRL-1573	Almacenar en nitrógeno líquido para uso a largo plazo
DMEM: 1x, glucosa alta, sin piruvato	Life Technologies	11965126	Refrigerar
suero fetal bovino	Life Technologies	10082-147	Refrigerar
Penn Strep: 10,000 U/ml	Life Technologies	15140-122
Refrigerar tripsina-EDTA: 0,5%, 10x	Life Technologies	15400-054	Refrigerar
metanol	VWR	AAA44571-K7
Kit de viabilidad de células vivas/muertas	Life Technologies	L3224	Sensible a la luz, mantener congelado
Kit de viabilidad de células XTT	Sigma Aldrich	TOX2-1KT	Sensible a la luz, mantener congelado
DMEM transparente: 1x, glucosa alta, sin fenol	Life Technologies	21063-029	Refrigerar
el PBS de Dulbecco: 1x	Life Technologies		14190136 Refrigerar
Citrato de sodio	EMD	SX0445-1
Pipeta de desplazamiento positivo	BrandTech Scientific, INC	2702904	Dispensa 100 - 500 µ l y viene con puntas acoplables
n.º 3. Mango de bisturí de acero inoxidable	Sigma Aldrich	S2896
Miltex cuchillas quirúrgicas estériles	Fisher Scientific	12-460-440	Tamaño 10
Homogeneizador de gemas de potencia	Fisher Scientific	08-451-660	Modelo # 125
Mortero de porcelana	Sigma Aldrich	Z247464	Sostiene 50 ml
FreeZone 1 L sistema de liofilización de sobremesa	Labconco	7740020	Congele las muestras antes de usarlas
Bomba de paletas rotativas sellada con aceite	Edwards	A65301906	Modelo # RV5
Agitador orbital de incubación	VWR	12620-946	Modelo # 980153
Centrífuga refrigerada de sobremesa	Forma Scientific, INC		Modelo # 5682
Hornos calefactados	VWR		Modelo # 1235PC
2 N dinamómetro	Shimpo	FGV-0.5XY	Modelo # FGV-0.5XY
Banco de pruebas de fuerza eléctrica	Shimpo	FGS-200PV	Modelo # FGS-200PV
Centrífuga de cubo oscilante para cultivo de tejidos	Beckman Coulter	366830	Modelo #6S-6KR
Microcentrífuga para cultivo de tejidos	Eppendorf		Modelo #5415C
Juego de hematocitómetros	Hausser Scientific	3720	Requiere vidrio de cubierta de repuesto deslizamientos
Calentador de portaobjetos	Lab Scientific	XH-2022	Modelo # XH-2002
Lámpara de calefacción portátil	Underwriters Laboratories		Ayuda a mantener la temperatura del polímero a 37 & grados; C
Microscopio fluorescente invertido	Zeiss		Modelo Axiovert 25 CFL
Baño de agua caliente	VWR		Modelo # 1235PC
Plataforma oscilante	VWR		Serie 100
Multiskan FC Lector de placas de microtitulación	Thermo Scientific		Tipo 357
Incubadora de cultivos celulares	VWR		Modelo # 2350T
Purificador cabina de bioseguridad clase II	Labconco		Delta Series

nitrógeno local