Este trabajo presenta un protocolo para el manejo de líquidos y de introducción de muestra a un microcanal para in situ de iones secundarios análisis de espectrometría de masas de tiempo de vuelo de biomoléculas de proteínas en una solución acuosa.
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Artículo de método
In Situ caracterización de proteínas hidratadas en agua por Salvi y TOF-SIMS
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
Este trabajo demuestra la caracterización in situ de biomoléculas de proteínas en la solución acuosa utilizando el Sistema de Análisis de la interfaz de líquido de vacío (SALVI) y espectrometría de masas de tiempo de vuelo de iones secundarios (SIMS-TOF). La película de proteína fibronectina se inmoviliza sobre la membrana de nitruro de silicio (SiN) que forma el área de detección SALVI. Durante el análisis ToF-SIMS, se llevaron a cabo tres modos de análisis que incluye alta espectrometría de masas de alta resolución espacial, las imágenes de dos dimensiones (2D), y perfiles de profundidad. Los espectros de masas se adquirieron en los modos tanto positivos como negativos. agua desionizada también se analizó como una muestra de referencia. Nuestros resultados muestran que la película de la fibronectina en agua tiene picos de racimo de agua más distintos y más fuertes en comparación con el agua sola. picos característicos de fragmentos de aminoácidos también son observables en la proteína hidratada ToF-SIMS espectros. Estos resultados ilustran que la adsorción molécula de proteína en una superficie puede ser estudiado dynamicaLLY usando Salvi y ToF-SIMS en el medio líquido para la primera vez.
Introducción
La hidratación es crucial para la estructura, conformación 1, 2 y 3 actividad biológica de las proteínas. Las proteínas sin moléculas de agua que rodean ellos no tendrían actividades biológicas viables. En concreto, las moléculas de agua interaccionan con la superficie y la estructura interna de las proteínas, y diferentes estados de hidratación de las proteínas hacen que tales interacciones distinta. 4 La interacción de las proteínas con las superficies sólidas es un fenómeno fundamental con implicaciones en la nanotecnología, biomateriales y procesos de ingeniería de tejidos. Los estudios han indicado durante mucho tiempo....
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Protocolo
1. Limpieza y esterilización del microcanal SALVI
- La esterilización del microcanal en SALVI
- Dibuje 2 ml de solución acuosa al 70% de etanol en una jeringa, conectar la jeringa con el extremo de entrada de SALVI, e inyecte lentamente 1 ml de líquido en 10 min. Retire la jeringa al final de la inyección. A continuación, conecte la entrada y salida de SALVI mediante una unión polieteretercetona (PEEK). Alternativamente, utilizar una bomba de jeringa para llevar a cabo el mismo procedimiento. Por ejemplo, ajustar la velocidad de flujo de 100 l / min.
- Mantenga el microcanal SALVI lleno de solución de etanol al 70% a temperatura ambiente duran....
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Resultados
Un par de resultados representativos se presentan para demostrar las ventajas del protocolo propuesto. Mediante el uso de la interfaz de microfluidos SALVI, el haz de iones primario (Bi 3 +) puede bombardear directamente sobre la película de fibronectina hidratado en agua DI. Por lo tanto la asignación de química molecular de la superficie del líquido puede ser adquirido con éxito.
La Figura
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Discusión
SALVI es una interfaz de microfluidos que permite superficie del líquido dinámico y el análisis de la interfaz líquido-sólido por instrumentos basados en el vacío, como ToF-SIMS y microscopía electrónica de barrido (SEM). Debido al uso de pequeñas aberturas para exponer líquido directamente en el vacío, SALVI es adecuado para muchas técnicas de espectroscopia e imagen finamente enfocada, sin ninguna modificación; 22 la portabilidad y versatilidad de microfluidos que sea una verdadera plataforma de imagen mu.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Estamos agradecidos al fondo LDRD de la Iniciativa de Imágenes Químicas-Investigación y Desarrollo Dirigido por el Laboratorio (CII-LDRD) y a la Iniciativa de Síntesis y Simulación de Materiales a través de Escalas (MS3) por su apoyo. El acceso instrumental se proporcionó a través de una propuesta temática científica del Laboratorio de Ciencias Moleculares Ambientales (EMSL) de W. R. Wiley. EMSL es una instalación nacional de usuarios científicos patrocinada por la Oficina de Investigación Biológica y Ambiental (BER) en PNNL. Los autores agradecen al Sr. Xiao Sui, al Sr. Yuanzhao Ding y a la Sra. Juan Yao por la revisión del manuscrito y sus útiles comentar....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| ToF-SIMS | IONTOF | TOF. Resolución SIMS 5 | : >10.000 m/Δ m para resolución de masa; >4.000 m/Δ m para alta resolución espacial |
| Sistema de Análisis en la Interfaz de Vacío Líquido (SALVI) | Laboratorio Nacional del Noroeste del Pacífico | N/A | SALVI es una herramienta analítica única, autónoma y portátil que, por primera vez, permite que los instrumentos científicos basados en el vacío, como la espectrometría de masas de iones secundarios en el tiempo de vuelo (ToF-SIMS), analicen superficies líquidas en su estado natural a nivel molecular. |
| Unión PEEK | Valco | ZU1TPK | para conectar la entrada y salida de SALVI |
| 5 ejes Etapa de muestra | La etapa IONTOF | N/A | es de fabricación propia para el montaje de SALVI en ToF-SIMS |
| Sistema de purificación de agua nanopura Barnstead | Thermo Fisher Scientific | D11921 | Módulo de filtración de ósmosis inversa ROpure LP (D2716) |
| Jeringa | BD | 309659 | 1 ml |
| Thermo Fisher Scientific | 21-377-821 | Gama: 100 a 1.000 ml | |
| Punta de pipeta | Neptune | 2112.96.BS | 1.000 y micro; l |
| Tubo de centrífuga | Corning | 430791 | 15 ml |
| Fibronectina | Sigma-Aldrich | F1141 | 1 mg/ml |
| Etanol Thermo Fisher Scientific | S25310A 95% Desnaturalizado | ||
| Gibco PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | pH 7.4 |
Referencias
- Tompa, K., Bokor, M., Verebelyi, T., Tompa, P. Water rotation barriers on protein molecular surfaces. Chem. Phys. 448, 15-25 (2015).
- Maruyama, Y., Harano, Y. Does water drive protein folding? Chem. Phys. Lett. 581, 85-90 (2013).
- Chaplin, M.
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Reimpresiones y permisos
