Alta resolución Cuantificación de celulosa cristalina acumulación en Arabidopsis Las raíces para monitorear la célula específica de tejido de pared Modificaciones

Summary

La celulosa cristalina es un componente importante de la pared celular de la planta. Sin embargo, su cuantificación a una resolución celular es técnicamente desafiante. Aquí, reportamos el uso de la tecnología de luz polarizada y secciones transversales de raíces para obtener información de la composición de la pared celular a una resolución espacio-temporal.

Abstract

Las células vegetales están rodeadas por una pared celular, cuya composición determina su tamaño y forma finales. La pared celular está compuesta por una matriz compleja que contiene polisacáridos que incluyen microfibrillas de celulosa que forman tanto estructuras cristalinas como cadenas de celulosa de organización amorfa. La orientación de las fibras de celulosa y sus concentraciones dictan las propiedades mecánicas de la célula. Se utilizan varios métodos para determinar los niveles de celulosa cristalina, cada uno de los cuales aporta ventajas y limitaciones. Algunos pueden distinguir la proporción de regiones cristalinas dentro de la celulosa total. Sin embargo, se limitan a análisis de órganos completos que son deficientes en información espacio-temporal. Otros, que dependen de imágenes en vivo, están limitados por el uso de tintes imprecisos. Aquí, reportamos un sistema sensible basado en luz polarizada para la cuantificación específica de la retardancia relativa de luz, que representa la acumulación de celulosa cristalina en secciones transversales de raíces de Arabidopsis thaliana. En este método, la resolución celular y los datos anatómicos se mantienen, lo que permite comparaciones directas entre los diferentes tejidos que componen la raíz en crecimiento. Este enfoque abre una nueva dimensión analítica, arrojando luz sobre el vínculo entre la composición de la pared celular, el comportamiento celular y el crecimiento de todo el órgano.

Introduction

La pared celular vegetal es una estructura dinámica. las células que crecen están rodeados por una pared celular primaria, la organización de la que permite que las células se expanden. Las células que dejan de crecer depósito una pared secundaria más rígido que mejora el soporte mecánico de la planta. Ambas paredes celulares están compuestas de microfibrillas de celulosa incrustadas en una matriz de polisacáridos de diferentes estructuras (por ejemplo, hemicelulosa y pectina) que varían en los diferentes tejidos etapa de desarrollo y ^1,2. La celulosa se sintetiza como cadenas de (1,4) -β-D-glucano que están estrechamente alineadas para formar la microfibrillas de una estructura cristalina. celulosa amorfa se refiere a las regiones en las que las cadenas de glucano están menos ordenadas. La relación entre el cristalino y los dominios amorfos es un parámetro cree que afecta a las propiedades mecánicas de la pared celular, proporcionando resistencia mecánica y característica viscoelástica, respectivamente ^3. Varios métodos han sidodesarrollado para detectar y cuantificar las dos formas de disposición de celulosa, entre ellos de difracción de rayos X y polarización cruzada / ángulo mágico de giro de RMN de estado sólido ^4. Difracción de rayos X se puede usar para determinar la proporción de cristalino frente a dominios celulosa amorfa en la muestra ^5. Un método alternativo utiliza fraccionamiento del contenido de la pared celular en el material ácido insoluble y soluble en ácido, para distinguir entre el cristalino y celulosa amorfa u otros polímeros, respectivamente. En este enfoque, la incorporación de glucosa marcada ^([14 C] glucosa) se utiliza para cuantificar el ^6,7 celulosa. Estos métodos requieren grandes volúmenes de material de la planta para los análisis de órganos enteros, en el mejor, y por lo tanto, son insuficientemente sensibles a la variación específica de tejido en la estructura de la pared celular. Visualización de microfibrillas de celulosa en una resolución celular se puede lograr en los estudios de imagen en vivo en combinación con colorantes fluorescentes ^8,9, que puede identificar cambios enla orientación de las microfibrillas de celulosa. Sin embargo, estos tintes no son utilizados para la cuantificación, que no son específicos de celulosa cristalina y pueden interferir con la estructura normal de la pared celular ^8. Polscope es una técnica que se basa en la capacidad de celulosa cristalina para dividir los rayos de luz y retardar parte de la luz ^10. retraso de luz es más fuerte para microfibrillas que se encuentran perpendicularmente a la dirección de propagación de la luz. Para microfibrillas con orientación similar, cuanto mayor sea el grado de cristalinidad, mayor será el retardo de la luz ^11. Por lo tanto, polscope se utiliza para estudiar tanto los niveles relativos y la orientación de las microfibrillas de celulosa.

Roots exhiben crecimiento lineal, durante el cual las células se origina en el nicho de células madre, en la punta de la raíz, someterse a una serie de divisiones celulares, antes de que rápidamente se expanden ^12. Las células que comprenden la raíz se expanden en un unidireccional (anisotrópica)forma, según lo dictado por pequeñas moléculas de señalización de hormonas que afectan a las propiedades de la pared celular ^13. Respuestas diferenciales a las hormonas, en tiempo y espacio, proporcionan un medio para asegurar el crecimiento equilibrado de órganos ^14. Por lo tanto, el análisis de alta resolución de la estructura de la pared celular puede proporcionar información importante necesaria para entender mejor la conexión entre las respuestas de tipo específico de células para el crecimiento de órganos conjunto. Aquí, se presenta la implementación de polscope para estudiar la acumulación específica de tejido de celulosa cristalina en las raíces de Arabidopsis, como se observa en las secciones anatómicas de alta calidad. Este método no cubierto recientemente específica del tipo celular acumulación de celulosa cristalina en respuesta a la perturbación espacial de la actividad hormonal ^15.

Protocol

1. Crecimiento de las Plantas

1. Superficie esterilizar semillas.
   1. Esterilizar semillas (hasta 30 mg) por el método húmedo o seco. Como ejemplo, para el método de esterilización en seco, añadir 1 ml glacial HCl 37% en 50 ml de lejía, en un vaso de vidrio en un desecador cerrado durante al menos 4 horas y hasta durante la noche. Realice este paso en una campana química.
2. Esparcir las semillas estériles en placas con agar planta de 0,8% en 0.5x Murashige y Skoog (MS). Envolver las placas con Parafilm o cinta porosa y cubrir con papel de aluminio.
3. Almacenar las placas a 4 ° C durante 1 - 4 días para promover la germinación uniforme.
4. La transferencia de las placas a una cámara de crecimiento adecuado para el cultivo de plantas de semillero de Arabidopsis. Colocar las placas verticalmente para mantener el crecimiento de la raíz en la parte superior del medio de agar y para evitar la penetración.
5. plántulas de transferencia de fijador de 7 días después de la germinación (DAG).

2. Fijación

1. Preparar 50 ml Richardson Solution combinando volúmenes iguales de bórax al 1% (agente tampón), 1% y azul de metileno al 1% Azure (colorantes histológicos) en agua doblemente destilada. Se filtra a través de una jeringa Driven 0,22 micras Unidad de PVDF filtro antes de su uso.
2. Preparar 50 ml de fijador: 1,25% de glutaraldehído en cacodilato de sodio 0,05 M (agente tampón).
   Nota: Estos materiales son tóxicos y deben manejarse en una campana química.
3. Añadir 100 l de solución de Richardson (véase 2.1) a la solución de fijación (véase 2.2) para obtener la solución de fijación final.
4. Marque cada pocillo de una placa de 6 pocillos con el nombre de la muestra correspondiente.
5. Coloque 2 - 3 ml de solución de fijación final (véase 2.3) en los pocillos, de modo que las plantas de semillero, una vez transferidos, serán íntegramente en el líquido.
6. Transferir cuidadosamente, utilizando pinzas, hasta 10 plantas de semillero a cada pocillo. Sellar las placas utilizando Parafilm. Almacenar a 4 ° C, en la oscuridad, por lo menos durante una noche, y hasta una semana.

3. La deshidratación

1. Deshidratar plántulas. Transferirlos entre pozos de nuevas placas de 6 pocillos, que contiene concentraciones crecientes de etanol, que se enumeran aquí: 10% de etanol durante 15 min; 30% de etanol durante 15 min; 50% de etanol durante 15 min; 70% de etanol durante 15 min; 85% de etanol durante 15 min; 95% de etanol durante 15 min; 95% de etanol a 4 ° C, durante la noche, como mínimo. Manejar plántulas agarrando cuidadosamente por sus cotiledones, preferible con unas pinzas de plástico.

4. infiltración

1. Preparar medio de infiltración. Mezclar el contenido de la bolsa 1 del activador del kit Historesin con 50 kit líquido de resina básica ml en una pequeña botella de vidrio. Agitar con el imán durante 20 minutos. medio de la infiltración puede mantenerse a 4 ° C durante unas semanas.
2. Marcar cada pocillo de una nueva placa de 6 pocillos con el nombre de la muestra correspondiente y se llenan de 2 - 3 ml de medio de infiltración.
3. Transferencia de las plántulas de la solución de etanol al 95% al ​​medio de infiltración usando fórceps. Asegúrese de que las plántulas son fuLLY cubierto por el medio.
4. Almacenar a 4 ° C durante al menos 4 días, para asegurar la máxima penetración en los tejidos de la planta.

5. Bloque de Preparación

1. Coloque pequeñas etiquetas, lápiz, marcado con el nombre de la muestra, dentro de cada pocillo de la incrustación de moldes.
2. Preparar el medio de inclusión mediante la adición de endurecedor 1 ml a 15 ml de medio de infiltración (véase 4.1). No intente preparar un menor volumen de 15 ml, para evitar problemas de polimerización.
3. Llene la mitad de cada pocillo en el molde con 200 l medio de inclusión y cubrir con una pieza de película encima de la cabeza de corte a la forma del molde, pero a un tamaño de 1 mm más grande en cada lado. Incubar a temperatura ambiente durante al menos 2 horas, para permitir la polimerización. No exceda de 5 horas.
4. Preparar un lote adicional de medio de inclusión (véase 5.2) y mantener en hielo, para evitar la polimerización mientras puntas de las raíces están dispuestos en el molde.
5. Cortar cada punta de la raíz bajo un microscopio de disección usando bisturí y posicionar con mucho cuidado it: verticalmente para las secciones transversales u horizontalmente para la sección longitudinal, en alrededor de 2 - 3 mm desde la periferia del molde. Llenar el molde por completo con la solución y la tapa de bloqueo con una película por encima. Tenga en cuenta que la solución de bloqueo se reducirá ligeramente una vez que se polimeriza.
6. Mantener a temperatura ambiente durante 2 horas, como mínimo.
7. Para secar los bloques, colocar en una caja con gel de sílice seca y dejar a temperatura ambiente durante la noche, como mínimo.

6. Seccionamiento

1. Preparar cuchillas de vidrio a partir de varillas de vidrio con un fabricante de cuchillos. Utilice las cuchillas de vidrio para seccionar los tejidos. Cortar la varilla de vidrio en un cuadrado y luego se corta en diagonal la plaza para producir dos cuchillos, utilizando una herramienta de puntuación de diamantes.
2. Bloqueo de los tramos en 2 - 3 micras rodajas de ancho, utilizando una máquina de corte. Coloque las rebanadas sobre un portaobjetos de vidrio, en la parte superior de las gotas de agua destilada y colocar la placa en un bloque de calor ajustado a fuego lento (50 - 60 ° C), hasta que el agua se evapora.

7. Preparación para deslizar polarizada Microscopio

1. Diluir solución Richardson (ver 2.1) a 0.2% de la solución original y el uso de 1 ml de la misma para cubrir las rebanadas. Colocar en el bloque de calor durante 5 segundos y luego lavar con agua destilada.
2. Secar el portaobjetos en una placa caliente. Observe bajo un microscopio de disección y marcar la parte de atrás de la corredera con un marcador, para indicar la posición de las rebanadas de interés, para facilitar su posterior identificación en el microscopio.
3. Añadir 100 l de medio de montaje y cubierta con una hoja de la cubierta.

8. Adquisición de imágenes

1. Colocar el portaobjetos cubierto que contiene las secciones de raíces bajo un microscopio de luz equipado con sistema de Polscope adecuado para obtener información de retardancia y un filtro polarizador / interferencia óptica (Figura 1 AD).
2. Seleccionar ampliación que permite una visualización clara de toda la muestra (por ejemplo, 40X en este estudio) y enfocar la microscope en un campo vacío que contiene sección de bloque, pero ninguna sección de la raíz. Tratar de encontrar una región limpia, sin manchas. Utilice esta región para establecer el fondo.
3. Ajuste el sistema de formación de imágenes y parámetros del software: Rango de Ajuste a 17 nm. Aplicar "exposición automática" y obtener una imagen de fondo del campo vacío (véase 8.2). Una imagen de fondo se utiliza por experimento.

9. Análisis Polscope de celulosa microfibrillas Orientación

1. El análisis de secciones longitudinales.
   1. Colocar un portaobjetos que contiene secciones longitudinales bajo el microscopio y obtener una imagen de retardancia de la misma. Enfocar el microscopio en una sección de la raíz de interés. Proporcionar un nuevo nombre de archivo.
   2. Capturar una imagen abrio (imagen con información de retraso) a través de la ventana "Live Abrio". Asegúrese de capturar una sección que incluye la pared celular, que puede ser identificado por la celulosa manchada corriendo a lo largo de la periferia de la célula, como se muestra en la Figura 2C.
2. Análisis de imagen.
   1. Haga doble clic en la imagen correspondiente en la pila de imagen. Seleccione "Color de Orientación Pseudo" en la pestaña "Configuración de pantalla".
   2. Para estimar el ángulo de microfibrillas de celulosa, juego con el color correspondiente de la pared celular a la de la rueda de color.
      NOTA: La rueda de color en la figura 2C refleja el eje lento de la luz situada a lo largo del microfibrillas que indica la dirección a lo largo del eje longitudinal de las microfibrillas. El ángulo de microfibrillas de celulosa es el ángulo indicado por el color y el eje longitudinal de la célula. Por ejemplo, la célula de alargamiento en el recuadro muestra de color cian, inclinado aproximadamente 90 ° con respecto al eje longitudinal de las células.
   3. Para cuantificar el ángulo medio de microfibrillas en la pared celular, utilizar la herramienta de "retardo de acimut y sello" de la barra de herramientas del software. Durante la selección de la herramienta, apuntar y hacer clic en la región de interés en la imagen obtenida.
      NOTA: Este Will resultado en la pantalla de los ángulos (azimut) en grados (Figura 2C).
   4. En un acceso abierto y el software de análisis de imágenes de luz polarizada alternativa, el almuerzo plug-in "Pol-Analizador" en el menú de plugins. En la nueva ventana que se abre, seleccione la ficha "birrefringencia" y abra y guarde el archivo de fondo y el archivo de imagen.
   5. En la ventana de la imagen, seleccione "Especificaciones". y ajustar el "tamaño de píxel de ROI (uso de 5 píxeles para este estudio). En el "Especificaciones". ventana, seleccione "valores muestran en Tabla de resultados".
   6. Usar la herramienta Polígono para marcar la región de interés en la ventana de imagen. Seleccione "líneas de orientación" para obtener la orientación de la microfibrillas de celulosa.
      NOTA: Esto dará lugar a la visualización de los ángulos (azimut) en grados.
      NOTA: El ángulo promedio calculado por uno de los dos métodos se debe entonces normalizó a la colocación de la sección de la raíz a lo largo de la corredera. Para corregir la desviación deel posicionamiento horizontal de toda la sección de la raíz a lo largo de la corredera, cuantificar el ángulo medio de microfibrillas de la pared celular que flanquean la célula a lo largo de su eje largo (es decir, perpendicular a la sección y a lo largo del eje de crecimiento de la raíz, la Figura 2C). Este ángulo es de 180 °, cuando la sección de la raíz se posiciona con precisión a lo largo de la corredera. Para el cálculo del ángulo de microfibrillas, restar el ángulo de microfibrillas medio medido de la pared celular de flanqueo a partir de 180 °. Añadir la diferencia dado lugar al ángulo de microfibrillas media medida de la pared celular que se encuentra plana en la diapositiva.

10. Análisis Polscope de celulosa cristalina Acumulación

1. Utilice las secciones transversales (cross). Tenga en cuenta que la acumulación de celulosa cristalina sólo puede compararse entre las células cuando sus microfibrillas de celulosa están alineados en un ángulo similar (como se determina en 9).
2. Haga doble clic en la imagen correspondiente en la pila de imagen. Seleccione "PSeudo de color "en la pestaña" Configuración de pantalla ".
3. Para medir el retardo de la. Zoom en la imagen. Seleccione "Región" y marcar todas las regiones de interés. Mover a la pestaña "medidas" y "Copiar al portapapeles" todos los valores.
   1. Transferir los datos a Excel y extraer la información requerida (media de retraso de la región). Normalizar los datos.
      NOTA: Para tener en cuenta las diferencias de espesor entre las rebanadas, expresa los valores relativos a un borde de la pared celular específico en la diapositiva. Para normalizar, dividir el retardo de la media correspondiente a la pared de célula de interés por el retardo de la media de una pared celular diferente en la misma imagen. Por ejemplo, la pared celular epidérmica exterior se normalizó a la pared celular cortical interior en nuestro estudio.
4. Repetir las mediciones para al menos 3 secciones por la raíz, con un mínimo de 3 raíces por muestra.

Results

Se estudia el impacto de las respuestas específicas del tipo de células a los brasinoesteroides (BRS), el uso de la raíz de Arabidopsis como modelo de órganos ^15-17. Cuando el receptor BRI1 BR está dirigido, en el fondo de mutante bri1, a un subconjunto de células de la epidermis llamadas células no pelo (Figura 2A, B), que inhibe la expansión de células unidireccional de células vecinas, y el crecimiento conjunto de la raíz ^15. an...

Discussion

A continuación, presentamos un método para la determinación de la acumulación de celulosa cristalina en los diferentes tejidos que componen las raíces de Arabidopsis, mientras que el mantenimiento de información anatómica. Como tal, proporciona un paso adicional hacia la comprensión de los procesos de crecimiento de las plantas con resolución celular. Este método también se puede aplicar para el estudio de especies y órganos de las plantas adicionales.

Un número de puntos debe ser c...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Murashige & Skoog (MS)	Duchefa	M0221
Bórax	LOBA CHEMIE	6038
Azul de metileno	Sigma	M-9140
Azure	Sigma	861065
Jeringa Accionado por Filtro PVDF de 0,22 mm	MILLEX-GV
Glutaraldehído	EMS	16220
Cacodilato de Sodio	Sigma	C-0250
Leica kit historesin	Leica	7022 18 500
moldes de incrustación	Agar Scientific	AGG3530
film 100 µ P.P.C.			película de techo
Knivemaker	LKB	7800
Ultratome III	LKB	8800	Ultratome
Shandon immumount
Microscopio de luz	Nikon	Eclipse 80i
Sistema de imagen Abrio	CRI	Abrio Software
Abrio V2.2		CRI	Abrio V2.2
Software de análisis de imágenes de luz polarizada de acceso abierto	OPS	OpenPolScope	http://www.openpolscope.org/